Eerder al werd het concept bili-excess gepostuleerd 18, dat gebaseerd is op de aanname dat bilirubine

Transcriptie

1 Originele artikelen Klinisch-chemische diagnostiek van een SubArachnoïdale Bloeding (SAB): een nieuw protocol met verbeterde specificiteit bij gelijkblijvende sensitiviteit dr. J.J. Apperloo, klinisch chemicus i.o., dr. F. van der Graaf, klinisch chemicus, dr. P.L.I. Dellemijn, neuroloog en prof.dr.ir. H.L. Vader, klinisch chemicus Samenvatting De laboratoriumanalyse op bloedpigmenten in liquor cerebrospinalis (liquor c.s.) speelt een sleutelrol in de diagnose van een subarachnoïdale bloeding (SAB) bij patiënten die hiervan op klinische gronden verdacht worden, maar een negatieve craniale CT-scan laten zien. Recent literatuur onderzoek liet zien dat analyse van liquor c.s. weliswaar de gewenste hoge sensitiviteit heeft, maar een zeer lage specificiteit en positief voorspellende waarde, hetgeen de diagnostische bruikbaarheid sterk beperkt. Wij hebben beoogd een verbeterd laboratoriumprotocol te ontwerpen en evalueren, dat tegemoet komt aan de wens van een betere specificiteit zonder in te boeten aan sensitiviteit. Dit heeft geresulteerd in een kwantitatieve procedure, waarin een zogenaamde bili-excess concentratie wordt bepaald, die het verschil weergeeft tussen de gemeten bilirubineconcentratie en een maximaal verwachte concentratie, ervan uitgaand dat serum bilirubine gekoppeld aan albumine de bloed-liquor barrière passeert. Hierin blijkt het essentieel te zijn om rekening te houden met de propagatie van analytische fouten in de afzonderlijke analyses. Voor deze procedure is een betrouwbare en reproduceerbare analysemethode voor bilirubine in liquor c.s. vereist. Hiertoe hebben we de aanbevolen procedure, die gebaseerd is op het absorptiespectrum van de liquor c.s., vergeleken met eerste afgeleide spectroscopie, waarbij de laatste veruit superieur blijkt te zijn. In het bijzonder blijkt een goede spectrofotometrische kalibratiemethode cruciaal te zijn, en nogal wat valkuilen te kennen. In een onderzoekspopulatie (n = 93) van patiënten met en zonder verdenking op een SAB (n = 33 en n = 60, respectievelijk) hebben we het nieuwe protocol geëvalueerd en we vinden een sterk verbeterde specificiteit (100%; 95%BI: 95,7-100%)) in vergelijking met de aanbevolen methode (83%; 95%BI: 73,6-90,6%) bij gelijkblijvende sensitiviteit (100%; 95%BI: 66,4-100%). Introductie Bij peracute hoofdpijn met misselijkheid en braken bestaat er een klinische verdenking op een subarachnoïdale bloeding (SAB). Het neurologisch onderzoek Medisch Journaal, jaargang 34, no. 3 kan volledig normaal zijn, doch ook evidente afwijkingen tonen zoals coma, meningeale prikkeling en pathologische reflexen. Een CT-scan van de hersenen in het acute stadium kan de diagnose SAB bevestigen. Rond 1990 lieten de resultaten van de Cooperative Aneurysm Study zien dat de diagnostische sensitiviteit van een CT-scan afneemt van ongeveer 92% op de dag van de bloeding tot 58% op dag vijf. 1 De sensitiviteit van hedendaagse CT-scanners is dankzij resolutie verhogende technieken aanzienlijk verbeterd (binnen 24 uur na de bloeding 97,5%) 2,3, maar met name bij een patiënt die zich enkele dagen na het ontstaan van een peracute hoofdpijn presenteert is het verwerpen van de diagnose SAB bij een normale CTscan niet meer betrouwbaar. Bij een klinische verdenking op een SAB en een negatieve CT-scan is de clinicus afhankelijk van de laboratoriumanalyse op bloedpigmenten in de liquor c.s. om hiermee de diagnose SAB te kunnen bevestigen of verwerpen. Bij het verwerpen van de diagnose volgt geen nadere diagnostiek. Indien laboratoriumonderzoek de diagnose SAB bevestigt, betekent dit voor de patiënt nadere, soms risicovolle diagnostiek en behandeling bij een aanmerkelijk slechtere prognose. Een SAB ontstaat doorgaans door een lekkend intracraniaal aneurysma 4, maar kan ook van een schedeltrauma of uit de perimesencefale venenplexus afkomstig zijn. Vrij snel na de SAB komt oxyhemoglobine (OxyHb) vrij in liquor c.s. door lysis van de aanwezige erytrocyten in het eiwitarme milieu, en dit wordt omgezet in bilirubine. Het bilirubine in liquor c.s., dat in deze context wordt gezien als de meest essentiële marker 5-8, bereikt uur na de SAB een maximale concentratie, en kan wel 2-4 weken na de bloeding verhoogd blijven 9. Het initiële bloedverlies van een zogeheten warning leak kan voorafgaan aan een tweede, vaak catastrofaal incident 10. Bij een gemiste SAB wordt het risico op re-bleeding binnen de eerste maand geschat op 30-40% 3,11,12. Daarom is het van belang om dit snel en met hoge sensitiviteit (geen fout negatieven) te diagnosticeren. Aan de andere kant zijn een hoge specificiteit en positief voorspellende waarde wenselijk, omdat onnodige angiografie, een procedure die geassocieerd is met 105

