SPOT-Light HER2 CISH-set

SPOT-Light HER2 CISH-set Cat. nr. 84-0150 20 tests met dekglaasjes van 24 mm x 30 mm Beoogd gebruik Voor in vitro diagnostiek De SPOT-Light HER2 CISH-set is bedoeld om de HER2-genamplificatie kwantitatief te bepalen in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) secties van borstcarcinoomweefsel gebruikmakend van chromogene in situ hybridisatie (CISH) en Bright-Field-microscopie. Deze test moet worden uitgevoerd in een histopathologisch laboratorium. De SPOT-Light HER2 CISH-set is bedoeld als hulpmiddel bij de beoordeling of patiënten voor een Herceptin (trastuzumab) behandeling in aanmerking komen. De testresultaten zijn bedoeld voor gebruik als een adjuvans voor clinicopathologische informatie die momenteel wordt gebruikt als onderdeel van de verzorging van patiënten met borstkanker. De interpretatie van de testresultaten moet worden uitgevoerd binnen de context van de klinische voorgeschiedenis van de patiënt en door een gekwalificeerde patholoog. Samenvatting en uitleg Het humane gen HER2, of c-erbb-2, en het equivalente ratgen, neu, zijn geïdentificeerd als proto-oncogenen (1-3) die de homologie delen met het nauw verwante v-erbb-oncogen. (1) Het HER2-gen bevindt zich op chromosoom 17 (17q11.2-21) en codeert een 185 kda membraanreceptorachtig eiwit. Het HER2-eiwit bevat tyrosinekinaseactiviteit en deelt de homologie met, maar verschilt van, de epidermale groeifactorreceptor (ook bekend als EGFr, HER1, of c-erbb-1). (2) HER2-genamplificatie of overexpressie van het HER2-eiwit is geïdentificeerd bij 18 30% van de humane borstkankers. (8-9) Identificatie van de HER2-genamplificatiestatus is belangrijk voor het bepalen van de prognose van patiënten die zijn gediagnosticeerd met invasieve borstkanker, evenals bij het selecteren van patiënten die in aanmerking komen voor een behandeling met rastuzumab (Herceptin, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Zwitserland en Genentech, Inc., South San Francisco, CA). (4-6) Trastuzumab is een monoklonaal antilichaam specifiek voor het HER2-eiwit. Van trastuzumab is aangetoond dat het alleen een doeltreffende behandeling is bij patiënten met tumoren die een HER2-genamplificatie en/of een overexpressie van HER2-eiwit laten zien. (7,11) Bij een vroegtijdige borstkanker heeft een korte kuur van trastuzumab gelijktijdig toegediend met docetaxel of vinorelbine aangetoond dat het doeltreffend is bij vrouwen met borstkanker met een geamplificeerd HER2/neugen. (12) Andere onderzoeken hebben ook aangetoond dat de HER2-status de gevoeligheid voor, of weerstand tegen, bepaalde chemotherapieën voorspelt. (13) Daarom zijn nauwkeurige, consistente en duidelijke methoden voor de evaluatie van de status van het HER2-gen en HER2-eiwit steeds belangrijker geworden. PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 1 van 25

Principes van de procedure De CISH-techniek maakt gebruik van digoxigenine-gelabelde DNA-sondes die specifiek zijn voor de HER2- genlocus op chromosoom 17q11.2-21 om te hybridiseren met de aanvullende nucleïnezuren die in het borstkankermonster aanwezig zijn. De gelabelde HER2-sonde wordt vervaardigd met behulp van de Subtraction Probe Technology (SPT ), een door eigendomsrecht beschermde en gepatenteerde technologie die specifieke sondes maakt door de herhalende sequenties (bijv. Alu- en LINE-elementen) te verminderen die aanwezig zijn in de humane nucleïnezuren. Het is door PCR aangetoond dat de sonde het HER2-gen bevat en zich met name bindt aan de HER2-genlocus op chromosoom 17q11.2-21 met metafase FISH bij normale lymfocyten. Bijgevolg zijn de SPT -sondes van Invitrogen inherent specifiek en vereisen geen blokkade van herhaalde sequenties, zoals vereist is bij conventionele cytogene DNA-sondes. Met de CISH-techniek kunnen genetische afwijkingen worden beoordeeld onder een Bright-Field-microscoop met behulp van chromogene detectie. CISH-kleuringsresultaten kunnen duidelijk worden gevisualiseerd met een standaard Bright-Field-microscoop en een 40X droge lens. De status van de HER2-genamplificatie kan worden weergegeven binnen de context van de morfologie van het omliggende weefsel. Na verwijdering van de paraffine worden de monsters voorbehandeld met een warmteterugwinningsstap gevolgd door enzymdigestie. De monsters worden vervolgens gedehydrateerd en aan de lucht gedroogd voordat de HER2- sonde wordt toegevoegd. Na toevoeging van de sonde en het dekglaasje aan het monster, wordt de combinatie gedenatureerd en gehybridiseerd gedurende meer dan 10 uur of gedurende de nacht. Daarna wordt het monster gewassen om de ongehybridiseerde sonde te verwijderen en wordt het signaal chromogeen waargenomen door een consecutieve toevoeging van het antilichaam aan het conjugaat van digoxigenine en mierikswortelperoxidasepolymeer (HRP). De kleur wordt verkregen door de reactie van de binding van HRP met het DAB-chromogen en het H 2 O 2- substraat. Uiteindelijk wordt het monster tegengekleurd met hematoxyline van Mayer om de morfologie van het weefsel te identificeren en wordt er een dekglaasje op geplaatst. Het HER2-gensignaal wordt geïdentificeerd als een enkele, donkere punt in het geval van weinig kopieën of als bruine clusters als het signaal wordt weergegeven in vele kopieën. Gebieden van tumorcellen kunnen eenvoudig worden geïdentificeerd onder het objectief met een laag vermogen van een Bright-Field-microscoop en de HER2-genkopieën die zijn gekwantificeerd met het 40X-objectief. Met behulp van een Bright-Field-microscoop met een 40X-objectief, worden de tumorcellen gelokaliseerd en worden de HER2-genkopieën gekwantificeerd. Het DAB vormt een gekleurd precipitaat, zodat de resultaten op een later tijdstip kunnen worden gearchiveerd en bekeken. Geleverde materialen De SPOT-Light HER2 CISH-set bevat alle reagentia om de CISH-procedure uit te voeren op in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefsels. De materialen die hieronder staan vermeld, zijn voldoende voor een totaal van 20 tests en maximaal 2 runs met de twee controleglaasjes, waarbij gebruik wordt gemaakt van weefselmonsters met dekglaasje van 24 mm x 30 mm. Er kunnen meer tests worden uitgevoerd als er kleinere dekglaasjes worden gebruikt. De SPOT-Light HER2 CISH-set wordt verzonden op koelpads. Koelpads moeten nog koud zijn bij ontvangst van de zending om te waarborgen dat de verpakking niet is blootgesteld aan hoge temperaturen. Sommige onderdelen kunnen onbevroren blijven en dit zal geen invloed hebben op de prestatie van de set. Raadpleeg Opslag van reagens voor een directe opslag na ontvangst van deze onderdelen. Reagens A. Oplossing voor warmtevoorbehandeling 1 l, bevat Tris-EDTA-buffer (klaar voor gebruik) Reagens B. Reagens voor enzymvoorbehandeling 5 ml, bevat pepsine-oplossing met 0,05% natriumazide en detergens (klaar voor gebruik) LET OP! Schadelijk Reagens C. HER2-sonde 0,4 ml digoxigenine-gelabelde SPOT-Light HER2-sonde in hybridisatiebuffer met formamide (klaar voor gebruik) LET OP! Schadelijk Reagens D. SSC-buffer 500 ml, bevat natriumcitraat met zoutoplossing (SSC) (klaar voor gebruik) PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 2 van 25

