Nederlandse samenvatting

Transcriptie

1

2

3 Gentherapie kan worden omschreven als de introductie van therapeutisch genetisch materiaal in cellen om ziekten te kunnen behandelen of te voorkomen. Erfelijke ziekten veroorzaakt door een defect in een enkel gen kunnen in theorie worden behandeld door gentherapie. Gentherapie kan ook worden gebruikt om therapeutische eiwitten in het centraal zenuwstelsel (CZS) toe te dienen, welke normaliter snel worden afgebroken in de bloedcirculatie en niet in staat zijn de bloed-hersen-barrière te passeren. Bovendien resulteert genetische modificatie van een cel in langdurige en lokale expressie van een therapeutisch eiwit hetgeen slechts bereikbaar is met toediening van het eiwit zelf door middel van injectie of van een infuus met een minipomp. Het gen coderend voor het therapeutische eiwit wordt over het algemeen ingebracht met behulp een virale vector. Virussen zijn infectieuze micro-organismen die hun genetisch materiaal (DNA of RNA) in een cel kunnen brengen voor virusreproductie, in veel gevallen ook door virale genen in te bouwen in het genoom van de gastheer. Een virale vector is een gemodificeerd virus dat zo geconstucteerd is dat het als drager van een therapeutisch gen dient. Dit houdt in dat voor gentherapeutische doeleinden een expressiecassette, bestaande uit een promoter gevolgd door een gen coderend voor een therapeutisch eiwit, een of meer genen van het virale genoom vervangt. Deze veranderingen zorgen ervoor dat een virale vector zichzelf niet reproduceert en dus ook niet pathogeen is, maar nog wel in staat is om exogeen genetisch materiaal door middel van transductie van een cel tot expressie te laten komen. Het doel van de experimenten beschreven in dit proefschrift was het onderzoeken of het stimuleren van regeneratie van beschadigde zenuwbanen in het CZS, met name die van het ruggenmerg, mogelijk is met behulp van lentivirale vector gemediëerde gentherapie voor neurotrofe eiwitten. Tot op heden is er geen behandeling mogelijk die het beschadigd ruggenmerg (dwarslaesie) herstelt en beperkt de directe behandeling in de kliniek zich vooral tot het voorkomen van secondaire schade door het toedienen van ontstekingsremmers. Hoewel in het cellichaam van CZS zenuwcellen met beschadigde zenuwvezels in de eerste dagen na een laesie, een regeneratieve genexpressie respons wordt geïnitieerd, is de beschadigde vezel niet in staat te regenereren. Dit wordt mede veroorzaakt door uitgroei-inhiberende moleculen die worden uitgescheiden door cellen van het littekenweefsel dat onstaat na een laesie in het CZS. Daarnaast vormt het littekenweefsel ook een fysieke barrière waar zenuwvezels niet doorheen kunnen groeien. Bovendien is er ook een tekort aan groei-ondersteuning van neurotrofe factoren. Als gevolg van deze omstandigheden treed er dus ook geen herstel op van de contacten met (nog steeds aanwezige) zenuwcellen beneden de laesie. Dit falen van spontane regeneratie en contactherstel binnen het ruggenmerg als deel van het CZS is in tegenstelling tot wat in het perifere zenuwstelsel (PZS) kan worden waargenomen. Beschadigde 183

