Bestrijding van trips in hyacint door middel van een CATT-behandeling

Transcriptie

1 Kwaliteit hyacint Ontwikkeling van een dipstick-test om Dickeya aan te tonen. Bestrijding van trips in hyacint door middel van een CATT-behandeling Dipstick: Peter Vreeburg Wageningen UR, PPO PBBF, Jan Wichers FBR-WUR Trips: Peter Vreeburg Wageningen UR, PPO PBBF Praktijkonderzoek Plant & Omgeving, Bloembollen, Boomkwekerij en Fruit PPO nr PT nr November 2015

2 2015 Wageningen, Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek (DLO) onderzoeksinstituut Praktijkonderzoek Plant & Omgeving. Alle rechten voorbehouden. Niets uit deze uitgave mag worden verveelvoudigd, opgeslagen in een geautomatiseerd gegevensbestand, of openbaar gemaakt, in enige vorm of op enige wijze, hetzij elektronisch, mechanisch, door fotokopieën, opnamen of enige andere manier zonder voorafgaande schriftelijke toestemming van DLO. Voor nadere informatie gelieve contact op te nemen met: DLO in het bijzonder onderzoeksinstituut Praktijkonderzoek Plant & Omgeving, Bloembollen, Boomkwekerij en Fruit DLO is niet aansprakelijk voor eventuele schadelijke gevolgen die kunnen ontstaan bij gebruik van gegevens uit deze uitgave. Projectnummer: PT Praktijkonderzoek Plant & Omgeving, onderdeel van Wageningen UR Business Unit Bloembollen, Boomkwekerij en Fruit Adres : Postbus 85, 2160 AB Lisse : Prof. Van Slogterenweg 2, 2161 DW Lisse Tel. : Fax : info.bollen.ppo@wur.nl Internet : Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 2

3 Inhoudsopgave pagina SAMENVATTING INLEIDING ONTWIKKELING DIPSTICK-TEST OM DICKEYA AAN TE TONEN Inleiding Materiaal en methoden Resultaten Discussie Conclusie BESTRIJDING TRIPS IN HYACINT DOOR CATT Inleiding Materiaal en methode Resultaten Discussie en conclusie COMMUNICATIE Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 3

4 Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 4

5 Samenvatting In dit project, dat is gefinancierd vanuit het restant van het surplusfonds van de hyacintentelers, zijn twee onderwerpen opgenomen, namelijk: ontwikkeling van een snelle goedkope test om aan te tonen of een hyacint met snotsymptomen aangetast is door Dickeya (agressief snot) (ook als project binnen IDC) en een CATT behandeling tegen trips. Dipstick-test In samenwerking met FBR WUR is een protocol met een dipstick ontwikkeld waarmee binnen een uur bekend is of de snotsymptomen van een hyacintenbol veroorzaakt worden door de Dickeya-bacterie. Als de test negatief is, is de oorzaak waarschijnlijk Pectobacterium (witsnot), maar dat geeft deze test niet aan. Dit protocol is nog niet geschikt om door een teler zelf uit te voeren, maar kan wel op PPO uitgevoerd worden voor de teler of exporteur. Deze toets is sneller en goedkoper dan de huidige PCR toets. De test is iets minder gevoelig dan de PCR-toets, maar bij normale snotbollen zal de lagere gevoeligheid geen nadeel zijn. Voordat een teler de test op het eigen bedrijf kan uitvoeren zou nog aanvullend onderzoek noodzakelijk zijn, maar daarvoor is geen financiering beschikbaar gesteld. De toets wordt op PPO op de afdeling diagnostiek uitgevoerd. Tripsbestrijding Binnen een PPS project Met CATT maken wij producten duurzaam plaagvrij wordt in samenwerking met andere partijen onderzocht of een CATT-behandeling (Controlled Atmosphere Temperature Treatment) in staat is tripsen in holbollen en leverbare bollen te bestrijden zonder schade te geven. De eerste resultaten geven aan dat er een goede bestrijding mogelijk is, waarbij er effecten zijn van de duur en temperatuur van de behandeling en van de samenstelling van de lucht (gehalte O 2 en CO 2 ). Zowel behandeling bij een hoge temperatuur onder normale luchtsamenstelling, als een behandeling bij een normale temperatuur maar dan met gewijzigde luchtsamenstelling, kunnen tripsen bestrijden. Holbollen zijn niet gevoelig voor de behandelingen, maar leverbare bollen wel en die toonden soms zeer veel schade bij afbroei. Er waren slechts enkele behandelingen die zowel de tripsen bestreden als geen schade gaven bij holbollen én leverbaar. Holbollen en leverbaar vergen daarom in het vervolg deels een andere aanpak. Dit onderzoek loopt nog een jaar door. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 5

6 Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 6

7 1 Inleiding Het gewas hyacint heeft te maken met enkele grote uitdagingen om de kwaliteit en daarmee de marktpositie op peil te houden. Om die reden wilde het bestuur van de productgroep Hyacint een extra impuls geven aan onderzoek om enerzijds de problemen met Erwinia te verminderen en anderzijds de organische stofproblematiek aan te pakken. Er was nog ruimte voor collectieve hyacintenactiviteiten binnen het zogenaamde surplusfonds hyacint. Het uitgangspunt was dat het geld ook ingezet kan worden voor andere dan genoemde onderwerpen en dat de productgroep Hyacint de keuze zou maken. De productgroep Hyacint heeft in de loop van 2013 besloten om met een deel van het budget een onderzoek te ondersteunen om tot een eenvoudige en snelle methode te komen om vast te stellen of een hyacintenbol met snotverschijnselen aangetast was door Dickeya (agressief snot) of niet (in dat geval is meestal witsnot de veroorzaker). Deze zogenaamde dipstick is een nieuwe ontwikkeling die ook voor andere ziekten is ontwikkeld. Dit onderzoek is in 2014 uitgevoerd door PPO en FBR (Wageningen UR en het project is binnen het IDC (Innovatie en Demo Centrum, Bollen & Vaste planten) in gang gezet. In voorjaar 2014 is door de productgroep Hyacint het resterende budget bestemd voor inzet in een PPS Met CATT maken wij producten duurzaam plaagvrij, een project van o.a. PPO AGV, PPO BBF, FBR en PRI, waarin diverse plagen worden bestreden en waarin de bestrijding van trips bij hyacint is ondergebracht. CATT (Controlled Atmosphere Temperature Treatment) is een celbehandeling waarin tijdsduur, temperatuur, laag zuurstofgehalte en hoog koolzuurgehalte worden gecombineerd. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 7