Reagens E1. PBS-poeder 3 verpakkingen, elk voldoende voor 1 l PBS Reagens E2. Tween 20 (50%) 2 ml, Tween 20 in 50% oplossing Reagens F. CAS-Block TM 3 ml, bevat buffer, stabilisator en 0,1% natriumazide (klaar voor gebruik) LET OP! Schadelijk Reagens G. Anti-digoxigenine antilichaam van muis 3 ml, bevat BSA, buffer en 0,1% natriumazide (klaar voor gebruik) LET OP! Schadelijk Reagens H. Anti-muis HRP-polymeerconjugaat van geit 3 ml, bevat stabilisator, buffer, 0,005% gentamycinesulfaat en 0,1% Proclin 300, (klaar voor gebruik) Reagens I1. DAB-substraatbuffer (20x) 1 ml, concentraat bevat buffer Reagens I2. DAB-oplossing (20x) 1 ml, concentraat bevat 85% w/v methanol LET OP! Ontvlambaar en toxisch Reagens I3. Waterstofperoxide (20x) 1 ml, 0,6% H 2 O 2 Reagens J. Hematoxyline van Mayer 100 ml (klaar voor gebruik) Reagens K. Histomount TM -preparatieoplossing 4 ml (klaar voor gebruik) LET OP! Zeer ontvlambaar en schadelijk Controleglaasje L. Procedurele controlecelglaasjes 2 glaasjes, elk met twee (2) in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) cellijnen, naast elkaar geplaatst: A) HER2 niet-geamplificeerd (MCF-7) en B) HER2 geamplificeerd (SK-OV-3) [Niet-geamplificeerde cellijn met telbare resultaten wordt aanbevolen voor een optimale testcontrole.] VEREISTE REAGENTIA/MATERIALEN EN APPARATUUR, MAAR NIET VOORZIEN Aanvullende reagentia/materialen Invitrogen Cat. nr. 1. SuperFrost Plus-glaasjes OF Histogrip TM -glaasjeskleefstof 00-8050 2. Positieve weefselcontrole: FFPE borstcarcinoom (ductaal, tubulair, lobulair of gemengd type) weefselsectie met HER2-genamplificatie die eerder is bevestigd met CISH of FISH 3. Negatieve weefselcontrole: FFPE borstcarcinoom (ductaal, tubulair, lobulair of gemengd type) weefselsectie zonder HER2-genamplificatie die eerder is bevestigd met CISH of FISH 4. Gedeïoniseerd of gedistilleerd water (dh 2 O) 5. Xyleen 6. 70%, 85%, 95% en 100% ethanol (EtOH) 7. Dekglaasjes, rubbercement, naald van 18 G ½ en spuit van 5 ml OF 8. UnderCover TM -dekglaasjes (18 x 18 mm) 00-8403 9. UnderCover TM -dekglaasjes (22 x 22 mm) 00-8404 10. 30% waterstofperoxide (H 2 O 2 ) 11. 100% methanol PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 3 van 25

Apparatuur 1. Tijdschakelaar 2. Pipet (20 µl, 1000 µl) 3. Pipettips 4. Glaasjeshouder 5. Verwarmingsplaat, aluminiumfolie en beker van 1 l 6. Glaasjesopwarmer 7. 37 C incubator 8. PCR thermal cycler met glaasjesblok OF Verwarmingsblok met digitale thermometer en 37 C incubator (± 1 C) en vochtigheidsglaasjesdoos 9. Waterbad (geschikt voor het handhaven van een temperatuurbereik van 70 80 C) met een gekalibreerde thermometer 10. Coplin-glazen en kleurpotten 11. Bright-Field-microscoop met 20X- en 40X-objectieven Voorzorgsmaatregelen Voor in vitro diagnostiek. Voor getrainde professionele gebruikers. Set niet gebruiken na de uiterste houdbaarheidsdatum vermeld op het etiket. Wanneer het product onder andere omstandigheden dan die worden vermeld op de bijsluiter in de verpakking wordt opgeslagen, moeten die opslagomstandigheden worden gecontroleerd door de gebruiker. Niet eten, drinken, roken of make-up opdoen in de ruimte waar de materialen uit de set worden gehanteerd. Universeel geaccepteerde goede laboratoriumgebruiken en -gewoontes moeten worden nageleefd. Geen enkele beschikbare testmethode kan volledige zekerheid verschaffen voor het elimineren van mogelijk biologisch gevaarlijke risico s. Hanteer alle materialen op een bioveiligheidsniveau 2, zoals aanbevolen voor elk mogelijk besmettelijk humaan materiaal in de handleiding Centers for Disease Control/National Institutes for Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4 de editie, April 1999. Pipetteer reagentia niet met de mond en vermijd contact van de huid en de slijmvliezen met de monsters en reagentia. Indien reagentia met de huid of de slijmvliezen in contact komen, spoel dan de betroffen gebieden overvloedig met water. Reagentia B, F en G bevatten 0,1% natriumazide, reagens H bevat 0,005% gentamycinesulfaat en 0,1% Proclin, reagens I2 bevat 85% w/v methanol en reagens I3 bevat 0,6% waterstofperoxide. Bij deze concentraties voor het product behoeven deze reagentia geen gevarenetiket. Raadpleeg het Material Safety Data Sheet (MSDS) van de betreffende component voor verdere informatie. Reagens B bevat pepsine en dit enzym kan allergische reacties veroorzaken bij huidcontact. Gebruik een temperatuurgekalibreerd waterbad, verwarmingsblok en hybridisatieoven voor optimale resultaten. Sommige van de reagentia in deze set bevatten natriumazide als houdbaarheidsmiddel. Natriumazide kan reageren met loden of koperen leidingen en explosieve metaalaziden vormen, met name in het geval van ophopingen. Spoel bij het afvoeren van reagentia met natriumazide na met grote hoeveelheden water om een opbouw van chemische gevaren in de leidingen te voorkomen. Sommige reagentia in deze set bevatten Proclin, natriumazide of waterstofperoxide. Deze reagentia worden geclassificeerd als schadelijk, omdat ze irriterend zijn voor de huid en de slijmvliezen. Deze substanties worden geleverd in verdunde vorm als onderdeel van deze set, waardoor de risico s van blootstelling aanzienlijk, maar niet volledig, kunnen worden verminderd. Vermijd contact met huid, ogen en kleding. Raadpleeg het Material Safety Data Sheet (MSDS) van de component voor verdere informatie. 3,3 -diaminobenzidine tetrachloride (DAB) kan schadelijk zijn bij inslikken, inademen of absorptie via de huid en kan leiden tot irritatie aan ogen, huid, slijmvliezen en het bovenste deel van de luchtwegen. DAB is vermoedelijk een carcinogeen; raadpleeg de federale, nationale en/of lokale regelgeving voor aanbevelingen inzake de afvoer. Vermijd vervliegen van reagens I2. Methanol vervliegt eenvoudig. Onderneem stappen om vervlieging te vermijden, door bijvoorbeeld de container af te dichten en de deksel direct na gebruik weer te sluiten. De vervlieging van methanol kan een precipitatie van DAB veroorzaken, wat van invloed kan zijn op de kleuringsresultaten. Vermijd vervlieging tijdens hybridisatie door te garanderen dat de glaasjes goed zijn afgedicht en dat de hybridisatiekamer voldoende vochtig is. Enzymvoorbehandeling kan variëren aan de hand van fixatie en weefseldikte. Voor de meeste weefselsecties (4 5 µm) met 10% neutraal gebufferde formaline gefixeerd, zijn 5 minuten van PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 4 van 25

voorbehandeling met enzymen optimaal. Voor weefsel met een onbekende fixatie moet een enzymtitratie (bijv. 2 minuten, 5 minuten en 10 minuten) worden uitgevoerd met een optimale digestietijd die is afgesteld op basis van de initiële resultaten. Reagens C Gelabelde HER2-sonde bevat formamide, wat schadelijk is. R21 Schadelijk bij huidcontact R22 Schadelijk bij inslikken R61 Kan schadelijk zijn voor het ongeboren kind S24 Huidcontact vermijden S36 Draag geschikte beschermende kleding S37 Draag geschikte handschoenen S39 Draag oog-/gezichtsbescherming Reagens I2 DAB-oplossing bevat methanol, wat ontvlambaar en toxisch is. Raadpleeg het Material Safety Data Sheet (MSDS) voor verdere informatie. R10 Ontvlambaar R23/24/25 Toxisch bij inademing, huidcontact en inslikken S45 In geval van een ongeluk of indien u zich onwel voelt, roep direct medische hulp in S36 Draag geschikte beschermende kleding S37 Draag geschikte handschoenen Reagens K Histomount-preparatiemiddel bevat tolueen, wat zeer ontvlambaar en schadelijk is bij inademing. Raadpleeg het Material Safety Data Sheet (MSDS) voor verdere informatie. R11 Zeer ontvlambaar R20 Schadelijk bij inademing S2 Buiten bereik van kinderen houden S16 Uit de buurt houden van ontstekingsbronnen niet roken S25 Contact met ogen vermijden S29 Niet legen in afvoerputten S33 Neem voorzorgsmaatregelen tegen statische ontladingen Alle reagentia aangeduid als klaar voor gebruik zijn optimaal verdund. Verdere verdunning kan de testresultaten negatief beïnvloeden. Incubatietijden, reagentia en temperaturen zijn geoptimaliseerd. Gebruik van andere incubatietijden, reagentia of temperaturen kan de testresultaten negatief beïnvloeden. Gebruik van andere weefselfixatieven of -dikten wordt niet aanbevolen en kan de testresultaten negatief beïnvloeden. Raadpleeg de lokale regelgeving over de afvoer van mogelijk toxische onderdelen. Minimaliseer de microbiologische contaminatie om niet-specifieke kleuring te vermijden. Gebruik ruim voldoende voorzorgsmaatregelen bij het hanteren van reagentia. Draag wegwerphandschoenen, jas en veiligheidsbril bij het hanteren van vermoedelijke carcinogenen. Opslag van reagens SPOT-Light HER2 CISH-set opslaan bij 2 8 C. Reagens J opslaan op kamertemperatuur (15 30 C). NB: reagens B kan negatief worden beïnvloed bij blootstelling aan hoge temperaturen. Dit reagens direct na gebruik opslaan bij 2 8 C. Dit reagens niet opslaan op kamertemperatuur. Werkende PBS Tween 20-buffer opslaan op kamertemperatuur (15 30 C) gedurende maximaal 1 week. Set niet gebruiken na de uiterste houdbaarheidsdatum die staat vermeld op het etiket. Wanneer het product onder andere omstandigheden dan die worden vermeld op de bijsluiter in de verpakking wordt opgeslagen, moeten die opslagomstandigheden worden gecontroleerd door de gebruiker. Er zijn geen zichtbare tekenen die duiden op de instabiliteit van dit product; het is daarom belangrijk om de controleglaasjes te beoordelen. Neem contact op met de technische dienst als een probleem wordt vermoed bij deze set. PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 5 van 25

