Dissecting Lyme borreliosis; Clinical aspects, pathogenesis and prevention Coumou, J.

Transcriptie

1 UvA-DARE (Digital Academic Repository) Dissecting Lyme borreliosis; Clinical aspects, pathogenesis and prevention Coumou, J. Link to publication Citation for published version (APA): Coumou, J. (2016). Dissecting Lyme borreliosis; Clinical aspects, pathogenesis and prevention s- Hertogenbosch: Boxpress General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam ( Download date: 01 Aug 2017

2 voor nietingewijden Aangepast van: Ned Tijdschr Tandheelkd Jun;118(6):310-6.

3 De ziekte van Lyme ontleed; Klinische aspecten, pathogenese en preventie De ziekte van Lyme, of Lyme-borreliose, is een door teken overdraagbare ziekte die voornamelijk voorkomt in het noordoosten van de Verenigde Staten en Europa. De ziekte is vernoemd naar het Amerikaanse dorp Old Lyme. Hier werd in de jaren 70 van de vorige eeuw het verband ontdekt tussen tekenbeten en een groep kinderen met gewrichtsklachten [260]. Zeven jaar later werd de bacteriële verwekker Borrelia burgdorferi ontdekt [32]. In de Verenigde Staten komt alleen Borrelia burgdorferi sensu stricto voor, terwijl in Europa vooral Borrelia garinii en Borrelia afzelii voorkomen [256]. Na ongeveer 40 jaar onderzoek is er een goed beeld verkregen van de ziekteverschijnselen, hoe de ziekte ontstaat en zijn er verschillende mogelijkheden onderzocht om de ziekte te voorkómen. In dit proefschrift worden drie thema s over Lyme borreliose verder onderzocht, namelijk klinische aspecten (hoofdstuk 2-3), pathogenese (hoofdstuk 4-6) en preventie (hoofdstuk 7-9). Hoofdstuk 1 dient als een inleiding tot dit proefschrift waarin de ecologie van teken, de pathogenese (wijze van ontstaan van de ziekte) en de klinische manifestaties inclusief diagnostiek en therapie worden besproken. Deel 1: Klinische aspecten van de ziekte van Lyme Samenvattend is de diagnose van de verschillende stadia van de ziekte van Lyme gebaseerd op een mogelijke expositie aan teken, het optreden van bepaalde klinische symptomen, uitsluiten van andere oorzaken, al dan niet gecombineerd met serologisch onderzoek en andere diagnostische testen. De meest voorkomende vorm van de ziekte van Lyme is erythema migrans (EM), een uitbreidende huidafwijking (de zogeheten rode kring ) die een aantal dagen na een tekenbeet kan ontstaan. Daarnaast kan de ziekte zich manifesteren in verschillende organen zoals het zenuwstelsel, gewrichten en andere locaties in de huid wanneer Borrelia zich hier naar uitbreidt (dissemineren). Het Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu (RIVM) schat dat Nederlandse huisartsen in 2014 de diagnose erythema migrans keer hebben gesteld [105]. De diagnose gedissemineerde Lyme of late vormen van Lyme werd in 2014 ongeveer 1400 keer vastgesteld [104]. Dit komt overeen met 147 nieuwe gevallen per jaar per inwoners. Dit cijfer is gestegen vergeleken met 40 nieuwe gevallen in 1994, 78 in 2001, 100 in 2005 en 133 in 2009 [106]. Een overzicht van aanbevolen diagnostiek, met vermelding van de sensitiviteit - de kans dat een zieke persoon een positieve test heeft - en behandeling per Lyme manifestatie wordt beschreven in hoofdstuk

