UvA-DARE (Digital Academic Repository) In vitro and in vivo testing of conditionally replicating SIV and HIV-1 strains to study viral gene expression van der Velden, G.J. Link to publication Citation for published version (APA): van der Velden, G. J. (2013). In vitro and in vivo testing of conditionally replicating SIV and HIV-1 strains to study viral gene expression General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: http://uba.uva.nl/en/contact, or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (http://dare.uva.nl) Download date: 31 Oct 2017
Samenvatting Het humaan immuundeficiëntie virus type 1 (HIV-1) is de veroorzaker van het acquired immunodeficiency syndrome, ofwel AIDS. HIV-1 infecteert een specifieke groep witte bloedcellen waardoor patiënten geleidelijk hun afweer verliezen. Tegenwoordig zijn er effectieve medicijnen beschikbaar om het virus af te remmen en daardoor de afname van het aantal witte bloedcellen tegen te gaan. Omdat het virus niet geheel uit het lichaam verdwijnt, is het belangrijk dat patiënten deze medicijnen strikt elke dag innemen om een blijvend therapiesucces te boeken. De medicijnen kunnen, zeker na langdurig gebruik, bijwerkingen hebben en het kan daarom lastig zijn voor patiënten om trouw aan de therapie te blijven, waardoor de kans bestaat dat het virus resistent wordt tegen de antivirale middelen. Er blijft dus een grote vraag naar alternatieve manieren om HIV-1 te bestrijden. Daarnaast is er een grote behoefte aan een veilig vaccin dat beschermt tegen het oplopen van de HIV-1 infectie. Het wordt algemeen geaccepteerd dat de HIV-1 varianten zoals wij die kennen zijn afgeleid van een soortgelijk virus dat aanwezig is in primaten. In het bijzonder het simian immuundeficiëntie virus (SIV) uit de chimpanzee Pan troglodytes (SIVcpz) lijkt verantwoordelijk te zijn voor de huidige HIV-1 epidemie onder mensen. SIV infectie in apen wordt daarom beschouwd als een geschikt model-systeem voor HIV-1 onderzoek, met name voor het testen van de effectiviteit van vaccins. Een belangrijk eiwit van zowel SIV als HIV is het kleine Tat eiwit dat essentieel is voor de genexpressie. Nadat het virus de gastheercel heeft geïnfecteerd, wordt het genetisch RNA materiaal van het virus omgezet in DNA dat vervolgens integreert in het menselijk DNA. Vervolgens moet het proces van transcriptie plaatsvinden om het DNA af te lezen en nieuw RNA te produceren. Deze transcriptie stap van de genexpressie wordt nauwkeurig gereguleerd door het virus. De eerste RNA moleculen zorgen voor de productie van een klein beetje Tat eiwit, dat aan een haarspeldstructuur genaamd TAR bindt aan het begin van de virale RNA transcripten. Door een interactie met de cellulaire transcriptie machinerie is Tat in staat het transcriptie proces enorm te stimuleren. Dit levert meer Tat en meer virale transcripten op, en uiteindelijk kunnen alle virale eiwitten gemaakt worden om nieuwe virusdeeltjes te assembleren. & In verscheidene studies is gesuggereerd dat Tat niet alleen belangrijk is voor de transcriptie van HIV-1, maar ook voor diverse andere processen tijdens de virale replicatiecyclus. Het is echter moeilijk om deze andere functies van het Tat eiwit goed te bestuderen omdat het virus niet meer repliceert wanneer Tat geïnactiveerd wordt. Daarnaast is er relatief weinig bekend over de rol van 149