2 een risico op blijvend neurologische letsel van ongeveer 1% 3,13, dient te worden vermeden. Omdat de incidentie van een SAB in een CT-negatieve populatie laag is, gaat een slechts geringe afname in specificiteit gepaard met een sterke afname in de positief voorspellende waarde. Een verhoogde liquor c.s. bilirubineconcentratie, bepaald met spectrofotometrie, wordt beschouwd als de meest sensitieve marker om een SAB te diagnosticeren. Recent werd echter door Gunawardena et al. aanbevolen dat patiënten, die enkel verhoogde OxyHb concentraties laten zien, ook baat hebben bij angiografisch vervolgonderzoek, mits er sprake is van een sterke verdenking 14. Bovendien werd, gebaseerd op een kleine subgroep patiënten, aanbevolen dat patiënten met methemoglobine in liquor c.s. ook verder onderzocht dienen te worden. Dit alles was gebaseerd op een studie bij 463 CT-negatieve patiënten met verdenking op een SAB. Recent werd meerdere malen het gebrek aan sensitiviteit benadrukt wanneer slechts visuele inspectie van liquor c.s. op xanthochromie plaatsvindt 15,16. Verbazend genoeg, blijkt dit nog steeds in veel klinieken te gebeuren. Wood et al. bepaalden sensitiviteit en specificiteit van liquor c.s. spectrofotometrie in patiënten (n = 253) met SAB-verdachte symptomen, maar een normale craniale CT-scan 3. De gevonden sensitiviteit was 100%, specificiteit 75,2% en de positief voorspellende waarde slechts 3,3%. Ze concludeerden dat de lage specificiteit en PPV de diagnostische waarde van liquor c.s. spectrofotometrie sterk beperken. Dit werd deels toegeschreven aan het relatief frequent optreden van traumatische puncties. Incidenties van 19,4% 3 en 15,6% 17 werden gerapporteerd. Wij zijn van mening, dat een belangrijke bijdrage aan de lage specificiteit van de bilirubineanalyse in liquor c.s. wordt geleverd door het feit dat de concentratie van bilirubine in liquor c.s. sterk geassocieerd is met de concentraties van bilirubine in serum en albumine in liquor c.s. Met andere woorden, hoge liquor c.s. bilirubineconcentraties worden ook gevonden in afwezigheid van intracraniale bloedingen bij verhoogde liquor c.s. albumineconcentraties (bloed-liquor barrière dysfunctie) of verhoogde serum bilirubineconcentraties (hemolyse en/of leverdysfunctie). Eerder al werd het concept bili-excess gepostuleerd 18, dat gebaseerd is op de aanname dat bilirubine gekoppeld aan albumine de bloed-liquor barrière passeert, hetgeen leidt tot gelijke bilirubine / albumine ratio s in beide media (plasma en liquor c.s.). Als er meer bilirubine in de liquor c.s. aanwezig is dan verwacht (dus als een hogere ratio in liquor c.s. wordt gevonden), zou dit op een SAB kunnen duiden. In de gemodificeerde bili-excess variant die wij hier presenteren, wordt de relevantie van het rekening houden met de propagatie van analytische fouten in de afzonderlijke analyses bekeken. In dit concept dient de bepaling van de liquor c.s. bilirubineconcentratie een hoge nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid te hebben, en optimaal zijn afgestemd op de meting van de bilirubineconcentratie in serum, waarvoor een juiste kalibratieprocedure essentieel is. Er blijken nogal wat valkuilen te bestaan, waarmee rekening dient te worden gehouden. In dit kader wordt een vergelijking gemaakt tussen de aanbevolen NBAprocedure (net bilirubin absorbance; modificatie van Chalmer) 6,19,20 en eerste afgeleide spectroscopie. Het uiteindelijke door ons opgestelde protocol is geëvalueerd in een reeks liquor c.s. monsters (n = 93) van patiënten met en zonder klinische verdenking op een SAB (n = 33 en n = 60, respectievelijk). Materialen and methoden Totaal bilirubine in serum werd bepaald op een Modular analyzer (Roche Diagnostics, Almere) via een assay gebaseerd op de diazoreactie. Albumine in serum en liquor c.s. werden bepaald op een Integra analyzer (Roche Diagnostics, Almere) met een immunoassay. Voor liquor c.s. spectrofotometrie werd een Perkin-Elmer Lambda 25 gebruikt, uitgerust met software om eerste afgeleide spectra te berekenen (UV WINLAB). Een eerste afgeleide spectrum geeft de richtingscoëfficiënt ( Abs / λ) van het absorptiespectrum weer als functie van de golflengte (λ). De concentraties van bilirubine en OxyHb in liquor c.s. alsmede de eventuele aanwezigheid van methemoglobine (MetHb) werden met behulp van het eerste afgeleide spectrum vastgesteld. De waarde van de eerste afgeleide bij 586 nm en de maximum eerste afgeleide tussen 480 en 500 nm werden, respectievelijk, als maat voor de concentratie Figuur 1. Absorptie spectrum (A) en eerste afgeleide spectrum (B) van een liquor c.s. monster van een patiënt met een SAB. Pijlen in het eerste afgeleide spectrum geven de posities aan waarmee de verschillende parameters worden bepaald ( nm: bilirubine; 586 nm: Oxy- Hb; 690 nm: correctie voor troebeling; nm: mogelijke aanwezigheid van MetHb). 106 Medisch Journaal, jaargang 34, no. 3