Gebruiksaanwijzing A. Voorbereiden van monster In paraffine ingebedde weefselsecties: Weefsel dat in neutraal gebufferde formaline gedurende 6 48 uur voorafgaand aan de inbedding in paraffine is gefixeerd, is geschikt voor gebruik. Andere fixatieven dan 10% neutraal gebufferde formaline zijn niet geoptimaliseerd voor dit protocol en zijn niet geschikt voor gebruik. Weefselsecties (4 5 µm dik) moeten worden geplaatst op met HistoGrip behandelde glaasjes of op Superfrost Plus-glaasjes. Gebruik, wanneer mogelijk, weefselsecties van gestandaardiseerde dikte om de uniforme kleuring van CISH-detectie en tegenkleuring te garanderen van reagentia 28 Droog de glaasjes aan de lucht of droog ze op 37 C en bak ze daarna gedurende 2 4 uur op 60 C. Goed gefixeerd en ingebed weefsel is oneindig houdbaar voorafgaand aan het sectioneren en plaatsen van het glaasje mits opgeslagen op een koele en droge plaats (15 30 C). 26,27 Weefselsecties van 2 3 µm dik kunnen incorrect lage genkopieresultaten geven. B. Standaard CISH-procedure voor FFPE weefselsecties Procedurele opmerkingen Alle reagentia, uitgezonderd reagens C (HER2-sonde) moeten worden gekalibreerd op kamertemperatuur (15 30 C), voorafgaand aan het gebruik. De HER2-sonde kan koud worden gebruikt zonder kalibratie tot kamertemperatuur. Elke incubatie moet worden uitgevoerd op kamertemperatuur (15 30 C), tenzij anders staat aangegeven. Tenzij anders aangegeven is het gedurende de gehele procedure belangrijk dat de weefselsectie niet uitdroogt tussen de stappen. Tijdens de gehele procedure zijn er meerdere wasbeurten vereist. Voor elke wasbeurt moet een nieuwe oplossing worden gebruikt. De controleglaasjes moeten samen worden gebruikt bij elk gebruik van de testglaasjes van de patiënt en moeten bij alle stappen op dezelfde manier worden behandeld als de testmonsters. Tenzij anders aangegeven, worden alle stappen uitgevoerd op kamertemperatuur (15 30 C). Deze procedure vereist meer dan acht uur voor voltooiing: een handige splitsing wordt hieronder weergegeven, beginnende op dag 1 met verwijdering van de paraffine tot en met denaturatie en hybridisatie (tijdens de nacht), doorlopend op dag 2 met de stringente wasbeurt tot en met de Bright- Field-microscopie. Invitrogen-reagentia die bij de set zijn geleverd, zijn noodzakelijk voor de CISH-procedure. Het gebruik van andere reagentia kan resulteren in een hoog achtergrondsignaal of een afname of verlies van het CISHsignaal. Substitutie van een van de reagentia die in de set is geleverd, kan de resultaten van de test nietig doen verklaren. Dag 1 van procedure 1. Voorbereiding van reagens Xyleen (2 glaasjesrecipiënten), 100% EtOH (3 glaasjesrecipiënten) o Goed afsluiten en opslaan gedurende maximaal 1 week op kamertemperatuur (15 30 C) of totdat 100 glaasjes zijn verwerkt. Ethylalcohol (EtOH)-serie o Bereid aparte houders voor van 70%, 85%, 95% en 100% EtOH. PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 6 van 25

o Goed afsluiten en opslaan gedurende maximaal 1 week op kamertemperatuur (15 30 C) of totdat 100 objectglaasjes zijn verwerkt. Label elke wasreagens naar behoren en noteer de volgorde van gebruik in de procedure, waarbij u die volgorde behoudt. 2. Verwijdering van paraffine NB: bereid voor elke houder voldoende reagentia voor die vereist zijn voor het aantal glaasjes bij de uitvoering. Elke wasbeurt vereist een apart volume van reagens. Als de volgende stap niet direct kan worden uitgevoerd, moet u de glaasjes aan de lucht drogen nadat ze drie keer in 100% EtOH zijn geweekt, in plaats van dat de glaasjes drie keer in dh2o worden gewassen. a) Onderdompelen in xyleen 2 keer, 5 minuten elke keer b) Weken in 100% EtOH 3 keer, 3 minuten elke keer c) Wassen in dh2o 3 keer, 2 minuten elke keer Een volledige verwijdering van paraffine is vereist voor optimale en reproduceerbare resultaten. 3. Warmtevoorbehandeling NB: de glaasjes moeten worden gekookt of opgewarmd tot een temperatuur van 98 C gedurende 15 minuten in een oplossing voor warmtevoorbehandeling (reagens A). De glaasjes mogen niet oververhit raken door te garanderen dat de temperatuur tussen de 98 C en 100 C blijft. Wij raden aan om de warmteplaat te gebruiken voor deze stap. (Voor protocollen die gebruik maken van een snelkoker met een druk- en temperatuurmeter of magnetron met temperatuurmeter, neem contact op met de technische dienst van Invitrogen via techsupport@invitrogen.com). Oplossing voor warmtevoorbehandeling (reagens A) kan maximaal twee keer worden gebruikt alvorens de oplossing af te voeren. a) Plaats de glaasjes in de houder. b) Warm de warmtevoorbehandelingsoplossing (reagens A) op in een bekerglas op een warmteplaat totdat de oplossing goed kookt en de temperatuur 98 C aangeeft. Om te voorkomen dat er buffer verdampt, moet het bekerglas worden bedekt met een glazen deksel of aluminiumfolie. c) Plaats de glaasjes in de kokende oplossing, bedek het bekerglas en begin te tellen vanaf het punt dat de temperatuur 98 C aangeeft of wanneer de kookbelletjes weer verschijnen en kook gedurende 15 minuten. Zorg ervoor dat de temperatuur tussen de 98 C en 100 C blijft. d) Draag de glaasjes direct over naar dh2o op kamertemperatuur (15 30 C). e) Drie keer wassen in dh2o, 2 minuten elke keer. 4. Enzymdigestie NB: voor de meeste borstweefsels geldt dat 5 minuten enzymdigestie op kamertemperatuur (15 30 C) optimale CISH-resultaten geeft. De digestietijd moet worden aangepast aan de hand van de initiële resultaten na 5 minuten digestietijd. Een andere enzymincubatietijd kan vereist zijn, afhankelijk van de weefseldikte en de fixatiemethode. Een onderzoek naar enzymdigestie heeft aangetoond dat de enzymdigestietijd kan liggen tussen de 2 en 20 minuten en een geschikt CISH-signaal geeft voor HER2-evaluatie in een set van archiefmonsters van borstweefsel. In een concordantie-onderzoek ter ondersteuning van het gebruik van CISH vergeleken met FISH, dat gebruikmaakte van klinische monsters van borstkankerweefsel die binnen 12 maanden van de onderzoeksdatum waren verwerkt, gaf een enzymdigestietijd van 5 minuten optimale CISH-signalen voor HER2-genevaluatie. (28) a) Equilibreer de reagens voor voorbehandeling met enzymen (reagens B) op kamertemperatuur (15 30 C). b) Voeg genoeg reagens B toe om de weefselsectie te bedekken en incubeer gedurende 5 minuten op kamertemperatuur (15 30 C). c) Drie keer wassen in dh2o, 2 minuten elke keer. 5. Dehydratie in gegradeerde ethanolserie: a) 70% EtOH 2 minuten b) 85% EtOH 2 minuten c) 95 % EtOH 2 minuten d) 100% EtOH 2 minuten e) 100% EtOH 2 minuten PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 7 van 25

