SAMENVATTING. Achtergrond. De toepassing van moderne technologieën binnen het

Transcriptie

1 SAMENVATTING Achtergrond. De toepassing van moderne technologieën binnen het geneesmiddelonderzoek zoals genomics, proteomics, bioinformatica, combinatoriële chemie, en high throughput screening hebben geresulteerd in een groot aantal potentiële werkzame stoffen voor de behandeling van verscheidene ziektes. Ondanks de vaak toegepaste intraveneuze toediening, zal de actieve stof in veel gevallen onvoldoende of niet werkzaam zijn. Ten eerste komt de stof lang niet altijd in voldoende mate op de plaats terecht waar het zijn werking moet doen, ten tweede kan de stof in het lichaam instabiel zijn en als laatste kan de stof ernstige bijwerkingen in organen en/of weefsels, waar het eigenlijk niet hoeft te komen, veroorzaken. Om bovenstaande problemen te omzeilen is er veel onderzoek gedaan naar transportsystemen met een grootte van tientallen nanometers die het geneesmiddel via de bloedbaan naar specifieke doelorganen, weefsels of cellen transporteren. Dit heeft geresulteerd in de ontwikkeling van verschillende typen dragersystemen zoals liposomen, micellen en polymere nanodeeltjes. Liposomen zijn meer dan 40 jaar geleden voor het eerst beschreven en zijn een succesvol voorbeeld van een geneesmiddeldragersysteem. Het zijn blaasjes die bestaan uit een waterige kern omhuld door zogenaamde fosfolipide bilagen; ze zijn verwant aan biologische membranen zoals bijvoorbeeld het celmembraan. De bereiding is simpel omdat ze spontaan gevormd worden in water. Daarnaast zijn ze ook nog eens zeer stabiel. Liposomen zijn geschikt als dragersysteem voor een grote verscheidenheid aan farmaca met verschillende fysisch chemische eigenschappen. Zo kunnen hydrofiele stoffen in de kern en lipofiele stoffen in de bilaag ingesloten worden. Een voordelige eigenschap van liposomen en nanodeeltjes is, dat ze in bepaalde pathologische gebieden, zoals in tumoren en ontstekingsgebieden, de bloedvaten kunnen verlaten. In deze gebieden is het endotheel lek, zodat de deeltjes uit de bloedvaten kunnen ontsnappen, het zieke weefsel penetreren en er vervolgens ophopen. Een nadeel is dat liposomen snel door het immuunsysteem herkend en geëlimineerd worden. Na intraveneuze toediening binden ze een grote hoeveelheid plasma eiwitten waardoor ze vervolgens door macrofagen herkend en uit de bloedbaan verwijderd worden. Deze korte verblijfsduur in de bloedbaan leidt er toe dat het therapeutische effect van de ingesloten stof verre van optimaal is. 195

2 appendix Een manier om de herkenning door het immunsysteem te verminderen is de liposomen te coaten met hydrofiele polymeren. Het meest gebruikte polymeer hiervoor is polyethyleenglycol (PEG). PEG is hydrofiel, niet geladen en een flexibel molecuul en kan met behulp van een lipide anker aan het liposoomoppervlak gekoppeld worden. Als gevolg hiervan worden de liposomen minder snel uit het bloed geklaard en circuleren ze langer. Er zijn echter verschillende nadelen verbonden aan het gebruik van PEG als liposoomcoating. PEG is niet enzymatisch afbreekbaar in het menselijke lichaam en het is daarom denkbaar dat het na extensieve toediening in cellen ophoopt en mogelijk bijwerkingen veroorzaakt. De PEG coating kan bovendien het Figuur 1. Schematische representatie van een uitsnede van een PEG liposoom beladen met een water oplosbaar farmacon in de waterige kern. therapeutische effect van het ingesloten farmacon belemmeren, door te verhinderen dat de liposomen op de zieke plek uit elkaar vallen om het farmacon af te geven of dat ze aan de doelcellen binden en worden opgenomen. Verder is aangetoond dat PEG liposomen bij een heel lage dosering of bij herhaalde toediening snel uit het bloed geklaard kunnen worden. Bovendien is beschreven dat PEG liposomen het complementsysteem, een deel van het immuunsysteem, activeren. Dit kan bijwerkingen veroorzaken zoals veranderingen in de bloeddruk, hoofdpijn en gezichtszwelling die ernstig of zelfs dodelijk kunnen zijn. In dit proefschrift worden nieuw ontwikkelde alternatieve coatings op basis van polyaminozuren (PAZ) beschreven. Het PAZ poly(hydroxyethyl L glutamine) (PHEG) en poly(hydroxyethyl L asparagine) (PHEA) kunnen aan een lipideanker worden gekoppeld en zo op het liposoomoppervlak geimmobiliseerd worden. Polyaminozuren hebben als een intrinsiek voordeel ten opzichte van het veel gebruikte PEG dat ze afbreekbaar zijn door lysosomale enzymen in de cel en ook door enzymen die in tumoren en ontstekingsgebieden buiten de cel aanwezig zijn. In een initieel onderzoek is aangetoond dat deze polyaminozuren de circulatietijden van liposomen even goed kunnen verlengen als PEG. 196