3 OxyHb en bilirubine in liquor c.s. genomen (figuur 1). Het feit dat voor bilirubine geen vaste golflengte wordt gebruikt hangt samen met de waargenomen verschuivingen van de piekpositie afhankelijk van de gedetailleerde eigenschappen van het medium, waarbij de piekhoogte nagenoeg onveranderlijk lijkt te zijn. Wat OxyHb betreft, beschouwen we de algemeen gebruikte absorptie bij 415 nm als een onjuiste maat voor de concentratie. Deze absorptie wordt aanzienlijk beïnvloed door zowel troebeling als door de aanwezigheid van bilirubine: de extinctie van bilirubine bij 415 nm is ongeveer de helft van de maximale extinctie bij ongeveer 460 nm. Dit impliceert dat als de bilirubineconcentratie verhoogd is, zelfs in afwezigheid van OxyHb, een verhoogde absorptie bij 415 nm wordt waargenomen. In plaats daarvan gebruiken we de eerste afgeleide piek bij 586 nm om de OxyHb concentratie in µmol/l te bepalen. Bij 586 nm vindt geen interferentie door OxyHb plaats, in tegenstelling tot de piek met hogere intensiteit bij 426 nm. De intensiteit van de eerste afgeleide bij 586 nm is nog steeds ruim voldoende om nauwkeurige concentraties te kunnen bepalen. Correctie voor interferentie In het eerste afgeleide spectrum wordt een correctie voor troebeling uitgevoerd door de waarde bij 690 nm af te trekken van zowel de waarde bij 586 nm als van de piekwaarde tussen 480 en 500 nm. Daarnaast wordt de piekwaarde tussen 480 en 500 nm gecorrigeerd voor een kleine, maar relevante interferentie door OxyHb door middel van een golflengte-afhankelijke factor, die de eerste afgeleide waarde van OxyHb bij de bilirubine-piek tussen 480 en 500 nm weergeeft als fractie van de waarde bij 586 nm. Medisch Journaal, jaargang 34, no. 3 Kalibratie van de spectrofotometer Er zijn conversiefactoren nodig om micromolaire concentraties voor zowel OxyHb als bilirubine te verkrijgen uit de eerste afgeleide waarden. De conversiefactor voor OxyHb (van 122 [µm nm]) volgt uit de wet van Lambert-Beer, de molaire extinctiecoëfficiënt van OxyHb, en de numerieke relatie tussen de eerste afgeleide bij 586 nm en de absorptie bij 415 nm. De conversiefactor voor bilirubine moet ervoor zorgen dat de concentratie van bilirubine in liquor c.s. (bepaald met de spectrofotometer) optimaal is afgestemd op de concentratie van bilirubine in serum (bepaald op de Modular met een geheel andere techniek, die niet gevoelig genoeg is om de lage liquor c.s. concentraties te bepalen). Het serum van volwassenen mag niet gebruikt worden voor directe spectroscopie, omdat de aanwezigheid van carotenen en andere pigmenten kunnen leiden tot vals verhoogde absorpties op de bilirubine-positie. Het serum van pasgeborenen bevat nog geen carotenen, en kan hiervoor dus wel gebruikt worden. Kleine hoeveelheden neonataal serum (met Modular bilirubineconcentraties variërend van µmol/l) werden toegevoegd aan verschillende media (50 µl in 1,5 ml). Conversiefactoren relateerden de (gecorrigeerde) eerste afgeleide piekhoogten aan de Modularconcentratie. Daarnaast werd een bilirubine standaard referentie materiaal (SRM) meegenomen; dit bleek zeer grote matrixeffecten te vertonen wat betreft de molaire extinctie (met name afhankelijk van ph en eiwitconcentratie). Een zoektocht naar een te standaardiseren medium, dat zo representatief mogelijk is voor een gemiddeld liquor c.s. monster, leverde een oplossing van 400 à 500 mg/l CeAlb in fosfaat-gebufferd fysiologisch zout. CeAlb (Sanquin, Amsterdam) is een infusievloeistof voor intraveneus gebruik, die ~200 g/l eiwit bevat waarvan 95% albumine. Dit bleek tevens het enige geteste medium te zijn waarin humaan (neonataal) materiaal en het bilirubine SRM zich identiek gedroegen. Conversiefactoren van 89,0±0,5 [µm (AU) -1 nm] (gemiddelde±sem) voor neonataal bilirubine en 88,0±0,5 [µm (AU) -1 nm] (gemiddelde ±SEM) voor bilirubine referentiemateriaal werden gevonden. Wij hebben in onze verdere studie een factor van 89 [µm (AU) -1 nm] gebruikt. Methemoglobine (MetHb) Hoewel niet veel vóórkomend, kan de mogelijke aanwezigheid van MetHb vastgesteld worden door de piekpositie tussen 410 en 430 nm in het eerste afgeleide spectrum te bepalen. De piekpositie voor Oxy- Hb ligt bij ~426 nm, die voor MetHb bij ~415 nm (figuur 2). De molaire extincties zijn nagenoeg gelijk. Deze gegevens werden vastgesteld door spectra van OxyHb-oplossingen te vergelijken met die van humaan MetHb (Sigma). Wanneer een eerste afgeleide piekhoogte > 0,008 AU/nm wordt gevonden bij een golflengte < 420 nm, is mogelijk MetHb aanwezig. Verdere aanknopingspunten voor de aanwezigheid zijn dan: 1. De ratio van piekwaarden bij lage golflengte (tussen 410 en 430 nm) en hogere golflengte (~586 nm) is ongeveer 5:1 voor OxyHb, maar significant hoger voor MetHb (>40:1) (inset figuur 2). 2. Afhankelijk van de concentratie MetHb, kan een additionele kleine piek bij ~645 nm worden gedetecteerd, die niet aanwezig is bij OxyHb (figuur 2, pijl in inset). Gebruikt protocol Liquor c.s. monsters werden binnen een uur na afname gecentrifugeerd, waarna scheiding van cellen en supernatant plaatsvond. Liquor c.s. (supernatant) absorptiespectra werden opgenomen van nm (met dubbel gedestilleerd water als blanco) (figuur 1a), waarna Figuur 2. Eerste afgeleide spectra van gelijke concentraties Oxy- Hb (onderbroken lijn) en MetHb (ononderbroken lijn). De ingevoegde figuur laat een vergroting van het hoge-golflengtegebied zien; de pijl geeft een unieke MetHb-piek bij ~645 nm aan. 107

4 het eerste afgeleide spectrum werd berekend (figuur 1b). Hierin werden de waarden bij 690 nm en 586 nm, en de maximum waarden tussen nm en tussen nm afgelezen met een verticale cursorlijn (op ~0,5 nm nauwkeurig). Concentraties van bilirubine in serum, en albumine in serum en liquor c.s. werden bepaald op Modular en Integra. Vervolgens werden zowel gecorrigeerde OxyHb- en bilirubineconcentraties berekend als de bili-excess concentratie. Resultaten en discussie Spectroscopische beschouwingen We hebben kritisch gekeken naar de procedure ter vaststelling van de NBA (net bilirubin absorbance) bij 476 nm. Hierbij wordt handmatig een basislijn getrokken naar voorschrift van Chalmers 6,19,20. Bilirubine standaard referentie materiaal (SRM) werd gebruikt als maat voor de bilirubineconcentratie. Superpositie van individuele spectra, gevolgd door bepaling van de NBA, laat zien dat de NBA de bilirubineconcentratie steeds sterker onderschat met toenemende concentraties OxyHb (figuur 3). Dit kan worden toegeschreven aan het feit dat de basislijn-waarde bij 476 nm groter is dan de werkelijke OxyHb absorptie bij die golflengte. Het gebrek aan nauwkeurigheid wordt bevestigd wanneer twee echte liquor c.s. monsters in ogenschouw worden genomen. Hierbij gaan we ervan uit dat de eerste afgeleide methode zoals boven beschreven de bilirubine en OxyHb concentraties met grote nauwkeurigheid bepaalt. De NBA waarde van patiënt 87 (figuur 1a) is 0,023 AU bij een (met eerste afgeleide spectroscopie bepaalde) bilirubineconcentratie van 0,86 µmol/l en een OxyHb concentratie van 0,25 µmol/l. Hieruit kan worden berekend dat de aanbevolen NBA afkapgrens van 0,007 AU overeenkomt met een bilirubineconcentratie van 0,26 µmol/l. In een ander liquor c.s. monster (patiënt 86), was de NBA 0,061 AU, terwijl bilirubine en OxyHb concentraties werden berekend van 1,76 µmol/l en 0,02 µmol/l. In deze situatie met een veel lagere OxyHb concentratie, komt een NBA van 0,007 AU overeen Figuur 3. Absorptiespectra van oplossingen van bilirubine standaard referentie materiaal (onderbroken lijn; concentratie 0,2 µmol/l) en OxyHb (gestippelde lijn; concentratie 0,1 µmol/l). De ononderbroken lijn toont de superpositie van beide spectra. Een handmatige basislijn is getekend volgens Chalmer s procedure 20, en de NBA is aangegeven d.m.v. de pijl bij 476 nm ( X ). De ingevoegde figuur laat de waarde van X zien verkregen door superpositie van 0.2 µmol/l bilirubine met verschillende concentraties OxyHb bij 476 nm. Hogere concentraties OxyHb leiden tot sterkere onderschattingen van de bilirubineconcentratie. met een aanzienlijk lagere bilirubineconcentratie van 0,20 µmol/l. Daarnaast stelden Viljoen et al. de slechte reproduceerbaarheid van de NBA-procedure met een handmatig te construeren basislijn aan de orde 21. Zij lieten zien, dat in het concentratie gebied van de voorgestelde afkapwaarde van 0,007 AU, zelfs de within-operator imprecisie erg groot is (gemiddelde CV 19%). De bijdrage van de spectrofotometer aan deze slechte reproduceerbaarheid was verwaarloosbaar (d.w.z., identieke spectra werden verkregen wanneer deze bij herhaling werden bepaald). Het voordeel van het gebruik van eerste afgeleide spectroscopie is dat in tegenstelling tot absorptiespectroscopie de banden van OxyHb en bilirubine elkaar minder overlappen (figuur 1) 22. Tevens kan nauwkeuriger en gemakkelijker worden gecorrigeerd voor (aspecifieke) troebeling. Verondersteld wordt, dat troebeling aanleiding geeft tot een min of meer inverse lineaire afhankelijkheid van de golflengte (figuur 1a), zeker bij de langere golflengtes (> ongeveer 450 nm). Dit geeft aanleiding tot een constante eerste afgeleide waarde (figuur 1b), die afgetrokken kan worden van de eerste afgeleide waarden bij 586 nm (OxyHb) en de eerste afgeleide piekwaarde tussen 480 en 500 nm (bilirubine). Theoretische beschouwingen In normale situaties (geen SAB of andere bron van bloed in de liquor c.s.) wordt aangenomen dat bilirubine de bloed-liquor barrière voornamelijk gebonden aan albumine passeert, wat impliceert dat in beide media de bilirubine / albumine ratio gelijk is. Dit betekent, dat we een schatting kunnen maken van de liquor c.s. bilirubineconcentratie volgens: (vergelijking 1) Bij een SAB wordt verondersteld dat de gemeten [bilirubine] liquor (die dan grotendeels afkomstig is van de directe omzetting vanuit OxyHb, en dus niet vergezeld gaat van een verhoogde albumine concentratie) significant groter is dan de concentratie geschat op basis van vergelijking 1. Er dient echter ook rekening gehouden te worden met de analytische imprecisie van de afzonderlijke analyses (B S, A L en A S ) om statistisch verantwoorde conclusies te trekken. Terwijl within-run en withinday imprecisie op moderne klinische chemie-apparatuur nagenoeg verwaarloosbaar zijn, dienen effecten van de between-day imprecisie worden verdisconteerd. Deze werden ontleend aan de interne kwaliteitscontrole resultaten op representatieve niveaus over een periode van een jaar. De resultante CV voor de geschatte [bilirubine] liquor ( B L /B L ) kan bepaald worden uit de afzonderlijke CV s voor B S, A L en A S ( B S /B S, A L /A L en A S /A S, respectievelijk) via een formule voor propagatie van fouten bij vermenigvuldigingen en delingen 23 : (vergelijking 2) 108 Medisch Journaal, jaargang 34, no. 3