6. Droog de glaasjes aan de lucht gedurende 20 minuten of totdat ze droog zijn. Label de glaasjes zo nodig met een pen. 7. Denaturatie en hybridisatie NB: gebruik een PCR thermal cycler met glaasjesblok of verwarmingsblok met digitale temperatuuraflezing en vochtigheidskamer voor de glaasjes met 37 C incubator, of gelijkwaardige instrumentatie. Controleer of de luchtvochtigheid in de kamers voldoende wordt gehandhaafd. Hybridisatie die gedurende kortere perioden wordt uitgevoerd, kan resulteren in een zwakker signaal. Sondedenaturatie op een temperatuur lager dan aanbevolen in het protocol kan resulteren in een zwak of afwezig CISH-signaal. Het wijzigen van de incubatietijden kan leiden tot een zwakker signaal of achtergrondkleuring. a) Voeg 15 µl HER2-sonde (reagens C) toe aan het midden van dekglaasje van 22 x 22 mm. Afhankelijk van de weefselgrootte kan er meer of minder sonde vereist zijn. Gebruik het volgende sondevolume op basis van de grootte van het dekglaasje: 18 mm x 18 mm 10 µl 22 mm x 22 mm 15 µl 24 mm x 30 mm 20 µl b) Plaats het dekglaasje, sondezijde omlaag, op het juiste gebied van het weefselmonster op het glaasje. De CISH UnderCover -glaasjes van Invitrogen kunnen worden gebruikt in plaats van de standaarddekglaasjes. Bij gebruik van CISH UnderCover -glaasjes haal het papier van de achterzijde en plaats de zijde met het blootgestelde dekglaasje (waar het papier net af is gehaald) op het juiste gebied van het glaasje om het weefselmonster te bedekken. De randen van de tape moeten worden aangedrukt om het dekglaasje af te dichten zodat er geen verdamping ontstaat. DRUK NIET OP HET MIDDEN VAN HET DEKGLAASJE. c) Bij gebruik van een standaarddekglaasje moet dat worden afgedicht om verdamping tijdens de incubatie te voorkomen. De afdichting wordt verkregen met een spuit van 5 ml en een naald van 18 G ½. Vul de spuit met rubbercement en breng een dunne laag aan op de randen van het dekglaasje, enigszins overlappend op het glaasje. d) Laat het rubbercement drogen (ongeveer 10 minuten) om te voorkomen dat het dekglaasje van het glaasje afglijdt. e) Denaturatie en hybridisatie kunnen worden uitgevoerd met een PCR thermal cycler met glaasjesblok of een verwarmingsblok met digitale temperatuuraflezing, samen met een luchtvochtigheidsglaasjesdoos en een 37 C incubator. 1) Bij gebruik van een PCR thernal cycler met glaasjesblok: denatureer bij 95 ºC (± 1 ºC) gedurende 5 minuten, gevolgd door een incubatie tijdens de nacht (10 18 uur) bij 37 ºC (± 1 ºC). 2) Bij gebruik van een verwarmingsblok en luchtvochtigheidskamer met een 37 C incubator: denatureer bij 95 ºC (± 1 C) gedurende 5 minuten, gevolgd door een incubatie tijdens de nacht (10 18 uur) bij 37 ºC (± 1 C) in een luchtvochtigheidskamer. Dag 2 van procedure 8. Voorbereiding van reagens PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) o Voeg 1 verpakking PBS-poeder (reagens E1) toe aan 1 l dh 2 O. Meng. PBS/Tween 20-buffer (0,01% Tween) o Voeg 10 druppels 50% Tween 20 (reagens E2) toe aan 1 l PBS (van bovenaf). Meng. o Opslaan op kamertemperatuur (15 30 C) gedurende maximaal 1 week. Substraat-chromogene oplossing (DAB) o Bereid deze oplossing direct vóór gebruik voor. o Voeg 1 druppel van elk reagens (I1, I2, I3) toe aan 1 ml dh 2 O. Meng goed. 3% H 2 O 2 in absoluut methanol o Voeg 1 deel 30% H 2 O 2 toe aan 9 delen methanol. o Goed afsluiten en opslaan gedurende maximaal 1 week op kamertemperatuur (15 30 C) of totdat 100 glaasjes zijn verwerkt. Xyleen (2 glaasjeshouders) o Goed afsluiten en opslaan gedurende maximaal 1 week op kamertemperatuur (15 30 C) of totdat 100 objectglaasjes zijn verwerkt. PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 8 van 25

9. Stringente wasbeurt Opmerking: het gebruik van hogere temperaturen dan aanbevolen door de procedure kan een afname of volledig verlies van het CISH-signaal geven. Wassen bij een te lage temperatuur kan resulteren in een hoog achtergrondsignaal. Een gekalibreerde thermometer moet worden gebruikt om te garanderen dat de juiste temperatuur van het waterbad is bereikt en wordt behouden. a) Zet het waterbad van 70 ºC (±1 C) aan en breng het op temperatuur. b) Bereid twee Coplin-glazen met SSC-buffer (reagens D) voor, één op kamertemperatuur en de andere verwarmd tot 70 C. c) Verwijder het rubbercement of het UnderCover -dekglaasje. Laat de weefselsectie niet uitdrogen. d) Om de dekglaasjes te verwijderen zonder het weefsel te scheuren: week de glaasjes voor in SSC op kamertemperatuur gedurende ca. 2 3 minuten, totdat de dekglaasjes er makkelijk afglijden. Ga dan verder met de volgende stap. e) Spoel de glaasjes kort in het glas met SSC op kamertemperatuur (15 30 C) en dompel ze daarna onder gedurende 5 minuten in het Coplin-glas met SSC in het waterbad van 70 ºC (±1 C). f) Was de glaasjes drie keer in dh2o, 2 minuten elke keer. 10. Immunodetectie a) Dompel de glaasjes onder in 3% H2O2 in 100% methanol gedurende 10 minuten. b) Was 3 keer in PBS/Tween 20 (0,01%), 2 minuten elke keer. c) Voeg CAS-Block TM (reagens F) toe: 2 3 druppels/glaasje of genoeg om het weefsel te bedekken en incubeer gedurende 10 minuten op kamertemperatuur(15 30 C). d) Dep Reagens F met een labdoekje af. Niet spoelen. e) Voeg muis anti-digoxigenine antilichaam (reagens G) toe: 2 3 druppels/glaasje of genoeg om het weefsel te bedekken en incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur (15 30 C). f) Was 3 keer in PBS/Tween 20 (0,01%), 2 minuten elke keer. g) Voeg anti-muis HRP-polymeerconjugaat van geit (reagens H) toe: 2 3 druppels/glaasje of genoeg om het weefsel te bedekken en incubeer op kamertemperatuur (15 30 C) in een vochtigheidskamer. h) Was 3 keer in PBS/Tween 20 (0,01%), 2 minuten elke keer. i) Bereid tijdens het wassen de DAB substraat-chromogene oplossing voor: voeg één druppel van elk reagens (reagentia I1, I2, I3) toe aan 1 ml dh 2 O. j) Voeg substraat-chromogene oplossing (DAB) toe: 2 3 druppels/glaasje of genoeg om het weefsel te bedekken en incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur (15 30 C) in een vochtigheidskamer. k) Plaats de glaasjes in de houder. l) Was met lopend kraanwater gedurende 2 minuten. 11. Tegenkleuring en bevestiging NB: korte tegenkleuring uitvoeren gedurende 3 5 seconden en onderzoek het weefsel onder een microscoop zonder het dekglaasje. Tegenkleuren gedurende een verdere 3 5 seconden wanneer een sterkere nucleaire kleuring is gewenst. De tegenkleuringstijd is afhankelijk van de gebruikte weefsels. Een donkere tegenkleuring wordt niet aangeraden, omdat dit de positieve kleuringssignalen kan beïnvloeden. a) Weefsel tegenkleuren met hematoxyline (reagens J): 3 5 seconden. b) Wassen met lopend kraanwater gedurende 2 minuten. c) dehydrateren in gegradeerde EtOH-serie gedurende 2 minuten in elk stadium. (70%, 85%, 95%, 100%, 100%, bewaard van dag 1 en gebruikt in dezelfde volgorde.) d) Onderdompelen in xyleen: 2 keer, 2 minuten elke keer. Deze xyleenwas moet anders zijn dan die gebruikt op dag 1. Het kan bij deze stap opnieuw gebruikt worden gedurende 1 week of tot 100 glaasjes. e) Dekglaasje met van Histomount -preparatiemiddel (reagens K). f) Bewaar de glaasjes op kamertemperatuur (15 30 C) voor een toekomstige analyse van de resultaten. Beperkingen van de procedure De SPOT-Light HER2 CISH-set kan mogelijk de gemelde 5% (10) van borstkankers niet detecteren die positief zijn via immmunohistochemie (IHC), maar negatief zijn voor HER2-genamplificatie. CISH is een procedure van meerdere stappen die een speciale training vereist in het gebruik van de juiste reagentia, weefselselectie, fixatie, verwerking, voorbereiding van het CISH-glaasje en interpretatie van de kleuringsresultaten. PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 9 van 25