8 Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 8

9 2 Ontwikkeling dipstick-test om Dickeya aan te tonen 2.1 Inleiding Het gewas hyacint heeft te maken met enkele grote uitdagingen om de kwaliteit en daarmee de marktpositie op peil te houden. Zo ontstaat er in de sector jaarlijks veel schade door Erwinia. Erwiniabacteriën laten bollen verrotten, waarbij de bol leegloopt en waarbij veel stank optreedt. Om die reden wilde het bestuur van de productgroep Hyacint een extra impuls geven aan onderzoek om de problemen met Erwinia te verminderen, naast de vele maatregelen die momenteel al door het vak worden genomen om de aantasting te beperken. Bij de hyacinten spelen twee types Erwinia (agressief snot= Dickeya en witsnot = Pectobacterium) die qua bestrijding en omvang van schade van elkaar verschillen. Visueel is het onderscheid veelal niet te maken. Voor een goed onderscheid tussen beide types is nu een tijdrovende (afhankelijk van beschikbare mankracht 1-3 dagen) en dure laboratoriumtest (ca. 225) noodzakelijk. Er zijn 2 dipstickvarianten mogelijk, die verschillen in hetgeen ze aan kunnen tonen, in wijze van toepassing en in kosten. Er is een eenvoudige (serologische) test die alleen Dickeya soorten aantoont en dus aangeeft of men met agressief snot te maken heeft. Een dipstick-test die aangeeft of Dickeya (agressief snot) verantwoordelijk is voor de rotting van de bol, zou door het bedrijf zelf kunnen worden uitgevoerd. Deze geeft snel (15 min - 1 uur) een uitslag en de kosten liggen veel lager (ca. 10 exclusief eventueel benodigde kit voor voorbewerking en exclusief arbeid). De eerste resultaten zijn veelbelovend, maar vragen nog het nodige onderzoek en uittesten op laboratorium en op bedrijven alvorens ze voor de praktijk beschikbaar zijn. Een ander type dipstick-test, gebaseerd op genomisch DNA, zou ook aan kunnen geven welke Dickeya aanwezig is en of er ook Pectobacterium bij de aantasting betrokken is. Deze dipstick-test is wel duurder. Welke Dickeya aanwezig is, is voor de ondernemer vaak van minder belang, maar kan wel van belang zijn bijvoorbeeld bij vraagstukken over de herkomst van een besmetting en geeft meer zekerheid over de oorzaak. Doe-het-zelf test kits bestaan al geruime tijd, en niet alleen als zwangerschapstest zoals te koop bij de drogist. Er worden al jaren dipstick-testen verkocht om plantenziekten aan te tonen. Een recent voorbeeld is die, verkocht door PRIME Diagnostics om een bacterieziekte in Prunus (Xanthomonas (Xap) in laurierkers (figuur 1) aan te tonen: de Xap-LFD kit die ontwikkeld is in samenwerking met PPO. Deze tests zijn gebaseerd op zgn. antistoffen die specifiek het pathogeen herkennen. Binnen dit project wordt nagegaan of het mogelijk is een Laterale Flow ImmunoAssay (LFIA) dipstick te ontwikkelen die betrouwbaar, snel en goedkoop aangeeft of Dickeya de oorzaak is van een snotbol, dus de eenvoudige serologische test. Met deze dipstick-test kunnen ondernemers (telers, broeiers én handel) zelf bepalen, of snel laten bepalen, of Dickeya (agressief snot) aanwezig is. Vervolgens kan de ondernemer een bewuste keuze maken voor de maatregelen die genomen dienen te worden om de aantasting en daarmee de schade te voorkomen of te beperken. De uitslag kan voorkomen dat risicopartijen bijvoorbeeld de droogverkoop in gaan en bij de handel, winkel en consument terecht komen en daar mogelijk voor veel schade zorgen. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 9

10 Figuur 1. Schematische voorstelling van test die gemaakt is voor Prunus om Xanthomonas aan te tonen 2.2 Materiaal en methoden De dipstick-test voor hyacint is ontwikkeld samen met Ir. J.H.Wichers van Wageningen UR Food & Biobased Research (FBR). In het ontwikkelingstraject is een aantal stappen te onderscheiden: 1. Inventarisatie van de beschikbaarheid van een antistof voor de specifieke detectie van Dickeya /vroegere Erwinia chrysanthemi. 2. Het monstervoorbewerkingstraject. Vorming van (ongewenste) aggregaten tussen koolstof conjugaat en bacteriële cellen aan het begin van de strip minimaliseren: gebruik van kleine, disposable zgn. Potter-buisjes, al dan niet gecombineerd met het gebruik van een sizeexclusion filter en het eventueel gebruik van additieven (b.v. surfactants). 3. Vaststellen van het te bemonsteren deel van de aangetaste bol om tot een optimaal testresultaat te komen (in samenspraak met PPO-Lisse) 4. Optimalisatie van de LFIA karakteristieken (ph controle, monstergrootte en eventuele monsterverdunningsstappen 5. PPO-Lisse valideert de door WUR-FBR gegenereerde LFIA resultaten op bol materiaal m.b.v. een Dickeya specifieke PCR test 6. Demonstratie protocol / dipstick-test voor leden van productgroep Hyacint 7. Uittesten door leden van productgroep Hyacint Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 10