4 axonen van een zenuw die niet volledig doorsneden is regenereren spontaan en kunnen na verloop van tijd perifere organen en weefsel weer innerveren mede door de aanwezigheid van neurotrofe ondersteuning in het PZS. Virale vector gemediëerde gentransfer van neurotrofines, eiwitten die door binding aan hun receptoren zenuwuitgroei induceren, is een veelbelovende manier om in het beschadigde CZS regeneratie te induceren of te stimuleren. In dit proefschrift onderzochten wij i) of gentransfer met behulp van lentivirale vectoren in het beschadigde CZS mogelijk is (gentransfer van een reportereiwit, in twee verschillende rattenmodellen voor CZS schade) en vervolgens ii) of lentiviraal gemedieerde overexpressie van neurotrofe eiwitten regeneratie van beschadigde zenuwbanen helpt stimuleren in heruitgroei en daarmee in functioneel herstel van de CZS schade. In hoofdstuk 1 wordt in het kort het probleem van CZS beschadiging en dan met name van schade aan het ruggenmerg uiteengezet. Neurotrofines worden geintroduceerd als eiwitten die in het beschadigde CZS toegediend kunnen worden om neuroprotectie te bieden en vooral neuroregeneratie te bevorderen. Ook wordt een overzicht gegeven van verschillende wijzen waarop neurotrofines kunnen worden toegediend in het beschadigde CZS. Hoofdzakelijk wordt in het hoofdstuk virale vector gemediëerde gentransfer als veelbelovende toedieningsmethode van neurotrofines besproken en worden twee manieren van gentherapie besproken. Ten eerste de directe injectie van virale vectoren in het beschadigde ruggenmerg. Dit moet resulteren in een lokale en constante expressie van neurotrofines. De vier meest gebruikte virale vectoren typen komen hierbij aan bod, namelijk de herpes simplex virale (HSV) vector, de adenovirale (AdV) vector, de adeno-geassocieerde virale vector (AAV) en de lentivirale (LV) vector. Ten tweede wordt de zogenaamde ex vivo gentherapie voor neurotrofines in het beschadigde ruggenmerg besproken. Hierbij worden gekweekte of vers uitgeprepareerde cellen (of weefselfragmenten) met behulp van virale vectoren genetisch gemodificeerd zodat zij neurotrofines gaan uitscheiden en vervolgens geïmplanteerd op de plaats waar de neurotrofines nodig zouden zijn voor neuroregeneratie. Veelgebruikte celtypen voor ex vivo gentherapie zijn Schwann cellen (afkomstig uit het PZS) en olfactory ensheathing cells (OECs, afkomstig uit het olfactorische systeem van het CZS). Van deze celtypen was al bekend dat wanneer zij worden geimplanteerd in het beschadigde ruggenmerg zij een substraat vormen dat uitgroei van zenuwvezels bevordert. Door nu juist deze celtypen genetisch te modificeren en neurotrofines te laten uitscheiden, zou het regeneratiebevorderend vermogen van deze celimplantaten toenemen. Hoofdstuk 2 bevat de resultaten van onderzoek naar spontaan herstel van het gebruik van de achterpoot na incomplete dwarslaesies bij de rat. Het effect van doorsnijding van de dorsale component van de corticospinale baan en van de 184

5 rubrospinale baan afzonderlijk, en van doorsnijding van beiden, werd onderzocht met een aantal tests van de achterpootfunctie van de rat. Doorsnijding van de dorsale component van de corticospinale baan sorteerde slechts een klein negatief effect op de achterpootfunctie. Dit effect kan worden verklaard door de aanwezigheid van de intacte ventrale component van de corticospinale baan, welke na een laesie collateralen vormt en inter- en motoneuronen in het ruggenmerg innerveren. Bovendien bleek dat doorgesneden zenuwbanen van de dorsale component veel collaterale sprouts vormden boven de laesie, welke op hun beurt projecteerden naar neuronen in de grijze stof dat niet door de laesie was aangedaan. Doorsnijding van de rubrospinale baan resulteerde in een onmiddelijk sterk verlies van achterpootfunctie, dat de weken daarna significant verbeterde en na 32 weken zelfs op normaal niveau leek terug te keren. Een doorsnijding van beide banen resulteerde in een dramatisch verlies van de achterpootfunctie dat weliswaar gedeeltelijk herstelde in de weken daarna maar uiteindelijk in een permanent defect resulteerde. Deze resultaten tonen een belangrijke mate van plasticiteit van het CZS aan, maar ook dat wanneer er teveel weefsel in het ruggenmerg beschadigd is, spontaan functioneel herstel niet of nauwelijks optreedt. In hoofdstuk 3 wordt de transductie van littekenweefsel, dat ontstaat na een laesie in het ruggenmerg van de rat onderzocht met behulp van een LV vector met een gen coderend voor het reportereiwit green fluorescent protein (GFP). Hoewel de LV vector een vector is die praktisch elk celtype kan transduceren, vonden wij dat het hart van het littekenweefsel, voornamelijk bestaande uit meningeale fibroblasten, niet werd getransduceerd. Dit in tegenstelling tot in vitro experimenten waarin meningeale fibroblasten wel met hoge efficiëntie worden getransduceerd met deze LV vector. In tegenstelling tot de meningeale fibroblasten, werden astrocyten, een ander celtype in het littekenweefsel, wel efficient getransduceerd door de LV vector. Dit biedt de mogelijkheid om astrocyten in littekenweefsel te transduceren met een gen coderend voor een neurotrofe factor. Als gevolg van deze transductie zullen de astrocyten neurotrofe factor gaan uitscheiden wat tot een verbeterde neurotrofe ondersteuning op de plek van de laesie zou kunnen leiden en zo een mogelijke verbeterde regeneratie van beschadigde zenuwvezels. In hoofdstuk 4 werd in een oogzenuwschademodel, eveneens een model voor CZS schade, onderzocht of doorsneden oogzenuwvezels beter konden regenereren in een perifere zenuwimplantaat gebruikt om de continuïteit van die oogzenuw weer te herstellen als een LV vector werd gebruikt voor de overexpressie van de neurotrofe factor ciliary neurotrophic factor (CNTF). Hiertoe werd het geïmplanteerde zenuwbruggetje ex vivo getransduceerd met LV-CNTF waarbij Schwann cellen in het perifere zenuwimplantaat biologisch actief CNTF gaan uitscheiden. Dit resulteerde in deze studie in een verbeterde overleving van oogzenuwcellen en verbeterde 185