Tat tijdens de SIV replicatie omdat het meeste onderzoek is gericht op HIV-1 Tat. Wij hebben gebruik gemaakt van een conditioneel-replicerende SIV variant (SIV-rtTA) om de rol van SIV Tat nader te bestuderen. In SIV-rtTA is het doxycycline-afhankelijk Tet-On systeem voor gereguleerde genexpressie ingebouwd waardoor het Tat-TAR mechanisme niet meer nodig is voor transcriptie. Het TAR element kan nu ook gemuteerd worden zodat Tat er niet meer aan kan binden. Het ingebouwde rtta eiwit vervangt Tat als transcriptie-activator. In de aanwezigheid van doxycyline (dox) kan rtta aan de teto elementen binden die zijn ingebouwd in de SIV promoter en vervolgens de transcriptie activeren. In de afwezigheid van dox kan rtta niet aan de teto elementen binden, waardoor er geen transcriptie plaats vindt en de virusreplicatie uit staat. In hoofdstuk 2 beschrijven wij de constructie van twee nieuwe SIV-rtTA varianten met mutaties in Tat (Tat AUGmut en Tat stop ) waardoor Tat niet meer geproduceerd kan worden. Deze nieuwe virus varianten repliceren efficiënt in het laboratorium op verschillende cellijnen en bloedcellen van de makaak. Hieruit kunnen wij concluderen dat er geen andere essentiële Tat functies zijn buiten de welbekende rol in de activatie van transcriptie. Na enkele maanden van passage van dit virus in het laboratorium blijkt er echter wel evolutionaire druk aanwezig om de aanmaak van Tat te herstellen. We tonen vervolgens aan dat Tat nog altijd noodzakelijk is voor optimale transcriptie van SIV-rtTA. Door andere domeinen van de virale promoter te vervangen, slagen we er vervolgens in om een compleet Tat-onafhankelijke SIV-rtTA te creëren. Hieruit blijkt dat Tat de SIV replicatie, en met name de transcriptie, niet alleen kan activeren door aan TAR te binden, maar ook door een interactie aan te gaan met andere promoter elementen. Er waren op ons laboratorium eerdere pogingen gedaan om Tat te inactiveren door middel van een inactiverende mutatie in het Tat eiwit (Y55A). Echter, dit virus was volledig replicatieincompetent en kon ook niet via evolutie verbeterd worden. Omdat deze bevinding de eerder beschreven resultaten uit hoofdstuk 2 tegenspreken, hebben we in hoofdstuk 3 onderzocht waarom deze SIV-rtTA-Tat Y55A variant niet functioneel was. We maten geen verschillen tussen het virus met wild-type en mutant Tat in genexpressie en virus productie. In de SIV-rtTA-Tat AUGmut variant vindt er geen translatie van Tat plaats omdat het startcodon is gemuteerd. Vervolgens hebben we bekeken of de Y55A mutatie (per ongeluk) resulteerde in de mutatie van een onderliggend RNA signaal, bijvoorbeeld betrokken bij de RNA splicing. RNA analyses duidden inderdaad op een verandering van het SIV RNA splicing patroon: vooral de productie van een alternatief Rev/Env transcript (SA5 transcript: zie verderop) bleek sterk verhoogd. Eiwit analyses toonden aan dat het virus een kleiner Envelop (Env) eiwit produceerde. Daaropvolgende sequentie analyse van het SIVrtTA-Tat Y55A genoom toonde aan dat deze afwijkende Env productie niet door de verandering in 150
splicing werd veroorzaakt maar door een toevallige deletie van 2 nucleotiden in het Env gen. Deze mutatie veroorzaakt een frame-shift en vroegtijdige stop tijdens de Env vertaling en verklaart daarmee waarom dit SIV-rtTA-Tat Y55A virus niet replicatie-competent was. Nadat transcriptie heeft plaatsgevonden, vindt er splicing plaats van het RNA waarin er delen uit het RNA molecuul worden geknipt. Voor HIV/SIV gebeurt dit op verschillende specifieke plekken om een diverse groep messenger RNAs (mrnas) te creëren die elk voor een ander eiwit coderen