Catharanthus roseus (de roze maagdenpalm) is één van de best bestudeerde medicinale planten. Deze plant bevat een belangrijke klasse van secundaire

Transcriptie

1 Samenvatting

2 Catharanthus roseus (de roze maagdenpalm) is één van de best bestudeerde medicinale planten. Deze plant bevat een belangrijke klasse van secundaire metabolieten, de terpenoïde indoolalkaloïden (TIA). Van de meer dan 130 verschillende TIA verbindingen die van C. roseus beschreven zijn, is een groot deel getest op farmacologische activiteit, wat geresulteerd heeft in een aantal geneesmiddelen die nu op de markt zijn. De bis-indoolalkaloïden vincristine and vinblastine zijn effectieve geneesmiddelen tegen verschillende typen van kanker (van der Heijden et al., 2004). De hoeveelheden van deze verbindingen in de plant zijn laag en daarom zijn ze moeilijk te isoleren (Scott et al., 1979; De Luca and Laflamme, 2001). Plantencelcultures zijn een mogelijke alternatieve bron voor deze stoffen en hebben als voordeel dat ze niet beïnvloed worden door omgevingsfactoren zoals klimaat en seizoen, ziekten, en geografische beperkingen. Helaas is de productie van secundaire metabolieten in celcultures zeer laag, waarschijnlijk door beperkingen op het niveau van de regulatie, wat natuurlijk een barrière is voor commercieel gebruik van celcultures (Verpoorte et al., 2000). Door middel van veranderingen in de samenstelling van het groeimedium of door toevoeging van inducerende stoffen is geprobeerd om de productie van secundaire metabolieten te verbeteren, maar dat was maar in zeer beperkte mate succesvol. Metabolic engineering zou de mogelijkheid kunnen bieden om de beperkingen in de productiecapaciteit op te lossen. Hiervoor is klonering van genen die coderen voor enzymen betrokken bij TIA biosynthese een noodzakelijke vereiste. De klassieke strategie om genen coderend voor enzymen te kloneren is om de enzymen op te zuiveren uit alkaloïdenproducerend plantenweefsel via een aantal chromatografische stappen aan de hand van een enzymatische test, en om dan peptidensequenties te bepalen of specifieke antilichamen op te wekken als gereedschap voor genklonering. Zo zijn een flink aantal genen gekloneerd. Maar de methode is bewerkelijk en soms zijn enzymen zeer moeilijk op te zuiveren. Een recente trend is om de zuiveringstap over te slaan, en om direct kandidaat-genen te kloneren door het expressiepatroon te correleren met metabolietaccumulatie of door in sequentiecollecties te zoeken op gelijkenissen met enzymen (Hashimoto and Yamada, 2003). Klonering op basis van gelijkenis gevolgd door een functionele test was ook succesvol voor een aantal genen uit de TIA biosynthese. Een alternatieve methode kan ook nog zijn om te zoeken naar genen met een veranderd expressiepatroon in planten die zodanig gemuteerd zijn dat ze geen TIAs produceren, maar zulke mutanten bestaan niet voor C. roseus. Wel zijn er twee transcriptiefactoren, ORCA2 en ORCA3 geheten, beschreven die de methyl-jasmonzuur (MeJA)-responsieve expressie reguleren van minstens de helft van de bekende genen betrokken bij TIA biosynthese. Het is zeer aannemelijk dat deze ORCAs ook andere nog onbekende genen uit de TIA biosynthese reguleren. Het doel van het onderzoek beschreven in dit proefschrift was om te verkennen of het mogelijk is om zulke onbekende genen te isoleren door gebruik te maken van transgene celcultures die ORCA2 of ORCA3 op induceerbare wijze tot expressie brengen. Er is gekozen voor induceerbare expressie omdat constitutieve expressie toxische effecten zou kunnen hebben en zou kunnen leiden tot de activering van regulatoire feedbacksystemen en/ of tot massale verschuivingen in de expressie van irrelevante genen. Bovendien worden in een induceerbaar systeem verschillen in genexpressie bepaald in dezelfde genetische achtergrond, en verhoogt induceerbare expressie de waarschijnlijkheid dat primaire doelwitgenen van de ORCAs 122