6 regeneratie van de beschadigde oogzenuwvezels in het perifere zenuwimplantaat. Het gebruik van een perifeer zenuwimplantaat gecombineerd met ex vivo gentransfer met een neurotrofe factor kan dus in het beschadigde CZS helpen de regeneratie van beschadigde zenuwvezels te verbeteren. In hoofdstuk 5 en 6 wordt het gebruik van het perifeer zenuwimplantaat in combinatie met ex vivo gentransfer onderzocht in een ander CZS schademodel, namelijk het ventrale wortelavulsiemodel in de rat. Bij een ventrale wortelavulsie worden de axonale projecties van de motorneuronen van het ruggenmerg die projecteren naar bijvoorbeeld de spieren verbroken, waardoor deze zenuwcellen atrofiëren of afsterven. Door de geavulseerde wortel opnieuw in het ruggenmerg vast te hechten, hetzij middels een perifeer zenuwbruggetje of door de distale stomp direct in het ruggemerg te steken, overleven de beschadigde motoneuronen beter en kunnen motoraxonen opnieuw uitgroeien richting spieren. Ook hier zou LV vector gemediëerde gentransfer van de teruggeplaatste wortel of van het perifeer zenuwimplantaat een verbetering van de motoneuronoverleving en van de regeneratieve zenuwvezelgroei kunnen bewerkstelligen. In hoofdstuk 5 werden in dit wortelavulsie en -herstelmodel i) een perifeer zenuwimplantaat (zenuwbruggetje) of ii) de geavulseerde wortel getransduceerd met een LV vector coderend voor een gen voor het reportereiwit GFP (LV-GFP). Na reïnsertie van zowel het getransduceerde zenuwbruggetje als de ventrale wortel bleek dat de expressie van het GFP na 2 weken zwakker werd en na 4 weken zelfs praktisch geheel was uitgedoofd. Omdat er naast LV-GFP getransduceerde cellen ook GFP positieve macrofagen aanwezig waren, werd geconcludeerd dat door de aanwezigheid van het lichaamsvreemde eiwit GFP, de cellen met dit eiwit door het immuunsysteem werden opgeruimd en daarmee de GFP expressie verdween. Om te zien of dit inderdaad het geval was, werd een zogenaamd GlyAla repeat uit het Epstein Barr virus gefuseerd met het GFP gen en ingebouwd in de LV vector (LV-GArGFP). Door deze Gly-Ala repeat wordt het GFP niet meer door het immuunsysteem herkend en kan dus langdurige expressie worden bereikt alsof het een endogeen eiwit zou zijn. Na transductie en reïnsertie van de LV-GArGFP geavulseerde ventrale wortel bleek dat de Schwanncellen van de ventrale wortel inderdaad langdurig en tot zelfs 4 maanden GFP tot expressie brachten. De resultaten tonen aan dat gentransfer van een lichaamsvreemd eiwit in het PZS kan leiden tot een immuunrespons dat cellen met een exogeen eiwit opruimt, in tegenstelling tot in het CZS waar bijvoorbeeld GFP tot expressie gebracht kan worden zonder dat er een immunrespons tegen het exogene eiwit wordt gevonden. Het toont ook dat een endogeen (lichaamseigen) eiwit waarschijnlijk wel langdurig tot expressie kan worden gebracht en dat het GArGFP transgen in dierexperimenten als controle of reportergen moet worden gebruikt. 186