4 De waarde van serologische testen in de praktijk In de afwezigheid van specifieke klinische symptomen (hoofdstuk 1) staat de aanwezigheid van anti-borrelia antilichamen niet gelijk aan een actieve Borrelia infectie. De specificiteit van testen, mede vanwege het feit dat 4-8 % van de Nederlandse populatie positieve antistoffen heeft tegen Borrelia, kan een probleem vormen, zeker wanneer op onjuiste gronden serologie wordt aangevraagd. Door verschillende richtlijnen, waaronder de Centraal Begeleidings Orgaan (CBO) richtlijn uit 2013 en de richtlijn van de Infectious Diseases Society of America uit 2006 [1, 298], wordt afgeraden om bij een lage verdenking op de ziekte van Lyme te testen op antilichamen tegen Borrelia, vanwege het hoge percentage foutpositieven ; dat wil zeggen individuen met positieve serologie, echter zonder de ziekte van Lyme [147]. In hoofdstuk 2 demonstreren we dat in de praktijk echter het merendeel van de testen dat wordt aangevraagd door huisartsen afkomstig is van individuen met een lage vooraf kans op het hebben van de ziekte van Lyme gebaseerd op de klinische presentatie. We onderzochten de klinische informatie van 488 aanvragen voor serologische testen voor de ziekte van Lyme van een regionaal laboratorium en vonden dat 82 % van de aanvragen niet volgens de richtlijnen waren en dat in 70 % van de gevallen er geen sprake was van symptomen kenmerkend voor de ziekte van Lyme. Bij een positieve test uitslag zou in deze gevallen niet met voldoende zekerheid de diagnose ziekte van Lyme gesteld kunnen worden. De gerapporteerde klachten in de laatstgenoemde groep bestonden uit weinig kenmerkende symptomen die ook vaak voorkomen in de algemene populatie, zoals moeheid, spierpijn, hoofdpijn en gewrichtspijn. Uiteindelijk leveren de serologische testen maar in een klein deel van de onderzochte populatie een bijdrage aan het aantonen van LB. Het is belangrijk te vermelden dat ongeveer 5 % van de groep met aspecifieke klachten een positieve uitslag had, wat overeenkomt met de seropositiviteit in de algemene populatie. Het is onbekend of deze individuen ook daadwerkelijk antibiotica hebben gekregen, maar het is onwaarschijnlijk dat dit geholpen zou hebben. Daarnaast is het gebruik van antibiotica niet geheel zonder gevaren en kan het uitstellen van verdere diagnostiek naar andere onderliggende oorzaken schadelijk zijn. Gezien onze bevindingen is het raadzaam om meer voorlichting te geven aan artsen over de beperkte waarde van positieve serologische wanneer specifieke klinische symptomen voor de ziekte van Lyme afwezig zijn. Aan de andere kant is voorlichting wanneer wel te testen ook belangrijk opdat er geen patiënten worden gemist. 204

5 Het Amsterdams Multidisciplinair Lyme Centrum Het merendeel van de patiënten met de ziekte van Lyme wordt gediagnosticeerd en behandeld door huisartsen. Verwijzing naar de tweede of derde lijn kan in sommige gevallen echter noodzakelijk zijn. Redenen voor verwijzing kunnen een verdenking op gedissemineerde Lyme zijn, maar ook in geval van onduidelijke of dubieuze test uitslagen, atypische manifestaties van de ziekte van Lyme, een second opinion op verzoek van de patiënt of wanneer klachten blijven bestaan of zich ontwikkelen na antibiotische behandeling voor de ziekte van Lyme. Onderzoek heeft aangetoond dat persisterende klachten bij % van de behandelde Lymepatiënten voorkomen maar dat het vrijwel altijd weinig kenmerkende klachten betreft (zie boven). Dit complex van aspecifieke symptomen wordt ook wel het post-treatment Lyme borreliose syndrome (PTLBS) genoemd [76]. Verschillende studies hebben laten zien dat voor PTLBS additionele antibiotica kuren geen beklijvend effect hebben vergeleken met placebo [124, 130, 131, 141], en dat het dus niet aannemelijk is dat de klachten worden veroorzaakt door een persisterende Borrelia infectie. Echter, patiënten met PTLBS of personen met een foutpositieve serologische testuitslag en aspecifieke symptomen worden soms maanden tot jaren behandeld met (verschillende) antibiotica, soms zelfs intraveneus toegediend. Voor dergelijke behandelingen zijn geen wetenschappelijke gronden en ernstige bijwerkingen kunnen optreden [131, 141]. Een recente studie van het RIVM heeft laten zien dat er ongeveer patiënten zijn in Nederland met persisterende klachten die geassocieerd worden met de ziekte van Lyme [105]. Deze patiënten bleken een veel zwaardere ziektelast te hebben dan patiënten met EM of gedissemineerde Lymeziekte [284]. De mate van ziektelast en verminderde kwaliteit van leven in deze patiënten vragen om een uitgebreide evaluatie om andere oorzaken uit te sluiten en te onderzoeken of antibiotische behandeling voor de ziekte van Lyme inadequaat is geweest. Omdat de ziekte van Lyme meerdere orgaansystemen kan aandoen, worden deze patiënten vaak naar verschillende medisch specialisten doorverwezen. Ter verbetering van de zorg voor zowel patiënten met een verdenking van een actieve vorm van de ziekte van Lyme als voor patiënten die onbegrepen klachten houden na behandeling voor de ziekte van Lyme is in 2011 het Amsterdams Multidisciplinair Lyme Centrum (AMLC) opgericht in het AMC. Het AMLC is een derdelijns centrum en een samenwerking tussen de afdelingen Infectieziekten, Neurologie, Reumatologie, Dermatologie, Psychiatrie en Kindergeneeskunde en wordt ondersteund door de afdeling Medische Microbiologie. In hoofdstuk 3 205