5 Dit leverde een resultante CV ( B L /B L ) voor de geschatte [bilirubine] liquor van 0,09. Een verschil tussen de geschatte en de gemeten [bilirubine] liquor is statistisch significant als het relatieve verschil tussen beide waarden meer is dan {2,8 CV(B L )} = 0,25 24,25. Hierbij gaan we we er, net als Viljoen 21, van uit dat de analytische imprecisie van de spectrofotometrische bepaling van [bilirubine] liquor verwaarloosbaar is (d.w.z., herhaalde metingen geven identieke resultaten). We introduceren de term liquor c.s. bilirubine limiet (LBL) voor [bilirubine] liquor, die voor iedere individuele patiënt gedefinieerd is als: (vergelijking 3) Tenslotte is de bili-excess gelijk aan het verschil tussen de spectroscopisch bepaalde [bilirubine] liquor en de LBL. Theoretisch zou de bili-excess 0 µmol/l moeten zijn wanneer er geen sprake is van een SAB. Onze bili-excess is een gemodificeerde variant van de eerder geïntroduceerde bili-excess 18, die geen rekening hield met de propagatie van analytische fouten. Om dit concept op juiste wijze te gebruiken, dienen de bepalingen van bilirubine in serum op Modular (of andere analyzer) en die van bilirubine in liquor c.s. via directe spectroscopie goed op elkaar afgestemd te zijn (en uiteraard geldt dit ook voor de bepalingen van albumine in serum en liquor c.s.). Dit wordt gerealiseerd door gebruik te maken van de procedure zoals beschreven in de materialen en methoden sectie. Referentiewaarden oxyhemoglobine In 150 liquor c.s. monsters van patiënten zonder verdenking op een SAB, hebben we -deels retrospectiefeen bovenste referentielimiet vastgesteld volgens de procedure die beschreven wordt in de materialen en methoden sectie (figuur 4). De 99 e percentiel waarde (bepaald met een non-parametrische methode) werd vastgesteld op 0,08 µmol/l, waarboven we OxyHb concentraties als verhoogd beschouwen. Het gedetecteerde OxyHb kan deels toegeschreven worden aan de introductie van kleine aantallen erytrocyten in liquor c.s. tijdens de punctie, gevolgd door cel-lysis. Figuur 4. Bepaling van OxyHb referentiewaarden (in µmol/l) in liquor c.s.monsters van 150 SAB-negatieve patiënten (volgens de procedure beschreven in de materialen en methoden-sectie). Traumatische puncties zijn niet meegenomen. De 99 e percentiel waarde (bepaald met een non-parametrische methode) is 0,08 µmol/l. Medisch Journaal, jaargang 34, no. 3 Puncties die evident traumatisch waren, zijn buiten beschouwing gelaten in de analyse. Er werden echter ook lage concentraties OxyHb gevonden in een aantal liquor c.s. samples waarin geen enkele erytrocyt gezien werd onder de microscoop. We weten niet of dit OxyHb afkomstig is van de kleine hoeveelheid die circuleert in bloed t.g.v. afbraak van oude erytrocyten (passage van de bloed-liquor barrière gekoppeld aan haptoglobine?) of van een aspecifieke introductie van erytrocyten in liquor c.s. -voorafgaand aan de punctiedie locaal de bloed-liquor barrière kunnen penetreren op (ontstekings-)plaatsen met een verminderde integriteit. Hoewel de diagnostische waarde van een verhoogde [OxyHb] liquor inferieur is aan een verhoogde [bilirubine] liquor, dient een enkel verhoogde [OxyHb] liquor niet genegeerd te worden, omdat het kan duiden op een recente SAB (< 12 uur geleden). In dergelijke situaties is de interpretatie sterk afhankelijk van de klinische verdenking op een SAB 14. Evaluatie van het voorgestelde protocol en vaststelling van bruikbare referentiewaarden We hebben ons protocol geëvalueerd in een reeks liquor c.s. monsters (n = 93) afkomstig van patiënten met en zonder klinische verdenking op een SAB (n = 33 en n = 60, respectievelijk). Tijdens een periode van enkele maanden, hebben we ons SAB protocol losgelaten op alle liquor c.s. samples die op het laboratorium arriveerden, ongeacht de indicatie van de liquor c.s. punctie. De resultaten zijn samengevat in figuur 5A. In geval van een klinische verdenking op een SAB, wordt er in onze kliniek minimaal 24 uur na aanvang van de klachten met de liquor c.s. punctie gewacht om verzekerd te zijn van een -ten minste gedeeltelijke- conversie van OxyHb in bilirubine. Patiënten 1-55 hebben geen verdenking op een SAB (uiteenlopende diagnoses / indicaties, zoals polyneuropathie, MS en andere demyeliniserende ziekten, meningitis, amnesie, ataxie, CVA, neuroborreliose, visusstoornissen); bij patiënten maakte een (CT-negatieve) SAB deel uit van de DD, maar de klinische verdenking was laag en een SAB werd uitgesloten op basis van liquor c.s. analyse en/of MRI- MRA; voor patiënten werd een SAB of andere intracraniale bloeding bevestigd (CT-negatief, behalve patiënten 91 en 92). De grote handicap bij de evaluatie van ons protocol is dat er geen gouden standaard bestaat om een SAB definitief vast te