De weefselkleuring is afhankelijk van de hantering en verwerking van het weefselmonster voorafgaand aan de kleuring. Overmatige of onvolledige tegenkleuring kan een juiste interpretatie van de resultaten negatief beïnvloeden. Elke afwijking van de aanbevolen testprocedure kan verklaarde, verwachte resultaten ongeldig maken; de juiste controles moeten worden gebruikt en vastgelegd. Gebruikers die afwijken van de aanbevolen testprocedure moeten de verantwoordelijkheid accepteren voor de interpretatie van monsterresultaten onder die omstandigheden. De SPOT-Light HER2 CISH-set is alleen geoptimaliseerd voor het identificeren en kwantificeren van het HER2/neu-gene in interfase nucleus voor in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde humane borstkankerweefselmosters. Andere typen monsters of fixatieven zijn niet gevalideerd. De klinische interpretatie van alle testresultaten moet worden geëvalueerd binnen de context van de medische geschiedenis van de patiënt en andere diagnostische resultaten van laboratoriumtests. PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 10 van 25

Kwaliteitsbeheersing Positieve en negatieve controles op één enkel glaasje Controleglaasje L. A B Afbeelding 1. Controleglaasje L bevat niet-geamplificeerde cellijn A (MCF-7) en geamplificeerde cellijn B (SK-OV- 3). NB: de cellijnen zijn niet op schaal getekend en zijn kleiner dan wordt aangegeven in de grafiek. Het CISH-signaal zou bruin, duidelijk en eenvoudig te evalueren moeten zijn. De bijgesloten controleglaasjes (glaasje L) bevatten twee 4 µm secties afgesneden van FFPE celblokken, bereid uit twee verschillende cellijnen. Deze glaasjes moeten worden gebruikt als controle op de procedure. Cellijn A (MCF-7) is niet-geamplificeerd en zal 5 signalen of punten per nucleus bevatten. Cellijn B (SK-OV-3) is geamplificeerd en zal verschijnen als kleine-tot-grote DAB-clusters in de nucleus. Het cellijncontroleglaasje moet tegelijkertijd worden uitgevoerd met elke uitvoering van de testglaasjes van de patiënt en moet op dezelfde manier worden behandeld als de weefselsecties. Indien het controleglaasje (glaasje L) negatief is voor zowel A- als B-cellijnen, is dit een indicatie dat er een fout is opgetreden tijdens de CISH-procedure. De positieve controlecellijn (B), waarvan bekend is dat het de HER2-amplificatie aantoont, moet als eerste worden onderzocht om vast te stellen dat alle reagentia goed werken. De aanwezigheid van genclusters of >5 individuele signalen of punten binnen de nucleus van één enkele cel is indicatief voor de verwachte positieve reactiviteit. Als de positieve controle de aanwezigheid van clusters of >5 signalen per nucleus in het merendeel (>50%) van de carcinoomcellen niet aangeeft, zullen de van de patiëntenmonsters verkregen resultaten als ongeldig moeten worden beschouwd. De negatieve of normale controlecellijn (A), waarvan bekend is dat deze de HER2-niet-amplificatie aantoont, zou 5 punten in de nucleus van elke cel moeten bevatten. Als er niet-specifieke kleuring in de nucleus van de normale controle (A) optreedt, zullen de van de patiëntenmonsters verkregen resultaten als ongeldig moeten worden beschouwd. Als er niet-specifieke kleuring optreedt, toont het meestal een diffuse kleuring. Soms kan er sporadisch een bruine kleuring buiten de nucleus worden waargenomen in weefselsecties die overmatig in formaline zijn gefixeerd. De resultaten moeten in deze gevallen voorzichtig worden geïnterpreteerd. Niet-specifieke kleuring moet niet worden verward met positieve CISH-signalen. Een positieve weefselcontrole bestaande uit borstkankerweefsel waarvan bekend is dat het HER2- amplificatie aantoont, indien gebruikt, moet de aanwezigheid van genclusters aantonen of >5 individuele signalen of punten per nucleus in een meerderheid (>50%) van de carcinoomcellen, indicatief voor een verwachte positieve reactiviteit. Als de positieve weefselcontrole geen aanwezigheid van clusters of >5 signalen per nucleus bij >50% van de tumorcellen vertoont, zullen de van de patiëntenmonsters verkregen resultaten als ongeldig moeten worden beschouwd. Een negatieve weefselcontrole bestaande uit een borstkankerweefsel waarvan bekend is dat het HER2-nietamplificatie aantoont, indien gebruikt, moet <5 signalen per nucleus bevatten in de meerderheid (>50%) van de carcinoomcellen. Over het algemeen bevestigt de aanwezigheid van niet meer dan twee signalen of punten in de nuclei van de normale weefseltegenhanger (normale epitheelcellen of stromacellen in de tumor) van de positieve weefselcontrole dat de sonde en de immunodetectiereagentia geen kruisreactie vertonen met cel- of weefselcomponenten. Als niet-specifieke kleuring optreedt in de nuclei van de normale weefseltegenhanger van positieve weefselcontrole, zullen de van de patiëntenmonsters verkregen resultaten als ongeldig moeten worden beschouwd. Variatie in weefselverwerking en technische procedures in het lab van de gebruiker moet worden gevalideerd, omdat het een aanzienlijke variabiliteit kan geven in de resultaten, waardoor het noodzakelijk kan zijn om regelmatige interne controles uit te voeren in aanvulling op de volgende procedures. Interpretatie Nauwkeurigheid van de glaasjes beoordelen De HER2 CISH-punten (signalen) moeten klein, maar duidelijk waarneembaar zijn met een 20X 40X-objectief. De punten zullen bruin worden weergegeven tegen de tegenkleuring. Als er geen duidelijke punten op het monster verschijnen, moet de test worden herhaald. Neem contact op met de technische dienst van Invitrogen op 1-800-955-6288 (Alleen in de VS) om de mogelijke oorzaken van het probleem te bespreken. PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 11 van 25

CISH-signaaluiterlijk zie bijlage A, Leidraad voor HER2 CISH-testinterpretatie HER2 CISH-punten zullen als volgt verschijnen: Een enkele punt (afbeelding G). Een enkele punt met een gladde, afgeronde rand in normale of carcinoomcellen. Een enkele punt weergegeven als een enkele HER2-genkopie. Een doublet (afbeelding H). De punten verschijnen als paren en geven geen echt klein cluster weer. Als twee signalen worden gescheiden door minder dan de diameter van één signaal, moeten deze signalen worden gezien als één enkele punt. Het doublet is het resultaat van delende chromosomen, waarbij elk signaal op het paar zusterchromatiden zit 29 Een klein cluster (afbeelding E). Een klein cluster is een onregelmatig gevormde groep signalen die 3 5 keer de diameter vormt van een enkele punt. Een enkele punt van de carcinoom- of normale epitheelcellen van hetzelfde glaasje kan als referentie worden gebruikt. Een groot cluster (afbeelding A). Een groot cluster is een onregelmatig gevormde groep signalen die meer dan 5 keer de diameter hebben van een enkele punt. Een enkele punt van de carcinoom- of normale epitheelcellen van hetzelfde glaasje kan als referentie worden gebruikt. Vergroting van CISH-signaal 10X Enkele punten zijn nauwelijks zichtbaar en kunnen makkelijk over het hoofd gezien worden. 20X Enkele punten zijn klein, maar duidelijk herkenbaar. 40X Enkele punten kunnen duidelijk geïdentificeerd worden. 60X of 100X Niet noodzakelijk. Selecteren van de doelvelden voor HER2 CISH-signaaltelling: Scan met behulp van 4X 20X-objectieven het CISH-gekleurde monster om de histopathologisch meest representatieve gebieden van het invasieve carcinoom te identificeren. Vermijd necrosegebieden, overlappende signalen als gevolg van overlappende nuclei en nuclei met een zwakke signaalintensiteit. Vermijd componenten van intraductaal carcinoom (DCIS) in invasieve carcinomen. Evalueer de mogelijke intratumorale heterogeniteit van de HER2-genstatus voor de CISH-telling. Als het monster homogeen is, moet u een weefselgebied selecteren met sterke CISH-signalen voor signaaltelling. Ga verder met de signaaltelling. Als het monster intratumorale heterogeniteit van de HER2-genstatus in het invasieve carcinoomcomponent heeft, moet u gebieden selecteren die elke HER2-genstatus weergeven voor signaaltelling. Een weefselmonster is heterogeen als de HER2-genstatus (geamplificeerde en niet-geamplificeerde cellen) in diverse gebieden van dezelfde sectie van een primaire borstkanker verschilt. Cellen in elk heterogeen gebied moeten worden geëvalueerd om te bepalen welke HER2-status (geamplificeerd of nietgeamplificeerd) overheerst in meer dan 50% van de tumorsectie. Ga verder met signaaltelling in het gebied waar de HER2-status overheerst in deze tumor. Signaaltelling Gebruik een 40X-objectief. Een hoger objectief kan zo nodig worden gebruikt, maar immersie in olie is niet nodig. Zie bijlage A, Leidraad voor HER2 CISH-testinterpretatie. Een individueel HER2-gen verschijnt als een kleine ronde enkele punt (afbeelding G). Tel geen nuclei die elkaar overlappen of de gebieden waarin de nucleus niet zichtbaar is. Tel alleen het CISH-signaal in een nucleus. Sluit incidentele sporadische signalen uit die kunnen voortkomen uit restanten van gemorst HER2-DNA van de turnover van kankercellen, buiten de nuclei. Niet-amplificatie o Gedefinieerd als 1 5 enkele punten in de meerderheid (>50%) van de carcinoomcellen in het geselecteerde weefselgebied. o Het is niet nodig om de punten in 30 cellen te tellen. Optioneel: gebruik het werkblad in bijlage B, HER2 CISH-scoreblad voor de celtelling. Vermeld de resultaten als het gemiddelde van de totale telling van 30 cellen om een duidelijke diagnose van niet-amplificatie te verkrijgen. Amplificatie o Gedefinieerd als: o >5 punten in de meerderheid (>50%) van de carcinoomcellen in het geselecteerde weefselgebied, of o Grote clusters in de meerderheid (>50%) van de carcinoomcellen in het geselecteerde weefselgebied, of o Een mengeling van meerdere punten en grote clusters in de meerderheid (>50%) van de carcinoomcellen in het geselecteerde weefselgebied, of PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 12 van 25