6 beschrijven we de eerste 200 patiënten die gezien zijn in het AMLC. Het merendeel van deze patiënten had meerdere klachten die langdurig aanwezig waren, was vaak al naar meerdere specialisten geweest en was al eerder behandeld met antibiotica. Bij 120 van de 200 patiënten (60 %) werd na uitgebreid onderzoek vastgesteld dat hun klachten niet werden veroorzaakt door de ziekte van Lyme. Een aanzienlijk deel van deze patiënten heeft uiteindelijk een andere diagnose gekregen (43/120; 36 %). Dit waren uiteenlopende diagnoses, zoals andere infectieziekten, spierreuma, gevolgen van een onopgemerkte beroerte of zelfs multiple sclerose. Bij een klein deel van de 200 patiënten (32/200; 16 %) werd vastgesteld dat er sprake was van een actieve Borrelia infectie en in drie van de 200 gevallen (2 %) bestond na uitgebreid onderzoek een vermoeden van een mogelijke persisterende Borrelia infectie. In sommige gevallen waarin geen oorzaak gevonden kon worden en er geen verdenking (meer) was op de ziekte van Lyme, maar wel sprake was van aanzienlijke somatische problematiek, werd verwezen naar de Somatisch Onverklaarbare Lichamelijke Klachten polikliniek in het VU Medisch Centrum in Amsterdam. Gezien onze bevindingen heeft een derdelijns centrum voor de ziekte van Lyme een belangrijke functie om in complexe patiënten het vaststellen of uitsluiten van de ziekte van Lyme verder te onderzoeken. Het is in het belang van patiënten om dit in een multidisciplinair verband op te zetten met ervaren specialisten op het gebied van infectieziekten, neurologie, reumatologie en dermatologie. In zulke centra kan tevens klinisch en fundamenteel onderzoek worden uitgevoerd om bijvoorbeeld het fenomeen PTLBS beter te doorgronden. Daarvoor zijn ook patiënten met gedissemineerde ziekte van Lyme van groot belang. Huisartsen en specialisten in den lande kunnen dergelijke patiënten verwijzen voor onderzoek en klinische zorg. Deel 2: De pathogenese van Lyme borreliose In de Verenigde Staten wordt Borrelia overgebracht via de hertenteek, Ixodes scapularis, en in Europa wordt Borrelia verspreid via de schapenteek, Ixodes ricinus. Met het blote oog zijn deze teken nauwelijks van elkaar te onderscheiden. De teek kent drie stadia: larve, nimf en adult (volwassen). Na een bloedmaaltijd vervellen teken en ontwikkelen ze naar het volgend stadium. Er is vrijwel geen verticale Borrelia-transmissie (van moeder naar haar nakomelingen). Niet-geïnfecteerde tekenlarven of nimfen raken besmet door het nemen van een bloedmaal van dieren die met Borrelia zijn geïnfecteerd, vooral muizen maar ook andere knaagdieren en vogels. Met Borrelia geïnfecteerde nimfen of adulten kunnen vervolgens grotere 206

7 zoogdieren infecteren, waaronder reeën en mensen. Bij een duur van minder dan 24 uur wordt de kans op transmissie van Borrelia laag geacht. Dit heeft te maken met het feit dat migratie van Borrelia van de darm van de teek naar de speekselklieren, van waar de Borrelia-spirocheten kunnen worden overgebracht naar de mens, pas optreedt na uur. Teek-Borrelia interacties De speekselklieren hebben een belangrijke functie voor zowel de teek als Borrelia. In het speeksel zitten namelijk eiwitten die het immuunsysteem en de bloedstolling van de gastheer onderdrukken. Door onderdrukking van het immuunsysteem kan een teek zich wel tot zeven dagen vastbijten in de huid en bloed opnemen. Borrelia maakt ook slim gebruik van immuun onderdrukkende tekeneiwitten in het speeksel om de gastheer binnen te dringen. Zo is bekend dat Borrelia het teken speekseleiwit Salp15 kan binden en dat Borrelia hierdoor minder goed wordt herkend door afweercellen van de gastheer. Onderzoek naar tekeneiwitten (zoals Salp15) heeft tot een beter begrip geleid hoe de ziekte van Lyme tot stand komt (de pathogenese). Daarnaast kan onderzoek naar de moleculaire interacties tussen teek, Borrelia en de gastheer bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe strategieën om de ziekte te voorkómen. Zo is gebleken dat het vaccineren van muizen tegen Salp15 ervoor zorgt dat Borrelia minder goed wordt overgedragen door teken. Tenslotte geeft het onderzoek naar tekeneiwitten een inkijk in de afweerreactie van de gastheer in reactie op Borrelia. Tick Salivary Lectin Pathway Inhibitor Een eerdere promovendus uit onze groep, Tim Schuijt, maar ook anderen, hebben recent een succesvolle poging verricht om meer teken speekseleiwitten te identificeren die een belangrijke functie hebben voor de teek en Borrelia [235]. Uit deze zoektocht kwamen enkele tekeneiwitten die cruciaal bleken voor tekenvoeding, waaronder het eiwit P8. Behalve dat P8 belangrijk bleek voor de voeding van de teek werd ook geobserveerd dat P8 Borrelia beschermde tegen het afweersysteem van de gastheer. In de aanwezigheid van P8 werd Borrelia namelijk beschermd tegen humaan serum. Indien Borrelia in contact komt met bloed ontstaat er een afweerreactie van serum eiwitten die onderdeel uitmaken van het complement systeem, een van de aangeboren afweerreacties van de gastheer. Het complement systeem is een van de eerste afweerreacties van de gastheer en bestaat uit drie verschillende routes: de klassieke route, de lectine route en de alternatieve route. Elk van deze routes raakt op een andere manier geactiveerd maar activatie 207

8 van alle drie de routes leidt uiteindelijk tot het ontstaan van dezelfde afweerreacties, namelijk het vormen van eiwitcomplexen die poriën in de membraan van bacteriën maken waardoor ze doodgaan, het aantrekken van afweercellen naar de plek van ontsteking en het faciliteren van fagocytose (opeten) van bacteriën door afweercellen. In hoofdstuk 4 hebben we verder onderzocht hoe P8 precies het complement systeem remt en hiermee Borrelia beschermt. Onze bevindingen laten zien dat P8 specifiek de lectine route remt maar niet de klassieke route of alternatieve route van het complement systeem. Gezien deze functie hebben we P8 daarom een andere naam gegeven, namelijk Tick Salivary Lectin Pathway Inhibitor (TSLPI). Tot nu toe was niet bekend dat de lectine route een belangrijke rol heeft in de afweer tegen Borrelia. De lectine route wordt geactiveerd doordat lectines, waaronder Mannose Binding Lectin (MBL), suikerstructuren op de celmembraan van bacteriën kunnen herkennen. Bij verder onderzoek bleek dat TSLPI de lectine route remt door te voorkómen dat MBL kan binden aan Borrelia. Blokkering van de functie van MBL door TSLPI resulteerde in verminderde complement activatie waardoor Borrelia minder gedood werd door complement en zorgde er ook voor dat afweercellen Borrelia minder goed kon fagocyteren. Om te bevestigen dat TSLPI daadwerkelijk belangrijk is voor de transmissie van Borrelia naar de gastheer is gebruik gemaakt van een muizenmodel, waarmee het beloop van de Borrelia infectie van de teek naar de gastheer wordt onderzocht door Borrelia-geïnfecteerde teken te laten voeden op muizen. Met een speciale techniek RNA-interferentie wordt tijdens het voeden van teken de productie van TSLPI uitgeschakeld. We observeerden een lagere Borrelia-infectie in muizen waarop teken hadden gevoed waarbij TSLPI ontbrak. Een andere methode om de rol van TSLPI te onderzoeken is door muizen immuun te maken tegen TSLPI, waardoor anti-tslpi antilichamen de functie van TSLPI blokkeren. Borrelia bleek ook minder goed te worden overgedragen door teken wanneer deze voedden op TSLPI-immune muizen. Tenslotte, in hoofdstuk 5 hebben we tevens de TSLPI variant in de Europese teek, Ixodes ricinus, geïdentificeerd. Ook dit eiwit bleek MBL te remmen en zowel B. burgdorferi s.s. als B. garinii te beschermen. Concluderend laten onze bevindingen in hoofdstuk 4 en 5 zien dat TSLPI een belangrijke rol heeft in het ontstaan van de ziekte van Lyme. Tevens hebben we laten zien dat de lectine route een belangrijke rol heeft in de afweer tegen B. burgdorferi. 208

9 De rol van MBL in de afweer tegen Borrelia Gezien het bovengenoemde belang van de lectine route in de afweer tegen Borrelia waren we benieuwd of verminderd functioneren van de lectine route een verhoogd risico geeft op het ontstaan van de ziekte van Lyme. Ongeveer 25 % van de bevolking heeft namelijk geen MBL of een verlaagde concentratie MBL in hun bloed (MBL-deficiëntie) [70]. Recent is aangetoond dat mensen met antilichamen tegen Borrelia in hun serum vaker MBL deficiënt zijn in vergelijking met mensen zonder antilichamen tegen Borrelia. In hoofdstuk 6 hebben we daarom de rol van MBL in het ontstaan van de ziekte van Lyme onderzocht door middel van een genetische gemodificeerde muis die MBL mist. Anderen hebben laten zien dat de MBL deficiënte muis een ernstiger beloop van ziekte heeft bij een aantal andere infectieziekten. In de MBL deficiënte muis bleek, in vergelijking tot normale muizen (de zogeheten wildtype muis), Borrelia beter te kunnen overleven. Echter, in organen waar Borrelia in de muis vanuit de huid naar toe migreert, zoals het hart, de gewrichten en de blaas, was de Borrelia infectie gelijk. Omdat het gebruikte muizenmodel geen goed inzicht geeft in de afweerreactie van de muis is ook gebruik gemaakt van in vitro modellen (reageerbuis modellen) om de rol van MBL te onderzoeken. In deze in vitro modellen kan het functioneren van het complement systeem beter worden onderzocht, bijvoorbeeld door te onderzoeken of MBL belangrijk is in het doden van Borrelia door serum, in het fagocyteren (opeten) van Borrelia of in de productie van cytokines (moleculen betrokken bij de afweer) door afweercellen. Echter, de in vitro experimenten lieten geen verschil zien in mate van afweerreacties in de aan- of afwezigheid van MBL. Een mogelijke oorzaak hiervoor is dat in de in vitro proeven gebruik gemaakt is van muizenserum, waarvan bekend is dat het in het laboratorium instabiel is. Hierdoor werd een verschil tussen MBL deficiënt serum en wildtype serum in afweer mogelijk gemaskeerd. Binnenkort wordt er daarom verder onderzoek gedaan met de MBL deficiënte muizen waarbij we onderzoeken welke afweerreacties in de huid er voor zorgen dat Borrelia beter kan overleven. Toekomstig onderzoek zal uiteindelijk moeten aantonen of mensen die MBL deficiënt zijn inderdaad een verhoogd risico hebben op het krijgen van de ziekte van Lyme. Deel 3: Preventie Patiënten met de ziekte van Lyme worden effectief behandeld met antibiotica. Echter, het principe dat voorkómen beter is dan genezen is zeker van toepassing op de ziekte, omdat een tekenbeet of rode kring niet altijd opgemerkt wordt 209

10 waardoor Borrelia zich kan verspreiden naar vitale organen zoals het zenuwstelsel of het hart. In deze gevallen is er een aanzienlijke kans op langdurige restschade. Daarnaast geeft behandeling met antibiotica een risico op bijwerkingen. Op dit moment bestaan preventieve maatregelen vooral uit voorlichting vanuit de overheid om beschermende kleding te dragen in gebieden waar veel teken voorkomen en het controleren op tekenbeten na mogelijke expositie. Gezien de toenemende aantallen van de ziekte van Lyme over de afgelopen jaren is de ontwikkeling van een vaccin waarmee de ziekte van Lyme kan worden voorkómen hard nodig. Anti-teken vaccins om de ziekte van Lyme te voorkómen Vaccins die voorkómen dat mensen geïnfecteerd raken met Borrelia zijn sinds de jaren 90 onderzocht. In de jaren 90 is er in de VS een commercieel vaccin beschikbaar geweest gericht tegen een oppervlakte-eiwit van Borrelia (OspA). Echter, het vaccin is in 2002 van de markt gehaald, mogelijk veroorzaakt door onbewezen claims dat het vaccin invaliderende bijwerkingen zou hebben en andere factoren. Alternatieve vaccin strategieën zijn sinds het verdwijnen van het humane vaccin onderzocht, waaronder het idee om vaccins te ontwikkelen die gebaseerd zijn op eiwitten van de teek [233]. Antistoffen die ontstaan ten gevolge van vaccinatie kunnen namelijk de functie van de eiwitten waartegen ze gericht zijn blokkeren of neutraliseren. De achterliggende gedachte van een anti-teken vaccin is dat wanneer je de functie van cruciale tekeneiwitten voor Borrelia kan blokkeren, bijvoorbeeld eiwitten die het immuunsysteem onderdrukken, je kunt voorkómen dat Borrelia wordt overgedragen. Eerdere vaccinatie studies in diermodellen hebben laten zien dat immunisatie tegen bijvoorbeeld Salp15, TSLPI (hoofdstuk 4) en thrf (gedeeltelijk) succesvol zijn in het voorkómen van Borrelia transmissie naar de gastheer. Omdat er nog geen vaccin kandidaat beschikbaar is die volledige transmissie van Borrelia blokkeert is verder onderzoek nodig. In dit deel van het proefschrift hebben we onderzocht of darmeiwitten van Ixodes teken ook bruikbaar kunnen zijn als vaccins om de ziekte van Lyme te voorkómen. De darm van de teek heeft een belangrijke functie voor zowel de teek zelf als voor Borrelia. De darmen ontvangen het bloed van de gastheer en dit functioneert als voedingsbron voor de teek. Vaccins gericht tegen darmeiwitten die hierin een belangrijke functie hebben, kunnen dus wellicht voorkómen dat teken goed bloed kunnen opnemen waardoor teken sterven of waardoor ze zich minder goed voortplanten met als gevolg dat de tekenpopulatie in het wild daalt. Een belangrijk voordeel hiervan is dat minder teken in de natuur niet alleen zorgt voor een 210