stellen in geval van CT-negativiteit. Afgezien van het feit dat het, gezien het morbiditeitsrisico 3,13, onethisch zou zijn om patiënten zonder of met lage verdenking op een SAB tóch aan angiografie te onderwerpen, worden bij angiografie ook ongeruptuurde aneurysma s gedetecteerd, welke met een prevalentie van 1-5% in de algemene populatie vóórkomen 26. Deze zijn niet te onderscheiden van geruptuurde aneurysma s, en het behandelen hiervan is zeer controversieel. Derhalve levert een groep patiënten waarbij er geen enkele verdenking op een SAB is (patiënten 1-55) essentiële informatie om het bili-excess concept te valideren. We veronderstelden daarbij dat geen van de diagnoses op één of andere manier zou interfereren met de introductie van erytrocyten in de liquor c.s., hetgeen aanleiding zou kunnen geven tot een foutief verhoogde bili-excess concentratie. 109

6 Hoewel in theorie de afwezigheid van een SAB geassocieerd zou moeten zijn met bili-excess 0 µmol/l, dient een geschikte bovenste referentiegrens te worden vastgesteld. Uit figuur 5 blijkt, dat de groep met lage verdenking (patiënt 56-84) zich identiek gedraagt aan de groep zonder verdenking (patiënt 1-55), wat de lage waarschijnlijkheid van een SAB bevestigt voor patiënt We hebben deze twee groepen samen gebruikt om referentiewaarden voor de bili-excess vast te stellen (figuur 6). De staart in de negatieve bili-excess range veroorzaakt een afwijking van een normale verdeling. Daarom hebben we in een parametrische analyse van referentiewaarden biliexcess concentraties < -0,03 µmol/l geëxcludeerd. Dit leverde een 99 e percentiel waarde van 0,11 µmol/l (95%BI: 0,099-0,125). Gebaseerd op deze waarnemingen hebben we een flow-diagram (figuur 7) samengesteld, waarvan de bijbehorende conclusies in tabel 1 staan. De keus van een bili-excess bovengrens van 0,11 µmol/l impliceert een specificiteit van 100% (95%BI: 95,7-100%) in onze studiepopulatie. Wanneer in plaats van de bili-excess gebruik wordt gemaakt van een ongecorrigeerde [bilirubine] liquor en de aanbevolen bovengrens van 0,20 µmol/l, wordt een specificiteit van slechts 83% (95%BI: 73,6-90,6%) berekend. In beide gevallen is de sensitiviteit 100% (met echter een breed 95% betrouwbaarheidsinterval van 66,4-100%, ten gevolge van de kleine populatie SAB-positieven). Het gebruik van bili-excess betekent dus een significante verbetering. Terwijl de ongecorrigeerde [bilirubine] liquor waarden van de SAB-positieve en de SAB-negatieve groep in onze studiepopulatie elkaar overlappen, bestaat er een forse gap van 0,6 µmol/l in de bili-excess concentraties tussen beide groepen. Dit doet de vraag rijzen of de gekozen bili-excess afkapgrens, die in de huidige populatie net voldoende is om een specificiteit van 100% te verkrijgen, niet wat verhoogd zou kunnen worden. Dit zou echter ten koste kunnen gaan van de sensitiviteit om met name kleine bloedingen te diagnosticeren. In onze populatie ging de kleinste bloeding vergezeld van een bili-excess concentratie van 0,71 µmol/l, terwijl O Connell bloedingen (met angiografisch bevestigde aneurysma s) rapporteerde met liquor c.s. bilirubineconcentraties van <0,2 µmol/l 7. Gezien het feit, dat de gemiddelde normale bilirubineconcentratie in liquor c.s. (bij niet afwijkende [bilirubine] serum en [albumine] liquor ) 0,10 µmol/l bedraagt, hetgeen vastgesteld werd in een subgroep van patiënten 1-83, achten wij het waarschijnlijk dat bij kleine SAB s bili-excess concentraties de bovengrens van 0,11 µmol/l slechts in geringe mate zullen overschrijden. Een extra bijdrage aan de specificiteit wordt bovendien nog geleverd door in het protocol ook de liquor c.s. OxyHb concentratie in ogenschouw te nemen. Figuur 5. (a) Overzicht van [bilirubine] liquor (gevulde driehoekjes) en bili-excess (open driehoekjes) voor alle patiënten, primair gesorteerd op bili-excess en vervolgens op [bilirubine] liquor. Voor patiënten 1-55 was er geen verdenking op een SAB; voor patiënten stond een SAB (met lage prioriteit) in de DD, maar werd uitgesloten; voor patiënten werd een SAB (of andere vorm van intracraniale bloeding) aangetoond. (b) Vergroting van figuur a om de toepasbaarheid te laten zien van een bovengrens van 0,11 µmol/l voor bili-excess en de algemeen gehanteerde bovengrens van 0,20 µmol/l voor [bilirubine] liquor. Figuur 6. Bili-excess waarden voor de totale SAB-negatieve referentiepopulatie (patiënten 3-85). Voor de duidelijkheid zijn patiënten 1 en 2 weggelaten (zie tekst). De 99 e percentiel waarde (bepaald met een parametrische methode) is 0,11 µmol/l (95%BI: 0,099-0,125). Figuur 7. Flowdiagram SAB-protocol. Zie tevens tabel Medisch Journaal, jaargang 34, no. 3