o o Een mengeling van meerdere punten en kleine clusters in de meerderheid (>50%) van de carcinoomcellen in het geselecteerde weefselgebied, of o Kleine clusters in de meerderheid (>50%) van de carcinoomcellen in het geselecteerde weefselgebied. Voor elk van de bovenstaande gevallen is het niet noodzakelijk om de punten te tellen in 30 cellen. Optioneel: gebruik het werkblad in bijlage B, HER2 CISH-scoreblad voor de celtelling. Vermeld de resultaten als het gemiddelde van de totale telling van 30 cellen om een duidelijke diagnose van amplificatie te verkrijgen. Tel voor de tellingsdoeleinden een klein cluster als 5 punten en een groot cluster als 10 punten. o Rationale: de toewijzing van specifieke puntnummers aan kleine of grote clusters is arbitrair voor kwantificatiedoeleinden. Cellen hebben normaliter twee HER2-genkopieën. Cellen die hun DNA hebben gerepliceerd, maar nog niet zijn gedeeld, hebben 4 genkopieën. Daarom is een klein cluster een indicatie van amplificatie en zal het een minimumaantal van 5 genkopieën hebben. Een groot cluster, ten minste dubbel zo groot als een klein cluster, zal een minimumaantal van 10 genkopieën hebben. Onduidelijke gevallen van amplificatie en niet-amplificatie Interpreteer de monsters die niet duidelijk bij de amplificatie- of niet-amplificatiecategorieën behoren met enige voorzichtigheid. Deze monsters vertonen 4 6 punten in de meerderheid (>50%) van de carcinoomcellen in het geselecteerde doelveld. Als het gemiddelde aantal punten tussen de 4 en 6 ligt nadat 30 carcinoomcellen zijn geteld, moeten er 30 extra cellen worden geteld voor een totaal van 60 cellen. Als er nog altijd twijfels bestaan, moet de test worden herhaald met een nieuw monsterglaasje. Vermeld de resultaten met behulp van het werkblad in bijlage B, HER2 CISH-scoreblad. 1. Tel de punten in 30 tumorcellen in het geselecteerde weefselgebied. Zie nr. 4 hieronder als de kleine clusters duidelijk zijn. 2. Tel het aantal punten in de 30 cellen op en bereken het gemiddelde. 3. Vermeld het resultaat op basis van de gemiddelde 60 cellen. 4. Als een mengeling van enkele punten en kleine clusters (door het groeperen van diverse enkele punten) wordt waargenomen of als er alleen kleine clusters worden waargenomen: Tel één klein cluster als 5 punten. Een enkele punt van de carcinoom- of normale epitheelcellen van hetzelfde glaasje kunnen worden gebruikt als referentie bij het bepalen wat een klein cluster is. 5. Vermeld de resultaten als het gemiddelde van de totale telling van 60 cellen om een diagnose van amplificatie of niet-amplificatie te verkrijgen volgens de leidraad van Invitrogen. Rapporteren van resultaten De resultaten kunnen worden gerapporteerd op het werkblad in bijlage B, HER2 CISH-scoreblad. Het HER2-statusrapport moet worden vastgelegd volgens de leidraad van Invitrogen, met name bij onduidelijke gevallen van amplificatie of niet-amplificatie. Samenvatting van interpretatie Amplificatie >5 punten of grote clusters, mengeling van meerdere punten en grote clusters, mengeling van meerdere punten en kleine clusters of kleine clusters van het HER2-gen aanwezig per nucleus in een meerderheid (>50%) van de carcinoomcellen in het weefselgebied dat is geselecteerd voor telling. Zie afbeeldingen A, B, C, D en E in bijlage A, Leidraad voor HER2 CISH-testinterpretatie. Een groot cluster is een onregelmatig gevormde groep signalen die meer dan 5 keer de diameter heeft van een enkele punt. Een enkele punt van de carcinoom- of normale epitheelcellen van hetzelfde glaasje kan als referentie worden gebruikt. Zie bijlage A, afbeelding A. Een klein cluster is een onregelmatig gevormde groep signalen die 3 5 keer de diameter heeft van een enkele punt. Een enkele punt van de carcinoom- of normale epitheelcellen van hetzelfde glaasje kan als referentie worden gebruikt. Zie bijlage A, afbeelding E. Nietamplificatie 1 5 punten van het HER2-gen aanwezig per nucleus in een meerderheid (>50%) van de carcinoomcellen in het weefselgebied dat is geselecteerd voor de telling. Zie bijlage A, afbeelding F, afbeelding G en afbeelding H. Een enkele punt heeft een gladde, afgeronde rand en is aanwezig in normale en carcinoomcellen. PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 13 van 25

Verwachte waarden De prevalentie van het geamplificeerde HER2-gen bij de algemene populatie van vrouwen met borstkanker bedraagt 18 30%. (8, 9) Bij vergelijking van de HER2-genamplificatie met de HER2-eiwitoverexpressie hebben onderzoeken aangetoond dat tot 5% van de patiënten met borstkanker positief is voor eiwitoverexpressie na immunohistochemietests (IHC), maar negatief voor HER2-genamplificatie. (10) Specifieke prestatie-eigenschappen Klinische prestatie De veiligheid en werkzaamheid van de SPOT-Light HER2 CISH-set zijn beoordeeld in een vergelijkend onderzoek met drie tests: de SPOT-Light HER2 CISH-set, PathVysion FISH en HercepTest. Het onderzoek betrof twee soorten casussen: 226 consecutieve casussen en 60 aanvullende casussen. De consecutieve casussen werden geselecteerd uit consecutieve borstkankercasussen die waren onderzocht voor de behandeling van patiënten in twee onderzoekscentra (centra A en B). De aanvullende casussen waren casussen met een score van 2+ in de immunohistochemietest (IHC) (gebruikmakende van antilichaam AB8) tijdens de behandeling van de patiënt in centrum A. A. Consecutieve casussen De volgende tabel somt de verdeling op van de CISH- en FISH-resultaten met betrekking tot de HercepTest scores. Een test werd als geldig beschouwd wanneer het resulterende gekleurde glaasje acceptabel was voor beoordeling. Tabel 1: Resultaten van IHC, FISH en CISH Eiwitexpressie, HercepTest -score 0 1 2 3 Totaal IHC-casussen (N) 141 19 21 40 221 (%) 1 63,8% 8,6% 9,5% 18,1% 100% Genratio met FISH HER2-status Aantal geldige FISH-casussen 2 140 19 21 38 218 Geamplificeerd n (%) 3 1 (0,5) 0 (0,0) 5 (2,3) 31 (14,2) 37 Niet-geamplificeerd n (%) 3 139 (63,8) 19 (8,7) 16 (7,3) 7 (3,2) 181 Genkopieën met CISH HER2-status Aantal geldige CISH-casussen 2 132 17 19 38 206 Geamplificeerd n (%) 3 1 (0,5) 0 (0,0) 3 (1,5) 32 (15,5) 36 Niet-geamplificeerd n (%) 3 131 (63,6) 17 (8,3) 16 (7,8) 6 (2,9) 170 1 % = N Totaal N 100% 2 Aantal geldige FISH-casussen (of CISH-casussen) met de bijbehorende IHC-score. 3 % = n Totaal aantal geldige FISH-casussen (of CISH-casussen) 100% CISH-resultaten Tabel 2: Overeenkomst tussen CISH en IHC IHC-resultaten Positief (3+) Negatief (<3+) Totaal Geamplificeerd 32 4 36 Niet-geamplificeerd 6 164 170 Totaal 38 168 206 20 casussen werden gemeld met ontbrekende of ongeldige IHC- of CISH-testresultaten en deze werden niet opgenomen in de tabel. Positieve overeenkomst = 32/38 = 84,2% (95% CI: 68,8%, 94,0%) Negatieve overeenkomst = 164/168 = 97,6% (95% CI: 94,0%, 99,4%) Totaal percentage van overeenkomst = (32+164)/206 = 95,1% (95% CI: 91,3%, 97,7%) De resultaten toonden een concordantie van 95,1% (95% BI: 91,3% 97,7%), wat een sterke overeenkomst aangeeft tussen de SPOT-Light HER2 CISH-set en HerceptTest. PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 14 van 25