11 2.3 Resultaten Het antiserum. Van het Dickeya antiserum dat verkrijgbaar is bij Prime-Diagnostics (Wageningen) onder de naam Dickeya dianthicola (Erwinia chrysanthemi) IPO-502, is meer dan voldoende op voorraad. Het antiserum is verkrijgbaar als caprylzuur gezuiverd IgG of als ruw antiserum. Bij de dipstick-test wordt voor zowel captureals detector ligand het caprylzuur gezuiverde IgG gebruikt. Het is een oud antiserum dat veel breder werkt dan alleen D. dianthicola. Bekend is ook dat er enkele Pseudomonas fluorescens species kunnen kruisreageren (J.M. van der Wolf en G.C. Gussenhoven Reaction of saprophytic bacteria from potato peel extracts and plant pathogenic bacteria in ELISA with antisera to Erwinia chrysanthemi (serogroup O1Ha). European Journal of Plant Pathology 12/1991; 98(1):33-44.). Ontwikkeling dipstick-test Bij FBR is het protocol ontwikkeld waarbij uitgegaan wordt van meerdere stappen, te beginnen met het nemen van het monster bolweefsel en dit, na bewerking, testen met een dipstick-test waarbij wel (= Dickeya) of geen (= geen Dickeya) zwart bandje zichtbaar wordt, naast een controlebandje dat ALTIJD zichtbaar moet zijn. Monstername Bij voorkeur wordt als monster rot bolweefsel genomen in de bol op de plaats waar de aantasting nog vers is. Op de grens van gezond en aangetast rot weefsel wordt het rotte weefsel gepakt met een schoon mes of iets dergelijks. De bewerking van het rotte bolweefsel bleek lastiger te zijn dan in het voorbeeld van figuur 1 met bladeren en Xanthomonas. De bewerking vereist daarom meer stappen om een goed testbaar extract te krijgen. De hoeveelheden van zowel het rotte weefsel als van de toegevoegde materialen die worden genoemd, zijn belangrijk omdat bij andere hoeveelheden storingen in het systeem kunnen optreden, waardoor de dipsticktest uiteindelijk mogelijk geen juiste uitslag geeft. Protocol voor Laterale Flow ImmunoAssay voor de detectie van Dickeya (o.a. solani) (veroorzaker van agressief snot ) in bollen van hyacint. Werkwijze: 1. Verzamel ± 1 gram (aangetast/verdacht) Hyacintenbolweefsel en doe dit in het Bioreba zakje (Extraction bags «Universal» nr , 12 x 15 cm with synthetic intermediate layer for optimal filtration). Dit is een zakje met een tussenwand; doe het bolweefsel aan één kant. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 11

12 2. Voeg aan het zakje met het bolweefsel 5 ml 1 x PBS-buffer toe; vouw zakje dicht en plet vervolgens de inhoud op een vlakke ondergrond door druk uit te oefenen met de hand, (rubber) hamer, etc. 3. Zuig met een weggooi-pipet uit de andere zijde van het Bioreba zakje dan waarin het bolmonster is gedaan, extract en doe dit in een plastic puntbuisje en wacht enkele minuten, zodat het grofste celmateriaal uitzakt. 4. Breng van het bovenste deel uit het puntbuisje 0.5 ml extract over naar een weggooi 1.5 ml micropotter buis en mix inhoud gedurende 2 à 3 minuten m.b.v. de blender met conisch opzetstuk. 5. Breng in putje van microtiter plaat 95 µl Running Buffer, 5 µl extract en 1 µl koolstof conjugaat; meng inhoud van putje en plaats teststrip. 6. Wacht 10 à 15 minuten met aflezen van strip: Alleen controle lijn: Controle lijn èn testlijn: Alleen testlijn: Links: controle rechts: Dickeya Geldige test, géén Dickeya Geldige test, Dickeya infectie Ongeldige test Opmerking: ter voorkoming van kruisbesmetting tussen monsters moeten veel materialen na één keer gebruik worden weggegooid. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 12

13 Bij het huidige protocol is het volgende nodig: Voor éénmalig gebruik: Bioreba zakjes, micro potter buisjes, weggooi-opzetstukjes voor de blender, weggooipipetten en weggooi-minibuisjes Voor meermalig gebruik: mini blender (werkend op batterijen) en goede pipetten die afgesteld zijn op verschillende hoeveelheden microliters Voor gebruik: een hoeveelheid koolstof conjugaat, PBS-buffer en running-buffer. Na verdere doorontwikkeling kan de dipstick-test vanaf stap 5 ook vereenvoudigd worden door het extract in het test vlakje te druppelen (zie foto ), waarna het wachten is of er een streepje zichtbaar wordt bij de T. In dit geval zouden minder materialen nodig zijn en zou bijvoorbeeld een starterskit gemaakt kunnen worden met alle materialen voor 50 testen en een vervolg testkit voor 50 testen maar dan zonder de blender. Aanbrengen te testen extract Rechts positieve uitslag door zichtbaar streepje bij T Voorbeeld van dipstickkit na verdere ontwikkeling. Testen dipstick In 2013 zijn de eerste stappen gezet waarin een aantal isolaten is getest om na te gaan of het beoogde antiserum bruikbaar was voor deze toepassing (figuur 2 en tabel 1). Daaruit bleek dat de uitslagen verkregen met de dipstick-test en die van PCR goed overeen kwamen. Alleen de negatieve uitslag van nr 9064 was niet verwacht. Deze is nog nagetrokken op PPO met PCR waarbij bleek dat de PCR wel positief was. Later is het zelfde isolaat 9064 opnieuw getest (zie tabel 2) waaruit bleek dat het deze keer wel werd aangetoond met de dipstick. Een verklaring waarom het de eerste keer afweek ontbreekt. Mogelijk dat er de eerste keer te weinig bacteriën aanwezig waren gezien de verschillen in gevoeligheid tussen de dipsticktest en PCR (zie tabel 3). Figuur 2. Opname van de dipsticks met specifieke lijn die aangeeft of Dickeya aanwezig is, hoort bij tabel 1. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 13

14 Tabel 1. Vergelijking van dipstick-test en PCR bij een aantal isolaten afkomstig van verschillende herkomsten. Zie ook figuur 2. Voorjaar 2014 is wederom een aantal bacteriestammen en herkomsten getest (Tabel 2 ). Hieruit bleek dat de resultaten van PCR en dipstick-test geheel overeenkwamen. PPO nr. species gewas PCR dipstick PCR Y1/Y2 9094A Pc odoriferum Hyacint pos. Pcc neg Pcc hyacint pos. Pcc neg Pcc Paprika pos. Pcc neg. PCR pseudo 15 Pseudomonas viridiflava Zantedeschia pos. pseudo neg. 19 Pseudomonas marginalis Iris pos. pseudo neg. 12A10 Pseudomonas putida aardappel pos. pseudo neg. PCR Ade 1/Ade Dickeya hyacint pos. dickeya pos D. diffenbachia phalaenopsis pos. dickeya pos D.dianthicola sedum pos. dickeya pos D. Solani hyacint pos. dickeya pos D. dadanti narcis pos. dickeya pos D. dianthicola Dahlia pos. dickeya pos D. solani hyacint pos. dickeya pos D. dadanti hyacint pos. dickeya pos D. dianthicola Dahlia pos. dickeya pos. Tabel 2. Testresultaten van de dipstick toegepast bij verschillende herkomsten van Pectobacterium, Pseudomonas en Dickeya die positief reageerden met PCR. Om de gevoeligheid te testen is een verdunningsreeks gemaakt waarbij aangetast bolweefsel van een met Dickeya besmette bol (Figuur 3 ) werd verdund. De verdunning vond plaats met gezond bolweefsel of met door witsnot (Pectobacterium) aangetast weefsel. De resultaten (Tabel 3 en figuren 4 t/m 7) gaven aan dat de PCR-toets zoals verwacht gevoeliger is dan de dipstick. Bij een verdunning van 1 op 10 was de besmetting na een korte tijd nog zichtbaar, bij een langere Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 14

15 wachttijd van 1 dag was dit nog bij 1 op 50 het geval. De PCR-toets was nog in staat Dickeya aan te tonen bij een verdunning van minimaal 1 op 500. Het maakte bij de dipstick-test en de PCR geen verschil of verdund werd met gezond bolweefsel of met door Pectobacterium verrot bolweefsel. Bol met Dickeya Bol met Pectobacterium Figuur 3. Zieke bollen gebruikt als uitgangsmateriaal voor test met verdunningen Preparaat Verdunning : 1 1/2 1/5 1/10 1/20 1/50 1/100 1/500 0 Dipstick Fig. 3 en 4 1 Gezond + Dickeya Pcc + Dickeya PCR Fig. 5 en 6 1 Gezond + Dickeya Pcc + Dickeya : te zien na een dag incuberen. Tabel 3. Resultaten van verdunningen van het bolweefsel bij testen op Dickeya met de dipstick-test en met PCR. Vb. 1/10 wil zeggen: 1 deel monster + 9 delen buffer, dus 10x verdund. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 15

16 Figuur 4. Gezond + Dickeya dipstick-test Figuur 5. Pcc + Dickeya dipstick-test Figuur 6. Gezond + Dickeya PCR -Dickeya Figuur 7. Pcc + Dickeya PCR-Dickeya Figuur 4 en 5: Dipsticks met bij pijl het bandje voor Dickeya Figuur 6 en 7: PCR opnames met bij pijl het bandje voor Dickeya. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 16

17 Een aantal verzamelde hyacintenmonsters en monsters (voorbeeld zie tabel 4 ) die via de afdeling diagnostiek binnenkwamen met de vraag of de snotaantasting een gevolg was van agressief snot of witsnot, werden zowel met de dipstick-test als met PCR getoetst. In alle gevallen op één na waren de monsters die positief waren met PCR ook positief met de dipstick-test. Er was één hyacintenmonster waarvan de bollen al erg uitgedroogd waren en waarbij PCR een zwak positief signaal liet zien terwijl de dipstick-test niet positief was. De verklaring ligt waarschijnlijk in het geringe aantal Dickeya bacteriën, dat waarschijnlijk nog aanwezig was in de opgedroogde bol. Er zijn ook een monster narcis en een monster Muscari getest en in beide werd Dickeya aangetoond met de dipstick-test. Met PCR werd D. dadantii in narcis en D. solani in Muscari vastgesteld. Diagnostiek Nr. en cultivar hyacint Symptoom Dickeya Dip Stick PCR op Dickeya (ADE1/ADE2) PCR op Pcc (Y1/Y2) Specifiek PCR A snot pos pos neg B snot neg neg pos XX Narcis rot pos pos neg D. dadantii Narcis rot pos pos neg D. dadantii Muscari snot pos pos neg D. solani Muscari snot pos pos neg D. solani M (1) snot pos pos neg M (2) gezond neg neg neg BS (3) snot pos pos neg BS (4) gezond neg neg neg PS snot nos pos neg PS snot Pos pos neg D (1) snot pos pos neg D (2) snot pos pos neg Tabel 4. Enkele monsters van Diagnostiek waarbij snotbollen zijn getest op Dickeya met dipstick-test en PCR en met PCR op Pectobacterium. Demonstratie en testen door bedrijven In juli is het prototype gedemonstreerd aan de bestuursleden van de productgroep Hyacint. De conclusie was dat de dipstick-test werkt maar in deze vorm niet geschikt is om door de bedrijven zelf uit te voeren. Nagegaan moet worden wat de mogelijkheden en kosten zijn voor verdere ontwikkeling, waarbij deze test wel door de bedrijven kan worden uitgevoerd. Ook is aangegeven dat de dipstick-test in de periode daarna verder getest zou worden en dat de gevoeligheid zou worden nagegaan (zie bij resultaten bij testen dipstick-test). Productie dipstick-test FBR kan eventueel in samenwerking met Prime-Diagnostics de huidige dipstick-test leveren en mogelijk ook de verder nog te ontwikkelen test voor op de bedrijven. Voor de kosten hiervan zou dan nog financiering moeten worden gevonden. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 17