3 Samenvatting gevonden worden. Hoofdstuk 2 beschrijft de analyse van de transcriptieprofielen van cellijnen die de ORCAs op induceerbare wijze tot expressie brengen. Door gebruik te maken van de cdna-ge-amplificeerde fragment lengte polymorfisme (cdna-aflp) techniek konden de accumulatiepatronen van 11,277 transcripten op kwantitatieve wijze bepaald worden. Een totaal aantal van 1874 transcripten kwam differentieel tot expressie bij vergelijking van cellijnen en behandelingen. Omdat de ORCAs positieve regulatoren zijn van de TIA biosyntheseroute, is bij de verdere analyse van de transcriptfragmenten de aandacht gericht op die transcripten die hoger tot expressie kwamen in ORCA cellijnen behandeld met de inducerende stof estradiol dan in controle cellijnen of na een controlebehandeling. Deze selectie resulteerde in fragmenten van 74 transcripten, waarvan er 36 hoger tot expressie kwamen in zowel ORCA2 als ORCA3 cellijnen, en respectievelijk 22 en 16 specifiek in ORCA2 en ORCA3 cellijnen. Vergelijking van de sequenties van deze 74 fragmenten met de NCBI DNA database met behulp van het BLAST algoritme leverde 17 (22%) perfecte overeenkomsten op met bekende C. roseus sequenties. Dit betekend dat de grote meerderheid van de fragmenten overeenkomen met onbekende C. roseus genen. Van veel van deze sequenties wordt voorspeld dat ze coderen voor enzymen, maar het is niet zo eenvoudig om aan te wijzen waar deze enzymen dan actief zijn in de TIA biosyntheseroute. We hadden het idee dat bepaling van de metabolietprofielen van de ORCA cellijnen behulpzaam zou kunnen zijn om specifieke functies aan te wijzen voor de voorspelde enzymen. In Hoofdstuk 3 wordt de analyse van metabolieten in de ORCA cellijnen beschreven. Verhoogde expressie van de ORCAs alleen had geen meetbaar effect op de accumulatie van metabolieten. Combinatie van verhoogde expressie met toevoeging van de TIA precursors loganine en tryptamine aan het groeimedium bracht wel meetbare veranderingen in de accumulatie van metabolieten teweeg. Toevoegen van alleen precursors zonder verhoogde expressie van ORCAs leidde tot ophoping van strictosidine, de centrale precursor voor alle TIAs. De ophoping van andere TIA producten werd op verschillende wijze beïnvloed door verhoogde expressie van één van beide ORCAs, waardoor het mogelijk werd om te voorspellen in welke set van cdna-aflp fragmenten de genen voor de betreffende enzymen gezocht moesten worden. De ophoping van catharanthine werd alleen waargenomen na verhoogde expressie van ORCA3, hetgeen aangeeft dat genen overeenkomend met de biosyntheseroute voor catharanthine gezocht moeten worden in de set transcripten die alleen door ORCA3 gereguleerd worden. Ajmalicine daarentegen werd aangetroffen na verhoogde expressie van zowel ORCA2 als ORCA3, en daarom moet het gen voor ajmalicine biosynthese dus gezocht worden tussen de transcripten die door beide ORCAs gereguleerd worden. In de literatuur is beschreven dat een NADPH-afhankelijk oxidoreductase cathenamine reduceert tot ajmalicine (Stoeckigt et al., 1983). De set transcripten die door beide ORCAs gereguleerd werden bevat het fragment CR-75 dat na zoeken in de DNA database met behulp van het TBLASTX algoritme gelijkenis vertoonde met NADPH-afhankelijke oxidoreductases. Om aan te tonen dat het enzym dat overeenkomt met fragment CR-75 cathenamine reductase (CR) is, hebben we het complete CR-75 cdna geïsoleerd en de functionele analyse er van is beschreven in Hoofdstuk 4. Northern blot analyse van het expressiepatroon bevestigde dat 123