CISH-resultaten Tabel 3: Overeenkomst tussen CISH en FISH FISH-resultaten Geamplificeerd Niet-geamplificeerd Totaal Geamplificeerd 34 0 34 Niet-geamplificeerd 2 169 171 Totaal 36 169 205 21 casussen werden gemeld met ontbrekende of ongeldige FISH- of CISH-testresultaten en deze werden niet opgenomen in de tabel. Positieve overeenkomst = 34/36 = 94,4% (95% CI: 81,3%, 99,3%) Negatieve overeenkomst = 169/169 = 100,0% (95% CI: 97,8%, 100,0%) Totaal percentage van overeenkomst = (34+169)/205 = 99,0% (95% CI: 96,5%, 99,9%) De resultaten toonden een concordantie van 99,0% (95% BI: 96,5% 99,9%), wat een sterke overeenkomst aangeeft tussen de test met de SPOT-Light HER2 CISH-set en de PathVysion HER2. Daarmee geeft het overeenkomstpercentage aan dat de test met de SPOT-Light HER2 CISH-set resultaten gaf die equivalent waren aan die van de PathVysion HER2-test. Een samenvatting van de 2 discordante casussen tussen de SPOT-Light HER2-sondetest en de PathVysion HER2- sondetest wordt hieronder weergegeven. CISH- en FISH-gegevens worden weergegeven als gemiddelde en bereik en de IHC-kolom toont de HercepTest -score. HER2 CISH (Pos)/FISH (Neg) Tabel 4: Discordante casussen tussen FISH en CISH Casusnummer CISH FISH IHC Casusnum mer (2, 0,98%) 1 HER2 CISH (Neg)/FISH (Pos) CISH FISH IHC A-095-01 4,07 (1,00 10,00) 2,81 (1,67 5,00) 2+ B-008 2,77 (2,00 4,00) 2,65 (1,00 6,00) 2+ 1 % = aantal discordante casussen gedeeld door het totale aantal casussen met geldige FISH en CISH van het bijbehorende centrum 100% B. Aanvullende IHC 2+-casussen 60 aanvullende IHC 2+-casussen werden aangeleverd door onderzoekscentrum A en getest in onderzoekscentra A en B. De resultaten in elk onderzoekcentra tonen aan dat de test met de SPOT-Light HER2 CISH-set resultaten gaf die equivalent waren aan de PathVysion HER2-test. De correlatieresultaten worden opgesomd in tabel 5 en 6. Tabel 5: Overeenkomst tussen CISH en FISH in onderzoekscentrum A bij IHC 2+-casussen CISH-resultaten FISH-resultaten Geamplificeerd Niet-geamplificeerd Totaal Geamplificeerd 6 0 6 Niet-geamplificeerd 2 46 48 Totaal 8 46 54 6 casussen werden gemeld met ontbrekende of ongeldige Positieve overeenkomst = 6/8 = 75,0% (95% CI: 34,9%, 96,8%) Negatieve overeenkomst = 46/46 = 100,0% (95% CI: 92,3%, 100,0%) Totaal percentage van overeenkomst = (6+46)/54 = 96,3% (95% CI: 87,3%, 99,6%) PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 15 van 25

Casusnu mmer Tabel 6: Overeenkomst tussen CISH en FISH in onderzoekscentrum B bij IHC 2+-casussen CISH-resultaten FISH-resultaten Geamplificeerd Niet-geamplificeerd Totaal Geamplificeerd 7 2 9 Niet-geamplificeerd 2 45 47 Totaal 9 47 56 4 casussen werden gemeld met ontbrekende of ongeldige Positieve overeenkomst = 7/9 = 77,8% (95% CI: 40,0%, 97,2%) Negatieve overeenkomst = 45/47 = 95,7% (95% CI: 85,5%, 99,5%) Totaal percentage van overeenkomst = (7+45)/56 = 92,9% (95% CI: 82,7%, 98,0%) Tabel 7: Discordante IHC 2+-casussen tussen CISH en FISH HER2 CISH (Pos)/FISH (Neg) CISH FISH IHC Casusnum mer Centrum A (2, 3,70%) 1 HER2 CISH (Neg)/FISH (Pos) CISH FISH IHC S-156-01 2,77 (1,00 5,00) 2,48 (0,50 5,00) 2+ S-173-01 3,67 (1,00 7,00) 2,34 (0,50 8,00) 2+ Centrum B (4, 7,14%) 1 S-171 5,20 (2,00 8,00) 1,08 (0,50 2,00) 3+ S-156 5,00 (1,00 9,00) 2,23 (1,00 5,00) 3+ 1 S-178 20,00 (20,00 20,00) 1,25 (0,50 2,00) 0 S-183 4,13 (3,00 6,00) 2,73 (1,00 6,00) 0 % = aantal discordante casussen gedeeld door het totale aantal casussen met geldige FISH en CISH van het bijbehorende centrum 100% C. HercepTest 2+-casussen Alle consecutieve en aanvullende casussen werden getest met HercepTest. Casussen met HercepTest 2+-scores werden gecombineerd en getest in beide onderzoekscentra. De resultaten in elk onderzoekcentra tonen aan dat de test met de SPOT-Light HER2 CISH-set resultaten gaf die equivalent waren aan de PathVysion HER2-test. De correlatieresultaten worden opgesomd in tabel 8 en 9. Tabel 8: Overeenkomst tussen CISH en FISH bij HercepTest 2+-casussen in onderzoekscentrum A CISH-resultaten FISH-resultaten Geamplificeerd Niet-geamplificeerd Totaal Geamplificeerd 3 0 3 Niet-geamplificeerd 4 27 31 Totaal 7 27 34 2 casussen werden gemeld met ontbrekende of ongeldige FISH- of CISH-testresultaten en deze werden niet opgenomen in de tabel. Positieve overeenkomst = 3/7 = 42,9% (95% CI: 9,9%, 81,6%) Negatieve overeenkomst = 27/27 = 100,0% (95% CI: 87,2%, 100,0%) Totaal percentage van overeenkomst = (3+27)/34 = 88,2% (95% CI: 72,6%, 96,7%) Tabel 9: Overeenkomst tussen CISH en FISH bij HercepTest 2+-casussen in onderzoekscentrum B CISH-resultaten FISH-resultaten Geamplificeerd Niet-geamplificeerd Totaal Geamplificeerd 4 1 5 Niet-geamplificeerd 1 35 36 Totaal 5 36 41 2 casussen werden gemeld met ontbrekende of ongeldige FISH- of CISH-testresultaten en deze werden niet opgenomen in de tabel. Positieve overeenkomst = 4/5 = 80,0% (95% CI: 28,4%, 99,5%) Negatieve overeenkomst = 35/36 = 97,2% (95% CI: 85,5%, 99,9%) Totaal percentage van overeenkomst = (4+35)/41 = 95,1% (95% CI: 83,5%, 99,4%) PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 16 van 25