18 Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 18

19 2.4 Discussie Dipstick-test Toetsing met de dipstick-test volgens het nu beschikbare protocol geeft snel en betrouwbaar aan of een snotbol door Dickeya aangetast is of niet. Het nu beschikbare protocol is goed bruikbaar voor bijvoorbeeld de afdeling Diagnostiek van PPO. De te berekenen kosten zouden voor de teler aanzienlijk lager zijn dan die van de huidige PCR-toets en de teler krijg ook (veel) sneller een betrouwbare uitslag. Het protocol vereist wel de benodigde laboratoriummaterialen en enige kennis/ervaring. Voor ontwikkeling en toepassing op de bedrijven zal nog een aanvullend stuk moeten worden ontwikkeld en het is aan het vak of daar geld voor beschikbaar wordt gesteld. FBR levert daarvoor een offerte. Daarmee zal de discussie met de teelt en export worden gestart. Indien uit kostenoverweging niet per bol maar met mengmonsters gewerkt gaat worden is van belang dat goed gemengd wordt en moet duidelijk zijn dat een positieve uitslag alleen aangeeft dat Dickeya aanwezig is en niets zegt over de mate waarin het voor komt. Er zal wel een duidelijke instructie nodig zijn voor het nemen van het monster. Welk deel van de bol en de hoeveelheid zijn van belang. Positief is dat de huidige test ook geschikt bleek voor Muscari en narcis, maar er is slechts van beide gewassen één monster getest. 2.5 Conclusie Dipstick-test Er is een protocol met een dipstick-test die na ca. 30 minuten betrouwbaar kan aantonen of een snotbol door Dickeya is aangetast. De dipstick is nog niet geschikt om door een teler zelf op het bedrijf uit te voeren. PPO afdeling Diagnostiek gaat de huidige dipstick- toets aanbieden tegen een aanzienlijk lager tarief dan nu geldt voor een PCR-toets. FBR maakt een offerte voor vervolgonderzoek naar de stap naar toetsing op en door de bedrijven. Update nov 2015: De verwachte kosten voor het verder ontwikkelen van de dipstick voor toepassing op de bedrijven werden te hoog gevonden ( ). Daarbij kwam dat de verwachting was dat de test ook gebruikt zou worden als bewijs in geval van onenigheid over de kwaliteit van de partij. In dat geval zou de test toch door een onafhankelijke partij moeten worden genomen. PPO biedt de dipsticktest aan volgens het ontwikkelde protocol. FBR zorgt voor de benodigde materialen. De tarieven voor de praktijk zijn veel lager dan de gebruikelijke PCR toets en de uitslag is ook sneller beschikbaar. Wel is gebleken dat de houdbaarheid van bepaalde onderdelen beperkt is en er dus jaarlijks wat ververst moet worden. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 19

20 Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 20

21 3 Bestrijding trips in hyacint door CATT 3.1 Inleiding Trips in hyacint is een plaag die in de afgelopen jaren toenam zowel in de teelt als in de broei. Onderzoek op PPO leidde tot adviezen voor het gebruik van Admire als ontsmettingsmiddel en een hoge dosering Actellic als ruimtebehandeling. Beide zijn niet meer toegestaan. Bruikbare alternatieven zijn er nog niet. CATT (Controlled Atmosphere Temperature Treatment) is een ruimtebehandeling waarin hoge tempratuur, lage concentratie O 2 en hoge concentratie CO 2 worden gecombineerd gedurende een bepaalde periode. Voor de bestrijding van de aardbeimijt bij aardbeimoerplanten is het inmiddels een praktijktoepassing. Er is al enige ervaring opgedaan door o.a. FBR/PRI waaruit blijkt dat met name insecten en mijten goed te bestrijden zijn door deze behandeling Er is ook al ervaring met de bestrijding van Californische trips. In het voorliggende project is o.a. samengewerkt met Jan Verschoor (FBR Fresh Food and Chains) voor de CATT toepassing en Willem Jan de Kogel (PPO/PPRI Bio Interacties en Plantgezondheid) voor het ter beschikking stellen van de tripsen. In voorjaar 2014 is door de productgroep Hyacint budget bestemd voor inzet in een PPS Met CATT maken wij producten duurzaam plaagvrij in 2014 en 2015, een project van o.a. PPO AGV, PPO BBF, FBR en PRI, waarin diverse plagen worden bestreden en waarin de bestrijding van trips bij hyacint is ondergebracht. De Projectleiding lag bij Yu Tong Qiu (PPO AGV/PRI). In dit project is nagegaan wat de mogelijkheden zijn voor de bestrijding van tabaks trips bij hyacint en of de bollen (zowel holbollen als broeibollen) de behandeling zonder schade kunnen doorstaan. Omdat het een onderdeel is van de PPS kunnen de details van de behandelingen momenteel nog niet vrijgegeven worden. 3.2 Materiaal en methode Het onderzoek naar de bestrijding is uitgevoerd met holbollen van de cultivar Pink Pearl, die besmet waren met gekweekte tabaks trips. Om na te gaan of de behandelingen schade geven, zijn tegelijkertijd niet besmette holbollen en leverbare bollen (Pink Pearl en Delft Blue) behandeld. De holbollen worden nageteeld en de leverbare bollen worden afgebroeid ter beoordeling op mogelijke schade door de behandelingen. Besmetting en bewaring De holbollen zijn 13 augustus besmet met trips, die gekweekt waren op preibladeren. De holbollen zijn bewaard in plastic emmertjes waarvan de bodem en deksel voorzien waren van speciaal tripsgaas. Dit laat wel lucht door, maar tripsen kunnen er niet in of uit. Onderlinge besmetting kon gedurende de vele weken van de bewaring op deze wijze worden voorkomen. De niet besmette holbollen zijn normaal bewaard in dezelfde bewaarcel in de holbakken van de leverancier van de holbollen. De bollen zijn gehold en gedroogd aangekocht en zijn na te zijn besmet nog 5 dagen bewaard bij 23 C en vervolgens een week bij 25 C. Na de CATT behandeling zijn de bollen bewaard bij 25 C en later bij 23 C tot eind november. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 21