7 Omdat een niet verhoogde OxyHb concentratie binnen enkele dagen na een bloeding hoogst onwaarschijnlijk is, wordt in het hypothetische geval van een licht verhoogde bili-excess concentratie, die niet vergezeld gaat van een verhoogde OxyHb concentratie, de conclusie van een kritische noot voorzien (conclusie C in figuur 7 en tabel 1). Het is duidelijk dat er over het algemeen wat meer bilirubine in liquor c.s. aanwezig is, dan wij aanvankelijk verwacht hadden (namelijk een bili-excess 0 µmol/l). Hiervoor hebben we geen sluitende verklaring. Het zou kunnen samenhangen met het feit dat ook OxyHb concentraties tot 0,1 µmol/l gevonden worden die niet gecorreleerd blijken te zijn met de aanwezigheid van erytrocyten. Dit OxyHb zou, in ieder geval gedeeltelijk, de oorsprong van de waargenomen bili-excess waarden kunnen vormen. Gemiddeld zijn de micromolaire concentraties OxyHb in liquor c.s. lager dan de bili-excess concentraties. Deze concentraties mogen direct met elkaar vergeleken worden, omdat de OxyHb concentratie naar het aantal enkele tetrapyrrool ringen verwijst, die equimolair worden omgezet in bilirubine. Gebaseerd op het tijdsverloop van de concentraties van OxyHb en bilirubine in liquor c.s. na een SAB 9, lijkt het redelijk om te veronderstellen dat de halfwaardetijd van bilirubine groter is dan die van OxyHb. Theoretisch zouden ook verschillende halfwaardetijden voor bilirubine en albumine in liquor c.s. de gevonden bili-excess waarden kunnen verklaren. Daarnaast kan niet uitgesloten worden, dat de werkelijke bili-excess enigszins overschat wordt ten gevolge van een afwijkende molaire extinctiecoëfficiënt van het vrije liquor c.s. bilirubine, dat direct gevormd wordt uit OxyHb en waarschijnlijk niet aan albumine in liquor c.s. gekoppeld wordt, waar de beschikbaarheid aanzienlijk minder is dan in serum. Bij een artificiële bloeding door traumatische puncties blijven bili-excess waarden binnen het referentiegebied (patiëntnummers 2, 3, 15, 18, 21, 27, 34, 46, 49, 52, 58, 63 en 77). De in onze studiepopulatie waargenomen incidentie van traumatische puncties van 14,0% correspondeert goed met gerapporteerde incidenties van 19,4% 3 en 15,6% 17. Terwijl traumatische puncties in de literatuur worden benoemd als belangrijke oorzaak van fout-positieve resultaten 3,17, corrigeert de bili-excess dus netjes voor de introductie van serum bilirubine (met gelijktijdige introductie van serum albumine) in liquor c.s.. Wél worden in dergelijke gevallen af en toe wat verhoogde OxyHb concentraties gevonden, doordat er enige mate van in-vitro lysis van de erytrocyten optreedt (voor patiëntnummers 3, 18, 52 en 58 werden verhoogde OxyHb concentraties van 0,35, 0,14, 0,22 en 0,30 µmol/l gemeten; voor de overige patientnummers werden concentraties tussen 0,00 en 0,08 µmol/l gemeten). Door er zorg voor te dragen dat de liquor c.s. monsters met minimale vertraging op het laboratorium arriveren, waar direct spectrofotometrische analyse van (na centrifugatie verkregen supernatant van) liquor c.s. plaatsvindt, kan deze lysis tot een minimum worden beperkt. In geval van meningitiden (en andere oorzaken van een hoge permeabiliteit van de bloed-liquor barrière, zich uitend in een hoge tot zeer hoge [albumine] liquor ) worden hoge tot zeer hoge [bilirubine] liquor waarden gevonden. Deze worden door gebruik te maken van de bili-excess concentratie onderscheiden van een SAB (zie figuur 5: de hoge [bilirubine] liquor waarden in de groep van patiënt 1-55). We hebben gekeken of een correctie voor de propagatie van analytische fouten, ofwel het kijken naar een statistisch significant verschil tussen de berekende en gemeten bilirubineconcentraties, praktische meerwaarde heeft t.o.v. de oude bili-excess, die dit negeert. Figuur 8 laat zien dat met name in situaties met aanzienlijk verhoogde [albumine] liquor waarden (bijvoorbeeld patiënten 3, 5, 7, 8, 50), de oude en nieuwe bili-excess discrepanties laten zien ten gunste van de nieuwe procedure. In dergelijke situaties beïnvloeden relatief kleine fouten in de hoge liquor c.s. albumine concentratie de bili-excess aanzienlijk. Het is duidelijk, dat correctie voor relatief grote maximale fouten in extreme situaties de werkelijke bili-excess kan onderschatten (dus leidt tot negatieve bili-excess concentraties). Voorheen werd in ons laboratorium gewerkt met een ongecorrigeerde bili-excess waarbij dezelfde referentielimiet van 0,11 µmol/l werd gebruikt. Dit was de hoogst vastgestelde waarde in een groep van 25 SAB-negatieve patiënten. Bij gebruik van deze grenswaarde voor een ongecorrigeerde bili-excess (waarin nu [bilirubine] liquor en [bilirubine] serum optimaal op elkaar zijn afgestemd, wat eerder niet het geval was) wordt in onze studie- Tabel 1. Conclusies behorend bij het flowdiagram van figuur 7. A B C D E Conclusie In dit liquor c.s. monster valt bili-excess binnen het referentiegebied ( 0.11 µmol/l); een SAB wordt niet waarschijnlijk geacht. In dit liquor c.s. monster valt bili-excess binnen het referentiegebied ( 0.11 µmol/l); op grond hiervan lijkt een SAB niet waarschijnlijk. De verhoogde OxyHb-concentratie zou kunnen passen bij een traumatische punctie met enige in-vitro hemolyse, maar sluit ook een recente bloeding (< 12 uur geleden) niet uit. In dit liquor c.s. monster is bili-excess verhoogd (> 0.11 µmol/l), wat duidt op een mogelijke SAB. Echter, de niet verhoogde Oxy- Hb concentratie is in tegenspraak met een SAB minder dan een paar dagen geleden. Bij een sterke klinische verdenking wordt angiografisch vervolgonderzoek aangeraden. In dit liquor c.s. monster zijn zowel bili-excess als de OxyHb concentratie verhoogd (> 0,11 en > 0.08 µmol/l, respectievelijk); een SAB wordt waarschijnlijk geacht. In dit liquor c.s. monster is methemoglobine aanwezig; dit kan duiden op een SAB dan wel een andere bron van bloed in de liquorruimte. Figuur 8. Vergelijking van de nieuwe bili-excess (die rekening houdt met de propagatie van analytische fouten in de afzonderlijke in het concept gebruikte analyses), en de oude bili-excess 18 die de analytische imprecisie negeert. Medisch Journaal, jaargang 34, no