3 In dit proefschrift is de karakterisering van PAZ liposomen en het onderzoek naar de farmacokinetische eigenschappen (circulatiegedrag) van en activering van het complementsysteem door PAZ liposomen beschreven. Verder zijn de enzymatische afbreekbaarheid van PAZ en de toepasbaarheid van deze afbreekbaarheid voor therapeutische doeleinden bestudeerd. Karakterisering van PAZ liposomen. In hoofdstuk 2 wordt beschreven hoe de samenstelling van liposomen na hun bereiding geanalyseerd kan worden. De circulatietijden van liposomen in het bloed zijn afhankelijk van de hoeveelheid van het coatingpolymeer op het liposoomoppervlak. Echter bij de bereiding van de liposomen is niet gegarandeerd dat alle lipiden en ook de PAZ volledig in de liposomen worden ingebouwd. Het is daarom belangrijk om de precieze samenstelling van de liposomen na bereiding te bepalen. Voor dit doeleinde is een analysemethode ontwikkeld die gebruik maakt van protonen nucleaire magnetische resonantie spectroscopie ( 1 H NMR). De methode werd gevalideerd en het is aangetoond dat de relatieve samenstelling van de PAZ liposomen na hun bereiding met deze methode nauwkeurig vastgesteld kan worden. Farmacokinetische eigenschappen van PAZ liposomen. Hoofdstuk 3 beschrijft onderzoek naar de circulatietijden van PAZ liposomen in ratten. Voor verschillende farmaca en therapiedoeleinden moet de meest optimale liposoomformulering ontwikkeld worden. Doel van de studie was te onderzoeken of PAZ in staat zijn verschillende liposoomtypes te beschermen tegen snelle klaring. Er is gekeken naar het effect van variatie van de liposoomeigenschappen op de circulatietijden en ophoping van de liposomen in lever en milt, de twee organen waar liposomen na hun herkenning door het immuunsysteem voor een groot deel terecht komen. De invloed van de dichtheid van het PAZ op het liposoomoppervlak, de inbouw van cholesterol of fosfolipiden met een positieve of negatieve lading, de liposoomgrootte en liposoomdosis is bestudeerd. PAZ bleken goed in staat te zijn de circulatie tijden van de verschillende liposoomtypes te verlengen hetgeen PAZ zeer geschikt maken voor een brede toepassing. Voor PEG liposomen is in een aantal studies aangetoond dat ze bij lage dosis en na herhaalde toediening snel geklaard worden uit de bloedbaan. Deze bevindingen zijn samengevat in het literatuuroverzicht gepresenteerd in hoofdstuk 4. De snelle klaring kan belangrijke consequenties hebben voor de therapie met farmaca geformuleerd in PEG liposomen. Als PEG liposomen bijvoorbeeld vaker moeten worden toegediend, zoals bij een chemokuur, 197