4 CR-75 transcripten accumuleerden na verhoogde expressie van ORCA2 of ORCA3 en liet ook accumulatie zien na toevoeging van MeJA of gistelicitor aan celcultures. Alle bekende genen van de TIA biosyntheseroute komen tot expressie na toevoeging van MeJA (Hoofdstuk 2), en daarom is het expressiepatroon van CR-75 transcripten in overeenstemming met een rol van het overeenkomstige enzym in TIA biosynthese. Om biochemisch aan te tonen dat het CR-75 enzym CR activiteit vertoont, werd het eiwit geproduceerd in de darmbacterie Escherichia coli met een Strep tag aan het N-terminale uiteinde en een His tag aan het C-terminale uiteinde. Het substraat cathenamine is zeer instabiel en kan daarom niet in zuivere vorm verkregen worden aangezien het in evenwicht verkeert met 4,21-dehydrogeissoschizine. Om een preparaat dat cathenamine bevat te verkrijgen, werd tryptamine enzymatisch gekoppeld aan secologanine met behulp van strictosidine synthase. Het gevormde strictosidine werd vervolgens geïncubeerd met een ruw eiwitextract van C. roseus cellen, dat hoge strictosidine β-d-glucosidase enzymactiviteit bevat. Toen de producten van deze reactie als een bron van substraat gebruikt werden in de CR enzymtest, kon worden geconstateerd dat er ajmalicine gevormd werd afhankelijk van de toevoeging van NADPH, waarmee dus is aangetoond dat het CR-75 enzym cathenamine reductase activiteit heeft. In Hoofdstuk 5 wordt de isolatie en karakterisering van alcohol dehydrogenase genen van C. roseus beschreven, die zouden kunnen coderen voor 10-hydroxygeraniol oxidoreductases (10HGO). In de transcriptoom-analyse beschreven in Hoofdstuk 2 werd het cdna-aflp fragment CR-36 gevonden, dat overeenkomt met een mrna waarvan de accumulatie werd gereguleerd door zowel ORCA2 als ORCA3. Zoeken met TBLASTX in de DNA database leverde op dat het eiwit waarvoor CR-36 voorspeld werd te coderen een overeenkomst van 64 % had met een voorspeld eiwit dat geannoteerd was als Cr10HGO (Accessie no AY352047). In een cdna-aflp analyse van C. roseus cellen van andere onderzoekers werd hetzelfde fragment gevonden, dat in die studie CRG258 genoemd is. Het betreffende mrna kwam verhoogd tot expressie na toediening van MeJA en het expressiepatroon was hetzelfde als van de bekende TIA genen (Rischer et al., 2006). De regulatie van CR-36 mrna accumulatie door ORCA2 en ORCA3, de respons op MeJA, en vooral de gelijkenis met een eiwit geannoteerd als 10HGO duidt er op dat CR-36 eiwit 10HGO activiteit heeft. Tijdens de isolatie van een compleet cdna werd bij toeval ook een ander cdna geïsoleerd, dat CR-36-1 genoemd is, en dat voor 96% dezelfde nt sequentie heeft als CR-36. In totaal stonden er dus 3 verwante genen uit C. roseus ter beschikking, namelijk CR-36, CR-36-1 en het gen coderend voor een eiwit geannoteerd als 10HGO. Een interessant gegeven is dat alleen CR-36 mrna accumulatie beïnvloed werd door ORCAs en door toediening van MeJA. De omzetting van 10-hydroxygeraniol naar 10-oxogeranial is toegeschreven aan een alcohol dehydrogenase in R. serpentina cellen (Ikeda et al., 1991). Het ligt voor de hand dat eenzelfde reactie optreedt in C. roseus. De CR-36-1 en CR-36 eiwitten, en het mogelijke 10HGO behoren tot de alcohol dehydrogenase familie en de katalytisch belangrijke aminozuren zijn geconserveerd in alle drie eiwitten. Alle drie recombinanteiwitten konden 10-hydroxygeraniol gebruiken als substraat om NADP + te reduceren. Wat de precieze substraatspecificiteit is en wat de gevormde producten zijn moet nog uitgezocht worden. Hoofdstuk 6 beschrijft de karakterisering van complete cdnas die mogelijk coderen voor enzymen uit de TIA biosynthese. Eén kandidaat-gen wordt vertegenwoordigd door cdna-aflp 124