11 verminderd risico op een Borrelia infectie, maar ook beschermt tegen andere door teken overdraagbare ziekten, zoals teken-encefalitis (hersenontsteking) en humane babesiose. De darm is naast tekenvoeding tevens belangrijk voor Borrelia omdat hier de Borrelia spirocheten zich bevinden tussen de bloedmaaltijden. Wanneer de teek begint met voeden wordt Borrelia actief en zal deze gedurende de voeding vanuit de darm migreren naar de speekselklieren en vanuit daar zich naar de gastheer verplaatsen. Een vaccin gericht tegen darmeiwitten van de teek kan dus wellicht aangrijpen op de migratie van Borrelia naar de speekselklieren. Beide strategieën zijn in dit proefschrift onderzocht; de eerste strategie gericht tegen tekenvoeding wordt in hoofdstuk 7 onderzocht en de tweede strategie gericht tegen Borrelia migratie wordt in hoofdstuk 8 en 9 onderzocht. Anti-teken vaccins gericht tegen het voorkómen van tekenvoeding Tot nu toe zijn nog maar enkele Ixodes darmeiwitten geïdentificeerd die belangrijk zijn voor de opname van bloed in de darm [94]. Als mogelijk vaccin kandidaat hebben we daarom gekozen voor een Ixodes darmeiwit waarvan bekend is dat homologen (overeenkomstige) in andere teken succesvol zijn toegepast als vaccin. Het teken darmeiwit Bm86 is een eiwit in de teek Rhipicephalus microplus. Vaccins gericht tegen Bm86 beschermen runderen tegen overdracht van de parasiet Babesia door de tekenvoeding van R. microplus te belemmeren. Verminderde voeding door Bm86 vaccins resulteert uiteindelijk in vermindering van het aantal larven in de volgende teken generatie, waardoor de expositie van runderen aan R. microplus teken daalt. De verminderde teken expositie biedt runderen zodoende met name indirecte bescherming tegen de parasiet Babesia. Nijhof en anderen hebben recent twee homologen van Bm86 in Ixodes ricinus teken geïdentificeerd, genaamd Ir86-1 en Ir86-2, met respectievelijk 45 % en 49 % overeenkomstigheid [184]. We hebben vervolgens recombinante Ir86-1 en Ir86-2 eiwitten geproduceerd en deze recombinante eiwitten gebruikt in drie verschillende vaccins, namelijk Ir86-1, Ir86-2 of een combinatie van Ir86-1 en Ir86-2. We wilden vervolgens het effect van deze vaccins op de tekenvoeding van Ixodes ricinus onderzoeken. Hiervoor werden konijnen gevaccineerd tegen Ir86-1, Ir86-2 of een combinatie van beide. Een controle konijn werd gevaccineerd tegen ovalbumine. Er is gekozen om konijnen te gebruiken omdat ze een goede antistofrespons op een vaccin ontwikkelen en omdat ze beter geschikt zijn voor het voeden van volwassen teken dan kleinere zoogdieren zoals muizen. Het vaccineren van de konijnen zorgde voor hoge concentratie antilichamen gericht tegen Ir86-1 en/of Ir86-2 in het konijnenserum. Vervolgens werden volwassen teken op de konijnen geplaatst. Na afloop van de 211