7 In hoofstuk 6 zijn in vivo LV vector gemediëerde gentransfer voor neurotrofe factoren en directe reïnsertie van de geavulseerde wortel gecombineerd in een rattenstudie. Voordat de geavulseerde wortel in het ruggenmerg werd teruggestoken, werd een LV vector met een gen coderend voor het neurotrofine brain-derived neurotrophic factor (LV-BDNF) of glial cell-line derived neurotrophic factor (LV-GDNF) in de wortel geïnjecteerd. Op deze wijze werd getracht beschadigde motoraxonen beter te laten regenereren in de aangehechte ventrale wortel. Zodra de motoraxonen de ventrale wortel massaler ingroeien door de groeibevordering van het GDNF of het BDNF, zouden zij meer en verder de wortel ingroeien om uiteindelijk tot aan hun oorspronkelijke doelorganen te regenereren. Echter in de experimentele groep met BDNF overexpressie werd geen effect gevonden op de overleving van de motoneuronen in het ruggenmerg en op de motoraxonregeneratie vergeleken met de LV-GArGFP controlegroep. In de groep behandeld met LV-GDNF werd wel verbeterde motoneuronoverleving gevonden en bovendien groeiden veel meer motoraxonen vanuit het ruggenmerg de opnieuw aangehechte ventrale wortel in. Echter, geregenereerde motoneuronvezels aangekomen in het LV-GDNF getransduceerde gebied van de ventrale wortel, vormden spiraalvormige structuren en motoraxonen groeiden niet voorbij het gebied met GDNF expressie. Als gevolg daarvan vond er ook geen (beter) functioneel herstel plaats. De resultaten behaald in deze studie laten zien dat stimulatie van overleving en regeneratie van beschadigde motoneuronen mogelijk is met virale vector gemediëerde gentherapie van GDNF, maar dat expressie van de neurotrofine gereguleerd moet kunnen worden om motoneuronvezels verder distaal de ventrale wortel in te laten groeien. Tot slot worden in hoofdstuk 7 mogelijkheden tot verbetering van virale vector gemediëerde gentransfer van neurotrofines naar het beschadigde CZS besproken. Gebleken is dat AAV en LV vectoren geen additionele CZS schade aanrichten door expressie van virale componenten/eiwitten en dus een goed vector systeem vormen voor uiteindelijke toepassing als gentherapeuticum. Waar met name verder aan ontwikkeld moet worden, is het reguleerbaar maken van genexpressie door gebruik te maken van induceerbare promoters in de virale vectoren. Een ander punt van verder onderzoek is het celspecifiek maken van virale vectoren. Om gentransfer in een bepaald celtype van het CZS toe te passen kan bijvoorbeeld een celspecifieke promoter gebruikt worden of kan gebruik worden gemaakt van eiwitmantels van virussen die een bepaald celtype wel of niet infecteren (dit wordt ook wel pseudotyping genoemd). Met deze technische aanpassingen van de verschillende vector systemen maar natuurlijk ook met de identificatie van additionele genen/ eiwitten die specifiek betrokken zijn bij de neuroregeneratie van bepaalde zenuwweefselschade, zullen virale vectoren een steeds belangrijker gereedschap zijn in handen van wetenschappers die onderzoek doen naar neuroregeneratie. 187