8 populatie een specificiteit van slechts 91% (95%BI: 82,1-95,8%) verkregen. Deze is significant lager dan de specificiteit die verkregen wordt met de nieuwe, gecorrigeerde bili-excess (zie boven). Omdat veel neurologische condities met een SAB in de DD gepaard gaan met bloed-liquor barrière stoornissen, achten wij de correctie voor analytische fouten zeer waardevol. Een aanname van het protocol is, dat er sprake is van een min of meer steady state tussen plasma en liquor c.s. (hoewel steady state in feite een misleidende uitdrukking is als het gaat om de dynamiek van productie en absorptie van liquor c.s.). Als er sprake is van sterk fluctuerende of snel stijgende serum bilirubineconcentraties, zal een evenwicht over de bloed-liquor barrière (nog) niet ingesteld zijn. Dit zal leiden tot aanzienlijk negatieve bili-excess waarden met overigens (sterk) verhoogde liquor c.s. bilirubineconcentraties. Dit is bijvoorbeeld het geval in patiënt 1 ([bilirubine] serum = 26 µmol/l; [bilirubine] liquor = 0.75 µmol/l; bili-excess = -0,57 µmol/l) en patiënt 2 (bilirubine] serum = 32 µmol/l; [bilirubine] liquor = 0.30 µmol/l; bili-excess = -0,22 µmol/l). Bij patiënt 1 was enkele dagen voorafgaand aan de liquor c.s. punctie nog een normale serum bilirubineconcentratie aanwezig (voor patiënt 2 zijn deze gegevens onbekend). Anderszins kan ook een rol spelen dat bij deze patiënten een relatief hoge fractie geconjugeerd bilirubine aanwezig is. Geconjugeerd bilirubine is beter wateroplosbaar dan ongeconjugeerd bilirubine, en zal dus in mindere mate aan albumine gekoppeld de bloed-liquor barrière passeren. Het is ons niet bekend of eiwit-ongebonden geconjugeerd bilirubine al dan niet de bloed-liquor barrière kan passeren. In geval van ernstige (geconjugeerde) hyperbilirubinemieën lijkt een liquor c.s. bilirubine analyse derhalve moeilijk interpreteerbaar; theoretisch zou een (sterk) negatieve bili-excess een (kleine) bloeding kunnen maskeren. In dergelijke (zeldzame) gevallen, zouden wij adviseren om op basis van de klinische verdenking te beslissen of direct angiografie dient te worden uitgevoerd. Mogelijk kan in een liquor c.s. monster wél de OxyHb concentratie bijdragen aan bevestiging van de diagnose. Conclusies Het SAB-protocol heeft een aantal significante verbeteringen ondergaan. Door een bili-excess concentratie te berekenen in plaats van een ongecorrigeerde liquor c.s. bilirubineconcentratie te meten, waarbij rekening wordt gehouden met de propagatie van analytische fouten in de individuele analyses, wordt in onze studiepopulatie een grote verbetering in specificiteit waargenomen. Wanneer als afkapgrens voor de bili-excess concentratie de 99 e percentielwaarde van 0,11 µmol/l bepaald in een SAB-negatieve populatie wordt gebruikt (n = 84; 95%BI: 0,099-0,125), impliceert dit een specificiteit van 100% (95%BI: 95,7-100%). Bij gebruik van de ongecorrigeerde bilirubineconcentratie in liquor c.s., zoals aanbevolen in de literatuur, wordt daarentegen een specificiteit van slechts 83% (95%BI: 73,6-90,6%) waargenomen, gebruikmakend van de algemeen gehanteerde afkapgrens van 0,20 µmol/l. Deze lage specificiteit hangt samen met het feit, dat hoge liquor c.s. albumine en/of serum bilirubineconcentraties leiden tot fors verhoogde liquor c.s. bilirubineconcentraties ( passend bij een SAB ), waarvoor in de bili-excess gecorrigeerd wordt. In beide gevallen is de sensitiviteit in onze studie-populatie 100% (95%BI: 66,4-100%). Voor het bili-excess concept is een zeer nauwkeurige en reproduceerbare bepaling van de liquor c.s. bilirubineconcentratie nodig. Absorptiespectroscopie bleek duidelijk inferieur te zijn aan eerste afgeleide spectroscopie. We hebben de bepaling van de bilirubineconcentratie geoptimaliseerd, en in het bijzonder aandacht besteed aan een juiste kalibratiemethode om de liquor c.s. en serum bilirubineconcentraties optimaal op elkaar af te stemmen. Dankwoord Graag willen we alle analisten van het laboratorium bedanken voor de vele extra uitvoeringen van het SAB-protocol. Een bijzonder woord van dank geldt voor Olga Hendriks voor praktische ondersteuning bij de lastige factor-bepalingen en onze bilirubine-expert Riejan Kuylaars-van Gansewinkel voor zeer waardevolle discussies. Literatuur Een lijst met referenties kan op verzoek electronisch beschikbaar worden gesteld; j.apperloo@mmc.nl. 112 Medisch Journaal, jaargang 34, no. 3