tijdens het proces van mrna vertaling, ofwel translatie. Een groep van drie RNA nucleotiden vormen een codon welk voor een specifiek aminozuur codeert, de bouwstenen van eiwitten. Het eerste codon van een open leesraam waar de vertaling tot eiwit start is normaliter het startcodon AUG, omringd door een bepaalde combinatie van nucleotiden (de zogenaamde Kozak sequentie) die nodig is om goed herkend te worden als startsignaal. Ribosomen (de vertalingsmachines in de cel) binden aan het 5 -uiteinde van mrnas en scannen totdat ze een goed startcodon tegenkomen. De codons worden vertaald naar aminozuren die tezamen een eiwitketen vormen, totdat de ribosomen een stopcodon herkennen aan het einde van het open leesraam en het mrna verlaten. Het complexe proces van splicing zorgt er voor dat er voor elk van de 9 SIV/HIV eiwitten één mrna wordt gemaakt waarop het startcodon van het bewuste open leesraam vooraan ligt. In principe wordt alleen het eerste startcodon herkend en gebruikt. Echter, mist het eerste startcodon de optimale Kozak sequentie, dan zal een gedeelte van de ribosomen dit startcodon overslaan en de vertaling van eiwit pas beginnen bij het volgende startcodon. Voor SIV/HIV leek de simpele regel te bestaan: de productie van alle eiwitten begint op het startcodon dat zich vooraan op het mrna bevindt. Het eerder genoemde SA5 transcript (alternatieve Rev/Env mrna) is erg bijzonder omdat er meerdere startcodons aanwezig zijn voor de echte Rev AUG. Deze hebben wij upstream AUG ofwel uaug 1, 2 en 3 genoemd. Daarnaast is er ook op het normale Rev/Env mrna (SA6 transcript) één AUG aanwezig vlak voor het Rev startcodon, welke wij uaug4 hebben genoemd. Bovendien is het Rev/Env transcript bijzonder omdat dit het enige SIV mrna is dat voor twee eiwitten kan coderen. Ook dit heeft consequenties voor de regulatie van Env translatie want naast uaug1-4 is de Rev AUG altijd aanwezig voor de Env AUG. Al deze uaugs kunnen het gebruik van stroomafwaarts gelegen AUGs en de expressie van de bewuste eiwitten moduleren. Daarom hebben wij de rol van de uaugs in de productie van Rev en Env nader bepaald (hoofdstuk 4). Het blijkt dat de uaugs aanwezig zijn om de hoeveelheid Rev en Env eiwit die wordt gemaakt nauwkeurig te reguleren. Gebalanceerde expressie lijkt belangrijker dan maximale productie, wellicht omdat te hoge eiwitexpressie contraproductief is voor het virus of toxisch voor de gastheercel. De & 151
uaug4 blijkt de translatie vanaf de Rev AUG te onderdrukken en de Rev AUG op zijn beurt remt gebruik van de Env AUG. Dit scenario leidt er toe dat uaug4 per saldo de translatie vanaf de Env AUG verhoogt. Dat de regulatie van translatie door uaug4 belangrijk is voor optimale SIV replicatie blijkt uit een experiment waarin we laten zien dat het wild-type virus sneller repliceert dan een variant waarin de uaug4 sequentie is veranderd. In hoofdstuk 5 verdiepen wij ons verder in het mechanisme van de regulatie van Rev en Env translatie. De Kozak sequentie rondom uaug4 lijkt geoptimaliseerd om goede onderdrukking van de Rev translatie en tegelijkertijd maximale Env translatie te bereiken. Het uaug4 startcodon opent een ultra-kort open leesraam dat eindigt op een stopcodon dat overlapt met het Rev startcodon. Door de stopcodon van dit ultra-korte leesraam te verschuiven, zien we dat deze overlap zorgt voor een stimulatie van Env translatie terwijl het effect op Rev translatie minimaal is. Deze overlap situatie lijkt bij te dragen aan een juiste verhouding