4 appendix resulteert een versnelde klaring in een verhoogd risico dat de therapie minder effectief en in het ergste geval onwerkzaam wordt. In hoofdstuk 5 is gekeken of deze bevindingen ook gelden voor liposomen met PHEA op het oppervlak. In een studie in ratten is gevonden, dat de PHEA liposomen bij lage dosis net zo lang circuleren als bij hogere doseringen en dat een tweede injectie van PHEAliposomen minder snel geklaard wordt dan een tweede injectie van PEGliposomen. Hoewel het mechanisme achter deze bevindingen nog onduidelijk is, zijn de circulatietijden van PHEA liposomen onder deze omstandigheden duidelijk beter dan die van PEG liposomen. Activering van het complement systeem door PAZ liposomen. In hoofdstuk 6 is onderzocht of PAZ liposomen het complementsysteem kunnen activeren door testen met menselijk bloedplasma en onderzoek in varkens uit te voeren. Uit deze studie bleek dat PAZ liposomen het complementsysteem activeren en overgevoeligheidsreacties in varkens kunnen veroorzaken, zoals veranderingen in de bloeddruk en huiduitslag. Het is echter nog niet duidelijk of andere factoren, bv. eventuele verontreinigingen van de liposomen met endotoxines, ook hierbij een rol spelen. Een introductie van verontreinigingen tijdens de synthese van de PAZ kan niet worden uitgesloten. Afbreekbaarheid van PAZ en therapeutische toepassing. In hoofdstuk 7 is de afbreekbaarheid van PHEG door enzymen bestudeerd. De gekozen enzymen papaïne en pronase E staan model voor de enzymen in de lysosomen. Cathepsine B is een lysosomaal enzym dat heel actief is. Het komt ook voor buiten de cel in tumor en ontstekingsweefsel. Met verschillende technieken is aangetoond dat PHEG door de gekozen enzymen wordt afgebroken in kleine fragmenten, zowel in vrije vorm maar ook als het gebonden is aan het liposoomoppervlak. Dit is een belangrijk voordeel ten opzichte van PEG, omdat hierdoor de ophoping van het polymeer in de cel kan worden uitgesloten. Verder kan een afbreekbare coating gebruikt worden om geneesmiddelafgifte of interactie van het liposoom met de doelcel mogelijk te maken. Voor PHEA kon de afbreekbaarheid met de gebruikte enzymen en technieken niet worden aangetoond. Echter het is wel te verwachten dat onder fysiologische condities, waar veel verschillende enzymen in hoge concentraties aanwezig zijn, PHEA toch wordt afgebroken. Hoofdstuk 8 geeft een gedetailleerd overzicht over liposoomcoatings die van het liposoom kunnen worden afgeworpen (vaak shedding genoemd). Door de toepassing van dit soort coatings kunnen, zoals reeds genoemd, 198

5 geneesmiddelafgifte en interactie van het liposoom met de doelcel verbeterd worden. Hoofdstuk 9 beschrijft onderzoek naar liposomen die opgebouwd zijn uit het fusogene, niet bilaag vormed fosfoplipid DOPE en het PHEG conjugaat als afgiftesysteem. Het bleek dat enzymatische afbraak van PHEG tot destabilisatie van de liposomen en afgifte van een ingesloten fluorescente modelstof leidt. Zo wordt getriggerde geneesmiddelafgifte in het doelgebied mogelijk, ofwel buiten de cel door de activiteit van enzymen in tumoren en ontstekingsweefsels of na cellulaire opname in de lysosomen. Therapeutische toepassing van PAZ liposomen. Een initiële studie toont aan dat PAZ liposomen inderdaad als geneesmiddeldragers gebruikt kunnen worden. Liposomen werden beladen met F991, een peptide, dat aan de lichte ketens van antilichamen bindt waardoor mestcellen niet meer geactiveerd kunnen worden. F991 kan worden gebruikt in de behandeling van nietallergische immuunaandoeningen, zoals astma, reumatoïde artritis en multiple sclerose. De eerste resultaten laten zien dat liposomaal F991 net zo goed werkt als vrij F991 maar met als voordeel dat de werking verlengd is. In perspectief. Het onderzoek beschreven in dit proefschrift toont aan dat PAZliposomen als dragersysteem voor verschillende farmaca gebruikt kunnen worden. Verder kunnen PAZ ook ter bescherming van andere typen nanodeeltjes gebruikt worden, zoals bv. nanodeeltjes en micellen gebaseerd op synthetische polymeren. Ook kunnen targeting liganden aan het uiteinde van de PAZ ketens worden gekoppeld die ervoor zorgen, dat geneesmiddelaflevering nog doelgerichter plaatsvindt. De compositie en lengte van de twee onderzochte PAZ kunnen nog verder geoptimaliseerd worden om coatings met verbeterde en specifieke eigenschappen te ontwerpen. Conclusie. Het onderzoek beschreven in dit proefschrift heeft aangetoond dat polyaminozuren gunstige eigenschappen hebben en derhalve als next generation coatings beschouwd kunnen worden voor de ontwikkeling van langcirculerende liposoomformuleringen voor intraveneuze toediening. 199