12 tekenvoeding werden de teken gewogen en enkele weken na de voeding werd het gewicht van de tekeneitjes gewogen. Geen van de drie vaccins (Ir86-1, Ir86-2 of een combinatie) zorgde voor een verschil in het gewicht van volgezogen teken of in het gewicht van de eitjes in vergelijking met het controle vaccin. Een vaccin gericht tegen Bm86 homologen in Ixodes ricinus teken lijkt dus geen goede strategie om LB te voorkómen. De overdracht van Borrelia van de teek naar het konijn hebben wij echter niet onderzocht. De rol van teken darmeiwitten in de migratie van Borrelia uit de darm Als tweede strategie wilden we vaccins ontwikkelen gericht tegen teken darmeiwitten die belangrijk zijn voor de migratie van Borrelia vanuit de darm. Recent is aangetoond dat Borrelia tijdens de tekenvoeding bindt aan het darmoppervlak voordat het uit de darmen migreert [69]. Onze hypothese was dat vaccins die de binding van Borrelia aan het darm epitheel voorkómen ervoor kunnen zorgen dat Borrelia minder goed uit de darm kan ontsnappen. Omdat er tot nu toe maar enkele teken darmeiwitten bekend zijn die betrokken zijn bij deze binding hebben we eerst een screening verricht om teken darmeiwitten te identificeren waaraan Borrelia kan binden. Omdat het volledige genoom van Ixodes scapularis bekend is, is gekozen met eiwitten van deze teek te werken. De gebruikte screeningsmethode is gebaseerd op Yeast Surface Display (YSD) technologie en staat beschreven in hoofdstuk 8. In YSD wordt gebruik gemaakt van gistcellen die, in ons geval, teken darmeiwitten op hun celmembraan tot expressie brengen. Doordat deze eiwitten als het ware tentoongesteld worden op de celmembraan kun je eiwit-eiwit interacties ontdekken. In ons geval waren we geïnteresseerd in interacties tussen (onbekende) tekeneiwitten op de celmembraan van de gistcellen en (onbekende) Borrelia eiwitten. Opgezuiverde Borrelia eiwitten werden geïncubeerd met de gistcellen. De gistcellen met tekeneiwitten waaraan Borrelia eiwitten bonden zijn vervolgens uitgeselecteerd met behulp van technieken zoals flow cytometry en Magnetic-activated cell sorting. Vervolgens is uit de geselecteerde gistcellen de eiwitcodering van het Borrelia bindende teken darmeiwit ontcijferd met behulp van sequencing. De screening identificeerde vier teken darmeiwitten waarvan er twee in het bijzonder interessant waren gezien het feit dat het vermoedelijk om extracellulaire eiwitten ging die tot expressie (geproduceerd) werden gebracht op het darmepitheel. Door middel van computermodellen is de eiwitstructuur onderzocht, waaruit bleek dat in het ene eiwit fibronectin domeinen aanwezig waren en in het andere eiwit dystroglycan domeinen. Op basis van deze bevindingen hebben we de eiwitten 212