22 In de deksel (en bodem) tripsgaas geplakt Dozen van opzij gezien met 3 lagen bollen Figuur 1. Bewaring van de holbollen met een tripsbesmetting in plasticemmers met in de bodem en de deksel tripsgaas. CATT-behandeling De behandelingen zijn toegepast door FBR in Wageningen. Mogelijk kunnen door de behandeling meerdere gewassen en plagen tegelijkertijd worden bestreden. Details van de behandelingen zijn nog niet openbaar en zijn daarom gecodeerd weergegeven. Er zijn 15 CATT- behandelingen uitgevoerd, plus enkele controle behadelingen. Bij de CATT-behandelingen zijn diverse combinaties van tijd (D), temperatuur (T) en concentraties O 2 en CO 2 toegepast.: CATT 1 = normale luchtcondities en CATT 2 t/m 4 zijn uitgevoerd met verlaagd % O 2 en verhoogd % CO 2. CATT 1: c/d, CATT 2: c/b, CATT 3 a/b en CATT 4: a/a, waarbij een hogere letter in het alfabet een hoger % is. De CATT-behandeling vond plaats op 25 augustus in Wageningen; de bollen zijn na 3 dagen teruggebracht naar PPO in Lisse en daar verder bewaard tot beoordeling en planten na half november. Tabel 1. Behandelingsschema hyacint holbollen en leverbaar (T= temperatuur, D is duur in dagen, CATT 0= normale lucht, CATT 2 t/m 4 zijn verschillende combinaties van % O 2 /%CO 2. Temperatuur Duur CATT 0 CATT 1 CATT 2 CATT 3 CATT 4 T 1 D T 2 D D T 3 D D controle dompeling 16 controle besmet 17 controle niet besmet 18 De dompelbehandeling als controle behandeling is inmiddels niet meer toegestaan. Beoordeling De met trips besmette holbollen zijn beoordeeld op de mate waarin de tripsen zijn bestreden en de schade die zij veroorzaakt hebben. De rokken van de besmette bollen worden daarbij losgemaakt en enkele dagen in een Berlese trechter aan licht en warmte blootgesteld waardoor alle aanwezige tripsen vrijkomen en gevangen en geteld kunnen worden. De mate van schade aan de bolrokken en klisters door de tripsen wordt vastgelegd. De niet besmette bollen worden beoordeeld op de mate van ontwikkeling van klisters en vervolgens opgeplant ter beoordeling van de ontwikkeling en groei van de nieuwe bolletjes. Te velde en na de oogst worden ze opnieuw beoordeeld op stand van het gewas respectievelijk op de opbrengst. De leverbare bollen zijn eind november opgeplant en worden in februari beoordeeld op kwaliteit van gewas en bloem. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 22

23 3.3 Resultaten Tripsbestrijding De resultaten van de tripbestrijding zijn zichtbaar op de foto s van alle behandelingen (figuur 2) en in tabellen 2 en 3. Bij sommige behandelingen zijn helemaal geen klisters zichtbaar omdat de tripsen vanaf het begin in grote aantallen aanwezig waren: behandeling 1, 3, 6, 7 en 17. Bij andere behandelingen is enige bestrijding opgetreden waardoor aanvankelijk wel klisters zijn aangelegd en deze meer of minder zijn gegroeid en pas later in de tijd zijn aangetast, zoals bij de behandelingen 2, 8, 12 en 16. Tenslotte zijn er behandelingen die geen of vrijwel geen tripsschade hebben zoals behandelingen 4, 5 9, 10 11, 13, en 18. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 23

24 Figuur 2 (deel 1). Overzicht van de behandelde besmette holbollen bij planten. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 24

25 Figuur 2 (deel 2). Overzicht van de behandelde besmette holbollen bij planten. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 25

26 Tabel 2. Visuele beoordeling op aantasting door trips bij holbollen na een CATT- behandeling. Behandeling en behandelingsnummers Aantasting door trips (r= roet; p = penicillium) Temp. Duur CATT 0 CATT 1 CATT 2 CATT 3 CATT 4 CATT 0 CATT 1 CATT 2 CATT 3 CATT 4 T 1 D vroeg zwaar licht laat vroeg zwaar geen geen T 2 D vroeg zwaar + r/p geen D vroeg zwaar + r/p laat + r/p geen T 3 D laat zwaar + p geen D geen geen geen controle dompeling 16 laat controle besmet 17 vroeg zwaar controle niet besmet 18 geen Er zijn ook tripsen geteld door per herhaling 10 halve bollen in de Berlese trechter te bewaren. Uit die resultaten viel op dat bij de op het oog goede en gezonde bollen (groen in tabel 3) er soms toch een heel enkele dode volwassen trips gevonden werd. Niet uitgesloten kan worden dat dit nog een trips is die door de behandeling in augustus is gedood en al die tijd ergens op de bol is blijven liggen en bij het verwerken voor de Berlese trechter is opgevangen. De hoge aantallen tripsen zijn vooral te vinden bij de laat aangetaste bollen (een laat ontwikkelende populatie tripsen). Bij de vroeg aangetaste bollen werden minder tripsen gevonden, waarschijnlijk omdat het voedsel aan het op raken was. Tabel 3. Het gemiddeld aantal tripsen per holbol bij planten. Behandeling en behandelingsnummers aantal tripsen per holbol bij planten Temp. Duur CATT 0 CATT 1 CATT 2 CATT 3 CATT 4 CATT 0 CATT 1 CATT 2 CATT 3 CATT 4 T 1 D a 82 c 10 a 1 a 1 a T 2 D ab 12 a D a 53 bc 0 a T 3 D c 2 a D a 1 a 0 a controle dompeling ab controle besmet ab goede gezonde holbollen controle niet besmet 18 1 a Effecten van temperatuur, duur en CATT condities zijn goed zichtbaar. CATT 4 heeft bij elke duur en temperatuur een goede bestrijding gegeven en hetzelfde geldt voor alle behandelingen bij T3 gedurende D2. Tenslotte geeft ook CATT 3 met het zelfde % O 2 als in CATT 4 een afdoende bestrijding. De invloed van verhoging van % CO 2 (CATT 2 naar CATT 1) is in dit onderzoek van veel minder belang dan verlaging van het % O 2 (CATT 3 en 4 t.o.v. 1 en 2). Het hogere gehalte CO 2 bij CATT 1 t.o.v. CATT 2 heeft aanvankelijk wel geleid tot betere bestrijding waardoor de aantasting pas later opgang gekomen is en er dus aan het eind meer tripsen zijn gevonden. Opvallend is dat de dompelbehandeling (oud advies) ook niet vrij was van trips. Effect op niet met trips besmette holbollen De gezonde holbollen die behandeld zijn zagen er allemaal goed uit met veel aangelegde en goed ontwikkelde bolletjes, waarbij geen verschillen te zien waren tussen de behandelingen. Een voorbeeld is te zien in figuur 3 waarin 4 behandelingen zijn weergegeven. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 26

27 Figuur 3. Het resultaat van 4 CATT-behandelingen van niet met trips besmette holbollen bij planten in november. Alle behandelingen zijn geplant ter bepaling van de groei. De opkomst was goed (figuur 4) en het gewas van alle veldjes was vergelijkbaar. Helaas bleek er in de grond en Pythiumbesmetting aanwezig waardoor veel wortels van bollen van veel behandelingen ernstig werden aangetast. Hierdoor gaf de oogst geen betrouwbare uitslag. Figuur 4. Opname opplant holbollen, half april 2015 Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 27

28 Afbroei leverbare bollen Na de koeling bij plaatsing in de kas bleek al dat enkele behandelingen veel schade hadden opgelopen. De afbroeikwaliteit (tabel 4 en figuren 5 en 6) liet zien dat er schade aan de bloemtros en soms aan het blad was veroorzaakt. Duidelijk was dat de hoogste temperatuur en duur (T3 D2) niet veilig was en dat CATT 2 (bij T1 D2) en vooral CATT 4 bij T2 en T3 tot veel schade leidde. Opvallend was dat CATT 4 bij de laagste temperatuur T1 geen schade veroorzaakte. De verklaring voor de rotkoppen bij CATT 2 is niet duidelijk Heel opmerkelijk was dat bij Pink Pearl bij T3/D2 met CATT 4 100% bosjesplanten voorkwamen, een schadebeeld dat soms optreedt als 2-jarig schade beeld na de heetstook. Tabel 4. Gewasbeoordeling bij afbroei na div. CATT-behandelingen. Behandeling niet met trips besmette bollen van 17cm Pink Pearl Temperatuur Duur CATT 0 CATT 1 CATT 2 CATT 3 CATT 4 CATT 0 CATT 1 CATT 2 CATT 3 CATT 4 T 1 D goed goed 27% rotkop goed goed T 2 D goed 15% afwijkende bloemtros D goed goed 100% sterk afwijkend T 3 D goed 100% afwijkend bloemtros D groene nagels 3% rotkop 100% bosjesplanten controle dompeling 16 goed controle niet besmet 18 goed Delft Blue Temperatuur Duur CATT 0 CATT 1 CATT 2 CATT 3 CATT 4 CATT 0 CATT 1 CATT 2 CATT 3 CATT 4 T 1 D goed goed 10% rotkop goed goed T 2 D goed 13% rotkop D goed goed 100% sterk afwijkend T 3 D goed 100% afwijkende bloemtros D goed 3% rotkop 100% afwijkende tros en/of blad controle dompeling 16 goed controle niet besmet 18 goed Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 28

29 Controle behandeling (58= behnr 18) met goede kwaliteit bloemtros, naast behandeling (55=behnr 15) die 100% bosjesplanten gaf bij Pink Pearl. Behandelingen met misvormde trossen. Figuur 5. Foto s van februari 2015 van afbroei van leverbare met CATT-behandelde bollen van Pink Pearl. Controle (58= behnr 18) vergelijkbaar met de behandelingen die geen schade gaven. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 29

30 Behandelingen bij Delft Blue met misvormde trossen Behandeling links (75= behnr 15) met dunne trossen, meer klisters en bladtopbeschadiging en behandeling (63= behnr 13) met zware trossen zoals normaal. Figuur 6. Foto s van februari 2015 van afbroei van leverbare met CATT-behandelde bollen van Delft Blue. Behandeling (63=behnr 13) vergelijkbaar met de behandelingen die geen schade gaven. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 30

31 3.4 Discussie en conclusie Bepaalde CATT-behandelingen zijn in staat tabaks tripsen goed te bestrijden. Tripsen kunnen zowel door hoge temperatuur bij normale luchtcondities worden bestreden, als bij, voor bewaring van hyacinten, normale temperatuur maar dan met aangepaste luchtsamenstelling (laag zuurstof). De toegepaste CATT-behandelingen gaven geen schade indien toegepast op geholde bollen, maar gaven soms zeer veel schade op leverbare hyacinten die werden afgebroeid. Van de toegepaste behandelingen waren er maar enkele die én de tripsen bestreden én geen schade gaven. Voor leverbare bollen zal mogelijk een andere keuze voor een behandeling gemaakt moeten worden dan voor holbollen. Gebleken is dat tripsen goed bestreden kunnen worden, waarbij er twee mogelijkheden zijn: a) Bij voor hyacinten normale bewaartemperatuur (25 C) maar dan met aangepaste luchtsamenstelling, waarbij vooral zeer laag zuurstof belangrijk lijkt te zijn en b) Een hoge temperatuur onder normale luchtcondities. Ook van de gladiolen trips is bekend dat deze door hoge temperatuur kan worden betreden. De behandeling in de onderzoek met kleine aantallen bollen duurt slechts enkele dagen, maar zal mogelijk met grote volle cellen (iets) langer duren. Dit is nog wel een punt van aandacht bij een eventuele praktijktoepassing. Omdat er bij holbollen geen schade is gezien lijkt het mogelijk om voor dit materiaal te zoeken naar een behandeling die elke teler zelf op het bedrijf kan uitvoeren in een goede heetstookcel. Er is dan geen speciale CATT-cel nodig. Vervolg onderzoek bij holbollen richt zich daarom vooral op behandelingen met alleen tempratuur. Bij leverbare bollen echter trad bij de hoge temperatuur wel schade op aan de bloem. Vervolg onderzoek zal daarom gericht zijn op temperatuurbehandelingen die minder kans op schade geven én op CATTbehandelingen, die dan in een CATT-cel toegepast moeten worden. Dit zijn ook behandelingen van een of enkele dagen, zodat er in een cel wel veel bollen achterelkaar behandeld kunnen worden. Omdat bekend is dat bollen niet jaarlijks op dezelfde tijd in het dezelfde ontwikkelingsstadium zijn zou er tussen jaren wel variatie in mate van schade kunnen optreden, net als ook de schade bij de heetstook jaarlijks wel kan variëren. Of die variatie ook optreedt bij lage zuurstofcondities zal moeten blijken. De bestrijding van trips is met deze behandelingen wel éénmalig. Dat betekent dat bollen opnieuw besmet kunnen worden van buitenaf door luchtstromen waar de trips in aanwezig kunnen zijn. Toepassing van tripsgaas kan instroom van tripsen voorkomen. Er is wel effect gezien van hoog gehalte CO 2, maar het belang van zeer laag O 2 lijkt groter te zijn. Ook zijn duidelijke effecten van langer behandelen en een hogere temperatuur gezien. Duidelijk is ook dat de combinatie van tijd, temperatuur en aanpassing luchtsamenstelling de effecten kan versterken. Dit geldt zowel voor de bestrijding als voor de schade. Een opvallend voorbeeld is het optreden van 100% bosjesplanten, gezien bij de afbroei van Pink Pearl. Bij de CATT conditie 4 trad geen schade op bij de laagste temperatuur, maar nam de schade toe bij hogere temperatuur en langere duur tot uiteindelijk alle aanwezige spuiten in de bol vernietigd waren. De bol ging daarna over tot het aanleggen van nieuwe bolletjes. Bij Delft Blue was bij deze behandeling de schade ook het grootst, maar werden geen bosjes planten gevonden, ofschoon de bollen wel meer verklisterden. Van de heetstookbehandeling tegen geelziek is ook het schadebeeld bosjesplanten bekend, maar dan als overjarig effect. Het is dan zeer ongewenst. Het treedt ook zeer onvoorspelbaar op. Als deze CATT-behandeling dit beeld wel voorspelbaar op kan roepen, Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 31

32 zou het als een alternatieve vermeerderingsmethode ontwikkeld kunnen worden. Een methode om hyacinten te laten vermeerderen zonder dat daarvoor de bol met een mes hoeft te worden gesneden of gehold, biedt perspectief omdat daarbij het doorsmeren van bacteriën en schimmels voorkomen wordt. Bovendien bespaart het veel arbeid omdat een hele cel vol in enkele dagen kan worden behandeld. Dit idee wordt in nieuw onderzoek verder ontwikkeld. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 32

33 4 Communicatie 2013 September KAVB productgroep Hyacint, Hillegom 2014 Januari, mei en november KAVB productgroep Hyacint, Hillegom 20 maart, Jaarvergadering productgroep Hyacint, Keukenhof, Lisse o.a. dipstick 27 maart, studiegroep Hyacint, Lisse over o.a dipstick en trips problematiek 11 en 27 april, ontbijtsessie HOBAHO, Lisse en t Zand (alleen dipstick) 22 juli, demo dipstick voor het bestuur van de productgroep Hyacint, Lisse 19 november, Studiegroep telers de Zuid, Noordwijkerhout over o.a. dipstick en tripsbestrijding door CATT BloembollenVisie 2014 nr 306 p. 71: Dipstick Dickeya perspectiefvol (Interview) IDC (Informatie en Demo Centrum voor Bollen en Vaste planten: Op bloembollenweb.nl: ( t/m15 januari, Mechanisatietentoonstelling, Vijfhuizen: info dipstick in stand van IDC. 21 januari, Projectbijeenkomst PPS Met CATT maken wij producten duurzaam plaagvrij in St. Oedenrode. Info tripsbestrijding 2 februari, Studiegroep T&P Lisse over o.a. dipstick en tripsbestrijding door CATT 10 en 12 februari, bijeenkomst KAVB Hyacint in Lisse resp. Anna Paulowna in kader van promotie Hyacint onderzoek fonds. Info over o.a. dipstick en tripsbestrijding door CATT 18 februari, KAVB bestuur Productgroep Hyacint, Hillegominfo over dipstick en tripsbestrijding 20 februari KAVB overleg, Hillegom, met industrie i.v.m. insectenbestrijding: tripsbestrijding door CATT 24 februari, studiegroep Tulp, Lisse over o.a. tripsbestrijding 20 maart, Jaarvergadering KAVB productgroep Hyacint in Keukenhof, Lisse over o.a. dipstick en tripsbestrijding door CATT 20 maart, studiegroep Hyacint, Lisse over o.a. dipstick en tripsbestrijding door CATT 1 mei, Onbijtsessie HOBAHO Keukenhof, Lisse over Belang van schoon uitgangsmateriaal bij duurzame teelt met daarin o.a. dipstck en tripsbestrijding door CATT. 29 oktober, bij Flower Science Café in museum De Zwarte Tulp in Lisse, met IDC presentatie o.a. CATT tripsbestrijding en vermeerdering Artikel Peter Vreeburg, Paul van Leeuwen, Khanh Pham (Wageningen UR, PPO Bloembollen) en Jan Wichers (Wageningen UR, FBR): Snelle toets op agressief snot in hyacint. BloembollenVisie 2015 nr 325 p26 Peter Vreeburg (Wageningen UR, PPO Bloembollen): Eerste resultaten CATT-behandeling positief BloembollenVisie 2015 nr 325 p 20,21 Praktijkonderzoek Plant & Omgeving 33