5 Samenvatting fragment CR-93, dat afkomstig is van een transcript waarvan de accumulatie door zowel ORCA2 als ORCA3 wordt gereguleerd. Zoeken met TBLASTX leverde gelijkenis op met polyneuridine aldehyde esterase (PNAE). PNAE katalyseert de omzetting van polyneuridine aldehyde naar epi-vellosimine bij de biosynthese van de TIAs ajmaline en sarpagine in R. serpentina (Dogru et al., 2000). Ajmaline /sarpagine type alkaloïden worden door C. roseus niet gemaakt, maar een vergelijkbare reactie zou kunnen plaats vinden bij de biosynthese van TIAs in deze plant. Het complete cdna overeenkomend met het CR-93 fragment is geïsoleerd. Northern blot analyse van de expressie bevestigde regulatie door zowel ORCA2 als ORCA3 en liet ook een positief effect zien van MeJA. Er is nog getest of recombinant CR-93 eiwit als esterase werkte op de substraten MeJA en geranyl acetaat, maar dat was niet het geval. Het is mogelijk dat CR-93 eiwit een rol in TIA biosynthese speelt die vergelijkbaar is met de rol die PNAE speelt in ajmaline biosynthese in R. serpentina, al kan hiervoor geen concrete enzymatische stap aangewezen worden cdna-aflp fragment CR-65 kwam overeen met een mrna waarvan de accumulatie alleen werd gereguleerd door ORCA2. Zoeken met TBLASTX in de DNA database leverde op dat het overeenkomstige eiwit behoort tot de carboxylesterase superfamilie. Bij de bepaling van metabolieten in de ORCA cellijnen zijn wel TIAs gevonden die alleen ophoopten na verhoogde expressie van ORCA3, maar dit was niet het geval voor ORCA2. Het bestaan van een gen dat voor een enzym codeert en dat alleen door ORCA2 gereguleerd wordt geeft aan dat er wel TIAs zouden kunnen bestaan waarvan de biosynthese alleen door ORCA2 gereguleerd wordt. Het complete cdna overeenkomend met het CR-65 fragment is geïsoleerd. Northern blot analyse van de expressie bevestigde regulatie door ORCA2 en liet ook een positief effect zien van MeJA. Het eiwit waarvoor het complete cdna codeert behoort tot de carboxylesterase superfamilie met de hoogste gelijkenis met 2-hydroxyisoflavanone dehydratase van Glycyrrhiza echinata. Terugkijkend kan gesteld worden dat de strategie om nieuwe genen betrokken bij TIA biosynthese te isoleren door gebruik te maken van de ORCA transcriptiefactoren werkt. Het is gelukt om voor twee van de ORCA doelwitgenen aan te tonen dat ze coderen voor enzymen uit de TIA biosyntheseroute. Het is best mogelijk dat een meerderheid van de ontbrekende enzymen vertegenwoordigd is in onze collectie van cdna-aflp fragmenten. In feite is één van de grootste beperkingen in de toekenning van functies aan enzymen de gebrekkige kennis over sommige delen van de TIA biosyntheseroute wat betreft metabole intermediairen en mogelijke reactiemechanismen. Een andere belangrijke beperking is dat de meeste TIAs niet commercieel verkrijgbaar zijn en moeilijk te maken zijn via organische synthese, wat functionele tests verhindert. 125

6 Referenties De Luca V, Laflamme P (2001) The expanding universe of alkaloid biosynthesis. Curr.Opin. Plant Biol. 4: Dogru E, Warzecha H, Seibel F, Haebel S, Lottspeich F, Stöckigt J (2000) The gene encoding polyneuridine aldehyde esterase of monoterpenoid indole alkaloid biosynthesis in plants is an ortholog of the α/β hydrolase super family. Eur. J. Biochem. 267: Hashimoto T, Yamada Y (2003) New genes in alkaloid metabolism and transport. Curr. Opin. Biotech. 14: Ikeda H, Esaki N, Nakai S, Hashimoto K, Uesato S, Soda K, Fujita T (1991) Acyclic Monoterpene Primary Alcohol:NADP + oxidoreductase of Rauwolfia serpentina cells: The key enzyme in biosynthesis of monoterpene alcohols. J. Biochem. 109: Rischer H, Oresic M, Seppanen-Laakso T, Katajamaa M, Lammertyn F, Ardiles-Diaz W, Van Montagu MCE, Inze D, Oksman-Caldentey KM, Goossens A (2006) Gene-to-metabolite networks for terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: Scott AI, Mizukami H, Lee SL (1979) Characterization of a 5-methyltryptophan resistant strain of Catharanthus roseus cultured cells. Phytochemistry 18: Stoeckigt J, Hemscheidt T, Hoefle G, Heinstein P, Formacek V (1983) Steric course of hydrogen transfer during enzymatic formation of 3.alpha.-heteroyohimbine alkaloids. Biochemistry 22: van der Heijden R, Jacobs DI, Snoeijer W, Hallard D, Verpoorte R (2004) The Catharanthus alkaloids: Pharmacognosy and biotechnology. Curr. Med. Chem. 11: Verpoorte R, van der Heijden R, Memelink J (2000) Engineering the plant cell factory for secondary metabolite production. Transgenic Res. 9: