SAMENVATTING EN ALGEMENE CONCLUSIES

Transcriptie

1 SAMENVATTING EN ALGEMENE CONCLUSIES Recente inzichten in de interactie tussen kankercellen en het immuunsysteem hebben geleid tot revolutionaire ontwikkelingen in het immunotherapie veld voor de behandeling van tot voorheen palliatieve patiënten. Ondanks verschillende succesverhalen waarbij patiënten met vergevorderde tumoren in volledige remissie gingen, wordt immunotherapie geconfronteerd met enkele belangrijke beperkingen. Enerzijds reageert slechts een beperkt percentage patiënten (20-30 %) op immunotherapie, terwijl anderzijds immunotherapie vaak gepaard gaat met soms levensbedreigende bijwerkingen. Er is dus een nood aan meer gerichte en efficiëntere vormen van immunotherapie. In deze thesis werd gewerkt rond biomaterialen gebaseerd op suikerstructuren die in staat zijn om te interageren met het aangeboren immuunsysteem. Dit heeft als doel om zowel een adaptieve anti-tumor respons op te wekken, alsook directe afdoding van kankercellen te bewerkstelligen ten gevolge van een aangeboren immuunrespons. Hoofdstuk 1.1 geeft een beknopt overzicht weer dat de complexiteit van het immuunsysteem illustreert, terwijl de onderliggende mechanismen die aan de basis liggen van immuunresponsen tegen infecties worden toegelicht. In dit hoofdstuk worden de voornaamste cellulaire en humorale onderdelen van het immuunsysteem besproken, gevolgd door de complexe relatie tussen tumoren enerzijds en cellen van het immuunsysteem anderzijds. Hierbij wordt de nadruk gelegd op mechanismen die kankercellen gebruiken om het immuunsysteem te omzeilen. Tot slot wordt een kort overzicht gegeven van de belangrijkste ontwikkelingen op vlak van kanker immunotherapie, met verwijzingen naar reeds commercieel verkrijgbare producten waar mogelijk. In Hoofdstuk 1.2 wordt aandacht besteed aan de rol van suikers als biomoleculen in het menselijk lichaam. Hierbij wordt de nadruk gelegd op de verschillende interacties tussen suikerstructuren en het immuunsysteem. De expressie van suiker-bindende eiwitten op cellen van het immuunsysteem en hun mogelijke rol als receptoren voor vaccinatie toepassingen wordt hier kort besproken. Tevens wordt het potentieel van suikermoleculen als antilichaam-rekruterende haptenen, tumor geassocieerde antigenen en precursoren voor metabole cel labeling toegelicht.

2 Gezien het belang van multivalente interacties tussen suikerstructuren en hun suiker-bindende eiwitten, wordt ten slotte dieper ingegaan op de synthese van synthetische suikerpolymeren. Hoofdstuk 2 handelt over de ontwikkeling van gemannosyleerde nanogels die in staat zijn om doelgericht te binden aan de mannose receptor, dewelke tot expressie wordt gebracht in immature dendritische cellen. Hiervoor werd in Hoofdstuk 2.1 een efficiënte synthese route ontwikkeld voor polymeriseerbare suikerstructuren. De macromoleculaire strategie die we verder hanteren is gebaseerd op eerder werk van Nuhn et al.. Hierbij werden nanogels verkregen door amfifiele blok copolymeren, waarvan het hydrofobe blok bestaat uit repeteer eenheden van het geactiveerd ester pentafluorofenyl acrylaat, in een specifiek solvent te laten aggregeren tot micellen. Vervolgens vernetten we deze micellen door de reactieve esters te laten reageren met een bis-amine. Als solvofiel polymeer blok werd gebruik gemaakt van gemannosyleerde repeteereenheden, waarbij werd aangetoond dat gemannosyleerde nanogels specifieke interactie met lectines konden aangaan. Variatie in de ketenlengte van de blok copolymeren liet controle toe over de hydrodynamische diameter van deze nanogels. Door gebruik te maken van een ketal gebaseerd bis-amine als vernetter, konden de nanogels degradeerbaar gemaakt worden bij zure endosomale ph, terwijl ze stabiel bleven bij neutrale fysiologische ph. Tevens werd aangetoond dat het gemannosyleerde oppervlak van de nanogels toeliet om opname door dendritische cellen te verhogen door actieve targeting van de mannose receptor. In Hoofdstuk 2.2 werd de kern van de gemannosyleerde nanogels voorzien van membraandestabiliserende eigenschappen. Hiervoor werden na vernetting de resterende pentafluorofenyl esters omgezet naar acrylamide repeteer eenheden met behulp van tertiaire N,Ndimethylaminoethyl (DMAEA) of N,N-diisopropylaminoethyl (DIPAEA) amines. Er werd vastgesteld dat, t.g.v. de pka van deze amines, membraan-destabilisatie afhankelijk was van de ph van het midden, waarbij DIPAEA-bevattende polymeren membraan-destabilisatie veroorzaakten zowel bij zure als neutrale ph. Door gebruik te maken van een ketal gebaseerd bis-amine als vernetter, was het mogelijk om DIPAEA nanogels te ontwerpen die enkel membraan-destabilisatie vertoonden na endosomale afbraak, terwijl bij fysiologische ph-waarden geen membraan-destabilisatie waar te nemen was.