van de Rev en Env eiwitten. Deze genetische overlap is met meerdere mutaties getest in de luciferase constructen, maar veel van deze mutaties kunnen niet zomaar in het volledige SIV genoom aangebracht worden zonder daarbij ook het Tat open leesraam te wijzigen. Daarom is gebruik gemaakt van het SIV-rtTA-Tat stop construct waarin Tat niet nodig is (en zelfs niet gemaakt wordt). Western blot analyses bevestigen dat de hoeveelheid Env eiwitproductie afneemt als uaug4 gemuteerd wordt of de uaug4-rev overlap situatie gewijzigd wordt. Gevoelige virus competitie-experimenten tonen aan dat deze mutaties ook leiden tot een afname van het SIV replicatievermogen. De resultaten van hoofstuk 4 en 5 geven ons een beeld van de ribosomale stromen op de SIV Rev/Env mrnas en de ingewikkelde mechanismen die door SIV gebruikt worden om de Rev en Env eiwitproductie te reguleren. Vaccinatie met een levend-verzwakt virus is zeer effectief gebleken tegen verschillende virussen (polio, mazelen, vaccinia). Een levend-verzwakt virus is niet ziekteverwekkend, maar roept wel een sterke immuun respons op welke beschermt tegen toekomstige infecties met het virus. Ook vaccinatie studies met levend-verzwakt SIV in apen lieten goede bescherming zien tegen een pathogene SIV variant. Helaas bleek het vaccin virus te kunnen evolueren naar een goed replicerend en ziekteverwekkende variant. Verbetering van de veiligheid is daarom cruciaal voor de verdere ontwikkeling van een levend-verzwakt HIV vaccin. HIV-rtTA (een conditioneelreplicerende HIV-1 variant) en SIV-rtTA zijn niet alleen een goed stuk gereedschap om verschillende aspecten van de virusreplicatie te bestuderen, maar omdat de transcriptie en daarmee de replicatie van deze virus varianten aan en uit gezet kan worden (door wel of geen dox te geven), maken zij ook een nieuwe aanpak mogelijk voor de ontwikkeling van een veilig vaccin tegen HIV-1. De nieuwe vaccinatie-strategie beoogt om het vaccin-virus aan te zetten totdat 152
beschermende immuniteit is verkregen, waarna het virus definitief uit gezet kan worden. Op deze manier wordt evolutie naar een potentieel ziekteverwekkend virus voorkomen. Het concept van HIV-rtTA als vaccin stam is getest in muizen met een gehumaniseerd immuunsysteem (HISmuis; hoofdstuk 6). Drie groepen muizen zijn met verschillende virussen geïnfecteerd: HIV-rtTA, het oorspronkelijke HIV-1 LAI virus en de daarvan afgeleide LAI-ΔNef mutant welke - net zoals HIV-rtTA - de Nef functie mist. Elke groep kreeg dox toegediend in het eten en werd 10 weken gevolgd. Dit experiment toont voor de eerste keer aan dat HIV-rtTA efficiënt kan repliceren in vivo. Het wild-type HIV-1 LAI virus repliceert nog wat efficiënter, maar veroorzaakt een snelle en forse afname van het aantal CD4 + T target cellen. Tijdens de HIV-rtTA infectie blijft het aantal van deze cellen stabiel. De controle HIV-1 LAI-ΔNef infectie toont aan dat dit verschil niet veroorzaakt wordt door de aan/afwezigheid van het Nef eiwit. Daarnaast is de genetische stabiliteit van HIVrtTA getest en blijken er geen mutaties geselecteerd te worden die het virus minder doxafhankelijk zouden kunnen maken. Wellicht is het in de toekomst mogelijk echte vaccin testen uit te voeren in dit HIS-muis model. Deze analyses moeten uiteraard aangevuld worden met uitgebreide SIV-rtTA experimenten in het standaard makaken-model voordat deze unieke vaccinatiestrategie voorgedragen kan worden voor verdere ontwikkeling en een uiteindelijke test op de mens. & 153