13 Ixodes scapularis fibronectin III domain (Ixofin3D) en Ixodes scapularis dystroglycan like protein (ISDLP) genoemd. In hoofdstuk 8 en 9 wordt de rol van respectievelijk Ixofin3D en ISDLP tijdens de transmissie van Borrelia beschreven. Voor beide eiwitten is tevens onderzocht of ze een geschikte kandidaat voor vaccinatie zijn om de ziekte van Lyme te voorkómen. Met behulp van antistoffen tegen Ixofin3D en ISDLP is aangetoond dat deze eiwitten inderdaad tot expressie worden gebracht op het oppervlakte van de darmen. Zowel Ixofin3D als ISDLP werden meer tot expressie gebracht wanneer teken geïnfecteerd waren met Borrelia, wat een aanwijzing kan zijn dat Borrelia deze eiwitten nodig heeft voor succesvolle transmissie. We waren daarom benieuwd wat er zou gebeuren wanneer de expressie van deze eiwitten zou worden verlaagd. Hiervoor is gebruik gemaakt van de techniek RNAinterferentie (RNAi), waarmee de expressie van Ixofin3D of ISDLP tijdens de tekenvoeding wordt geremd. In teken waarin de expressie van Ixofin3d of ISDLP was verminderd bleek er minder migratie van Borrelia spirocheten naar de speekselklieren in vergelijking tot teken met normale expressie van Ixofin3D of ISDLP. Minder spirocheten in de speekselklieren zorgde ervoor dat er ook minder Borrelia spirocheten werden overgedragen. Deze experimenten tonen dus aan dat zowel Ixofin3D als ISDLP een belangrijke rol spelen tijdens de migratie van Borrelia uit de darm. We hebben ook onderzocht of vaccinatie eenzelfde effect had als RNAi. Voor Ixofin3D was dit inderdaad het geval en bleek dat anti-ixofin3d antilichamen muizen gedeeltelijk beschermen tegen Borrelia transmissie. Vaccinatie tegen ISDLP bleek echter niet effectief. Aanvullend onderzoek liet zien dat antistoffen tegen ISDLP wel konden binden aan ISDLP, maar niet de binding van Borrelia aan ISDLP kon voorkómen. Voor Ixofin3D hebben we verder het mechanisme uitgezocht waardoor in de afwezigheid van Ixofin3D Borrelia minder goed wordt overgedragen naar de gastheer. In teken met verminderde expressie van Ixofin3D konden Borrelia spirocheten minder goed binden aan het darmepitheel en hierdoor bevonden de Borrelia spirocheten zich voornamelijk in het lumen (binnenkant) van de darm. Waarschijnlijk blokkeren antistoffen tegen Ixofin3D binding van Borrelia aan het darmoppervlak waardoor een anti-ixofin3d vaccin gedeeltelijk beschermt tegen Borrelia transmissie. Toekomstige anti-teken vaccins Samenvattend leveren de resultaten beschreven in dit deel van het proefschrift een belangrijke bijdrage aan onze kennis op het gebied van teek-borrelia interacties in 213

14 de darm. Tevens is aangetoond dat Ir86 en ISDLP niet geschikt zijn als vaccin om de ziekte van Lyme te voorkómen, maar dat Ixofin3D wel een geschikte vaccin kandidaat zou kunnen zijn. Wellicht dat Ir86 en ISDLP in de darm niet voldoende bereikbaar zijn voor antistoffen in het bloed van de gastheer. Ook was de bescherming tegen Borrelia van een vaccin gebaseerd op Ixofin3D niet volledig. Om de effectiviteit van een Ixofin3D vaccin te verbeteren zouden andere tekeneiwitten aan het vaccin kunnen worden toegevoegd, bijvoorbeeld Salp15 of TSLPI, om een versterkend effect te bewerkstelligen. Toekomstig onderzoek blijft echter nodig om tekeneiwitten belangrijk voor transmissie van Borrelia te identificeren, en te testen of vaccins gebaseerd op deze eiwitten bescherming bieden tegen Borrelia transmissie. Op dit moment is een Europees consortium genaamd ANTIdotE onder leiding van het AMC bezig met het verder identificeren van Ixodes ricinus tekeneiwitten die Borrelia transmissie faciliteren. En nog belangrijker, in dit consortium wordt ook gezocht naar vaccins die andere door teken-overdraagbare ziekten kunnen voorkómen. Conclusie In dit proefschrift hebben we drie aspecten van de ziekte van Lyme ontleed. We hebben laten zien dat het huidig gebruik van serologische testen tot overdiagnostiek kan leiden en dat het belangrijk is om andere oorzaken uit te sluiten wanneer een patiënt verdacht voor de ziekte van Lyme niet opknapt na antibiotica kuren. Vervolgonderzoek zoals de recent gestarte prospectieve studie Lymeprospect zal hopelijk meer inzicht geven waarom sommige mensen na behandeling voor Lyme klachten houden. Verder hebben we laten zien dat het teken speekseleiwit TSLPI de lectine route van het complement systeem remt waardoor Borrelia wordt beschermd tegen de afweerreactie van de gastheer. Ook MBL lijkt een rol te spelen in de afweer tegen Borrelia maar dit moet nog verder worden uitgezocht. Het onderzoek naar TSLPI en MBL belicht een klein onderdeel van de complexe interacties tussen de teek, Borrelia en de gastheer. Tenslotte hebben we drie teken darmeiwitten getest als vaccins om de ziekte van Lyme te voorkómen. We hebben laten zien dat een vaccin gericht tegen Ixofin3D Borrelia burgdorferi transmissie gedeeltelijk kan voorkómen. Ook heeft het onderzoek naar Ixofin3D inzicht gegeven in de interactie tussen Borrelia en de teken darm, die belangrijk is gebleken voor de overdracht van Borrelia naar de gastheer. Een beter moleculair begrip hoe Borrelia de tekendarm verlaat zou nieuwe aangrijpingspunten kunnen opleveren voor het ontwikkelen van een vaccin gericht tegen de ziekte van Lyme. 214