3 Algemeen samengevat werd in Hoofdstuk 2 een one-pot synthese strategie ontwikkeld voor het aanmaken van gemannolyseerde nanostructuren en deze te functionaliseren met membraandestabiliserende eigenschappen na endosomale degradatie. In Hoofdstuk 3.1 werd het concept van antilichaam-rekruterende polymeren (ARPs) geïntroduceerd. ARPs zijn in staat het aangeboren immuunsysteem te activeren om kankercellen af te doden. Gebaseerd op de ontwikkelde synthese strategie voor geglycosyleerde acrylamide monomeren in Hoofdstuk 2.1, werden goed gekarakteriseerde glycopolymeren op basis van L- rhamnose aangemaakt via RAFT polymerisatie. Om deze polymeren van celmembraan bindende eigenschappen te voorzien werd één polymeer uiteinde gemodificeerd met cholesteryl amine (CholA). Ter controle werden polymeren gesynthetiseerd bestaande uit D-galactose repeteereenheden, zowel in aan- als afwezigheid van het membraan inserterende CholA uiteinde. In vitro cel experimenten toonden aan dat enkel polymeren die zowel L-rhamnose als CholA bevatten, in staat waren om antilichamen uit humaan serum te rekruteren naar het membraan van cellen. Om na te gaan wat de invloed is van een multivalente presentatie van L-rhamnose eenheden, hebben we tot slot ARPs vergeleken met een molecule met slechts één rhamnose motief. Hieruit bleek dat ARPs superieur zijn m.b.t. het rekruteren van antilichamen. In Hoofdstuk 3.2 werd dieper ingegaan op de invloed van het lipofiele polymeer uiteinde op cellulaire binding en antilichaam rekrutering. RAFT chain transfer agents (CTAs) met verschillende lipofiele motieven werden gesynthetiseerd en gebruikt voor de polymerisatie van pentafluorofenyl acrylaat. Nadien werden deze polymeren gemodificeerd met 2,4-dinitrofenyl (DNP). In dit hoofdstuk werd DNP als hapteen gebruikt gezien de commerciële beschikbaarheid van anti-dnp antilichamen. Dit liet een makkelijke in vitro analyse toe van de antilichaam rekrutering. Deze experimenten toonden aan dat polymeren gefunctionaliseerd met een dimyristoyl vetzuur groep een veel hogere celmembraan binding en tevens ook sterkere antilichaam rekrutering vertoonden in vergelijking met polymeren gefunctionaliseerd met een cholesterol, een CholA, of een stearyl vetzuur groep. Vervolgens werd nagegaan wat de invloed is op antilichaam rekrutering na meerdere dagen. Terwijl di-myristoyl gemodificeerde polymeren initieel sterkere rekrutering toelieten, vertoonden cholesterol gefunctionaliseerde polymeren een

4 lagere terugval in antilichaam binding. De onderliggende reden voor deze observatie is momenteel nog niet opgehelderd. Als alternatief voor het lipofiele polymeer uiteinde voor celmembraan binding, werd in Hoofdstuk 3.3 metabole cel labeling met azide gemodificeerde suikers onderzocht. Als ARPs werden polymeren aangemaakt die zowel DNP als dibenzocyclooctyn (DBCO) groepen bevatten. In vitro cel experimenten toonden aan dat enkel cellen die behandeld waren met azide gemodificeerde suikers in staat waren om polymeren die DBCO bevatten covalent te binden d.m.v. click chemie. Enkel wanneer deze polymeren ook DNP eenheden bevatten waren ze bovendien in staat om anti-dnp antilichamen te rekruteren naar het cel oppervlak. Controle polymeren die deze essentiële componenten niet bezitten, evenals cellen die gecultiveerd werden in afwezigheid van de azide gemodificeerde suikermolecule, waren niet in staat om anti-dnp antilichamen te rekruteren. Samengevat werd in Hoofdstuk 3 het ARPs concept ontwikkeld als nieuw type biomateriaal voor kanker immunotherapie. Verder in vitro en in vivo onderzoek is echter noodzakelijk om de invloed van ARPs op de immunobiologische respons te onderzoeken. Het onderzoek in Hoofdstuk 4 werd uitgevoerd in nauwe samenwerking met het lab van Prof. Dr. Filip Du Prez (Universiteit Gent, België) en behandelt de evaluatie en optimalisatie van tyrosinespecifieke polymeer-eiwit conjugatie in waterig midden via TAD-gefunctionaliseerde polymeren. Hier werd gebruik gemaakt van runder albumine (BSA) als model eiwit en TAD-p(N,N-dimethyl acrylamide) als polymeer. Door het polymeer op te lossen in acetonitril onder anhydrische condities alvorens het toe te voegen aan een waterige oplossing van BSA, werd de koppelingsefficiëntie aanzienlijk verhoogd. De onderliggende reden hiervoor was de hogere weerstand aan hydrolyse van de TAD groep in acetonitril:water mengsels, vergeleken met dimethylsulfoxide:water mengsels en zuiver water. De tyrosine-selectiviteit van de conjugatie kon nagegaan worden via massa spectrometrie na behandeling met trypsine. De conjugatie reactie vertoonde een minimale invloed op de α-helicale structuur van het eiwit en de esterase activiteit. Dit suggereert dat de reactie tussen TAD-gefunctionaliseerde polymeren en tyrosine eenheden een interessante strategie is voor bio-conjugatie, die potentieel kan aangewend worden om tumor specifieke eiwitten te koppelen in de kern van de door ons ontwikkelde gemannosyleerde nanogels.

5 Samengevat werden doorheen deze thesis nieuwe inzichten verworven in het ontwikkelen van synthetische materialen die in staat zijn om te interageren met componenten van het aangeboren immuunsysteem. In het bijzonder werd de focus gelegd op suikerstructuren. Verder onderzoek naar het in vitro en in vivo immunobiologisch gedrag van deze componenten blijft noodzakelijk, in het bijzonder m.b.t. tot het opwekken van functionele immuunresponsen. We hopen dat onze inspanningen en bevindingen een bijdrage zullen leveren tot de ontwikkeling van innovatieve en efficiëntere vormen van immunotherapie.