Casusnu mmer Tabel 10: Discordante HercepTest 2+-casussen tussen CISH en FISH HER2 CISH (Pos)/FISH (Neg) CISH FISH IHC Casusnumme r Centrum A (4, 11,76%) 1 HER2 CISH (Neg)/FISH (Pos) CISH FISH IHC A-095-01 4,07 (1,00 10,00) 2,81 (1,67 5,00) 2+ B-008-08 1,77 (1,00 4,00) 2,45 (1,00 5,00) 2+ S-156-01 2,77 (1,00 5,00) 2,48 (0,50 5,00) 2+ S-173-01 3,67 (1,00 7,00) 2,34 (0,50 8,00) 2+ Centrum B (2, 4,88%) 1 A-023 5,20 (2,00 8,00) 1,49 (0,67 3,50) 2+ B-008 2,77 (2,00 4,00) 2,65 (1,00 6,00) 2+ 1 % = aantal discordante casussen gedeeld door het totale aantal casussen met geldige FISH en CISH van het bijbehorende centrum 100% D. Polysomiecasussen Twee onderzoekscentra evalueerden de polysomiecasussen op basis van hun respectievelijke institutionele klinische gebruiken en gewoontes. In centrum A werd polysomie van chromosoom 17 gedefinieerd als de aanwezigheid van 3 CEP17-signalen bij ten minste 10% van de tumorcellen, terwijl in centrum B de criteria bestonden uit de aanwezigheid van 3 CEP17-signalen bij ten minste 30% van de tumorcellen. De frequentie van de tumoren met polysomie van chromosoom 17 bedroeg 18,68% bij centrum A en 7,91% bij centrum B. Het detectiepercentage van polysomie bij dezelfde tumorset varieerde aanzienlijk tussen de twee onderzoekscentra als gevolg van het verschil in definitie van polysomie die in elk centrum werd gebruikt. Het overeenkomstniveau dat onafhankelijk van elk onderzoekscentrum werd verkregen, gaf aan dat de test met de SPOT-Light HER2 CISH-set resultaten gaf die equivalent waren aan de PathVysion HER2-test. De resultaten worden samengevat in tabel 11 en 12. Tabel 11: Overeenkomst van CISH en FISH bij polysomiecasussen in onderzoekscentrum A CISH-resultaten FISH-resultaten Geamplificeerd Niet-geamplificeerd Totaal Geamplificeerd 12 0 12 Niet-geamplificeerd 2 34 36 Totaal 14 34 48 3 casussen werden gemeld met ontbrekende of ongeldige FISH- of CISH-testresultaten en deze werden niet opgenomen in de tabel. Positieve overeenkomst = 12/14 = 85,7% (95% CI: 57,2%, 98,2%) Negatieve overeenkomst = 34/34 = 100,0% (95% CI: 89,7%, 100,0%) Totaal percentage van overeenkomst = (12+34)/48 = 95,8% (95% CI: 85,8%, 99,5%) Tabel 12: Overeenkomst van CISH en FISH bij polysomiecasussen in onderzoekscentrum B CISH-resultaten FISH-resultaten Geamplificeerd Niet-geamplificeerd Totaal Geamplificeerd 12 1 13 Niet-geamplificeerd 0 9 9 Totaal 12 10 22 0 casussen werden gemeld met ontbrekende of ongeldige FISH- of CISH-testresultaten en deze werden niet opgenomen in de tabel. Positieve overeenkomst = 12/12 = 100,0% (95% CI: 73,5%, 100,0%) Negatieve overeenkomst = 9/10 = 90,0% (95% CI: 55,5%, 99,8%) Totaal percentage van overeenkomst = (12+9)/22 = 95,5% (95% CI: 77,2%, 99,9%) PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 17 van 25

Casus numm er Tabel 13: Discordante polysomiecasussen tussen CISH en FISH HER2 CISH (Pos)/FISH (Neg) CISH FISH IHC Casusnum mer Centrum A (2, 4,17%) 1 HER2 CISH (Neg)/FISH (Pos) CISH FISH IHC A-095-01 4,07 (1,00 10,00) 2,81 (1,67 5,00) 2+ S-156-01 2,77 (1,00 5,00) 2,48 (0,50 5,00) 2+ Centrum B (1, 4,55%) 1 A-023 5,20 (2,00 8,00) 1,49 (0,67 3,50) 2+ 1 % = aantal discordante casussen gedeeld door het totale aantal casussen met geldige FISH en CISH van het bijbehorende centrum 100% E. Samenvatting van vergelijkende resultaten tussen de SPOT-Light HER2 CISH-set en de PathVysion HER2-DNA-sondeset Tabel 14: Samenvatting van SPOT-Light HER2 CISH-set en PathVysion HER2-DNA-sondeset Casustype Consecutieve casussen Aanvullende casussen Equivoque casussen Polysomiecasussen Centrum B Centrum A Centrum B Centrum A Centrum B Centrum B Aantal monsters Positief % overeenkomst Negatief % overeenkomst Totaal % overeenkomst 205 54 56 34 41 48 22 94,4% 75,0% 77,8% 42,9% 80,0% 85,7% 100,0% 100,0% 100,0% 95,7% 100,0% 97,2% 100,0% 90,0% 99,0% 96,3% 92,9% 88,2% 95,1% 95,8% 95,5% Analytische gevoeligheid De gevoeligheid van de SPOT-Light HER2 CISH-set werd getest met FFPE borstkankerweefselsecties met nietgeamplificeerde en geamplificeerde HER2-status, evenals de FFPE cellijnen gebruikt in de controleglaasjes. Het HER2-gen werd waargenomen als een enkele punt op de weefselsectie en celbloksectie met het normale HER2-gen. Elk geamplificeerd en niet-geamplificeerd monster toonde een 3+-intensiteit in kleuring en een goede weefselmorfologie aan. Hybridisatie-efficiëntie De hybridisatie-efficiëntie werd verkregen door 2 weefselmonsters te testen (1 geamplificeerd, 1 nietgeamplificeerd, 10 secties van elk) en 4 cellijnmonsters (2 geamplificeerd, 2 niet-geamplificeerd). Elk monster werd geanalyseerd voor het aantal cellen met HER2-signalen van het totale aantal geanalyseerde cellen (100 300 cellen). De hybridisatie-efficiëntie werd vastgelegd als 94,7 100%. Voor CISH-kleuring bij 226 klinische monsters van 3 laboratoria bedroeg het mislukkingspercentage in elk centrum 8,4% (19), 1,3% (3) en 0,9% (2). (28) Analytische specificiteit Om de specificiteit te bepalen, zijn er metafase onderzoeken uitgevoerd bij cytogenetisch bereide glaasjes. Er werd PCR uitgevoerd met een HER2-genspecifiek primerpaar op het HER2-DNA-sondesjabloon en er werd DNAsequencing uitgevoerd voor beide uiteinden van de BAC-klonen gebruikt in de HER2-DNA-sonde. Van de SPOT-Light CISH HER2-sonde werd aangetoond dat deze zich specifiek bond aan de HER2-genlocus op chromosoomband 17q11.2-21. Chromosoomlokalisatie werd verkregen door metafase FISH bij normale lymfocyten; PCR-tests toonden de gewenste DNA-band aan en de DNA-sequencing toonde de juiste chromosoomlocatie en dekking aan van het HER2-gen. Procedurele limieten De SPOT-Light HER2 CISH-procedure werd getest op de extremen van elk van de volgende parameters: weefseldikte, voorbehandeling, denaturatie, hybridisatie, stringente wasbeurt, immunodetectie en tegenkleuring. Er werden geen significante verschillen waargenomen in de CISH-resultaten onder de volgende omstandigheden: PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 18 van 25

Tabel 15: Procedurele limieten Testparameter acceptabele bereiken Weefseldikte 4 6 µm Warmtevoorbehandeling 99 100 C 10 20 minuten Enzymdigestie 4-14 minuten Denaturatie PCR thermal cycler 93 98 C 2 8 minuten Hybridisatie 30 39 C 10 18 uur Stringente wasbeurt 60 78 C 2 8 minuten Immunodetectie HRP-polymeerconjugaat 25v60 minuten DAB-chromogen 15 60 minuten Tegenkleuring 3 30 seconden Reproduceerbaarheid Drie aparte partijen van de SPOT-Light HER2 CISH-set werden getest op 3 monsters van borstkankerweefsel en 4 cellijnmonsters met andere niveaus van HER2-gen. Er werd geen verandering in prestatie gezien voor de 3 geteste partijen. Inter-run (dagelijkse) reproduceerbaarheid Het onderzoek voerde een CISH inter-run reproduceerbaarheid uit op drie verschillende dagen met borstkankermonsters met drie typen HER2-statussen met 3 monsters van elk type. De samenvatting is als volgt: Tabel 16: Inter-run (dagelijkse) reproduceerbaarheid Genkopie N Niet-geamplificeerd Niet-geamplificeerd, Geamplificeerd polysomie Gemiddelde N = 9 1,79 3,45 20,22 Standaardafwijking 9 0,05 0,12 1,72 CV 9 3% 4% 8% Waarneming door meerdere onderzoekers Drie pathologen werden getraind in het interpreteren van glaasjes die waren bereid en gekleurd met de SPOT-Light HER2 CISH-set. Om de bekwaamheid te valideren, kreeg elke patholoog acht voorgekleurde glaasjes (6 nietgeamplificeerd en 2 geamplificeerd) die werden verstrekt door Invitrogen. Bij beide casustypen (niet-geamplificeerd en geamplificeerd) werden alle monsters (100%) nauwkeurig geïnterpreteerd. PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 19 van 25

Glaasje ID 1 Monster 1 () Tabel 17: Reproduceerbaarheid van waarneming door meerdere onderzoekers CISH-signaal, gemiddelde HER2 CISH-punten/cel en HER2- genstatus Glaasjesnr. Onderzoeker 1 Onderzoeker 2 Onderzoeker 3 2 punten 1-5 punten 1-2 2 Monster 2 (AM) Groot cluster + meerdere punten AM Groot cluster + punten AM >10 AM 3 Monster 3 () 2-5 1-5 3-5 4 Monster 4 () 2-4 2,8 3-5 5 Monster 5 () 2 1-5 1-2 6 Monster 6 () 2-5 1-5 4 7 Monster 7 (AM) Groot cluster + meerdere punten AM Groot cluster AM Groot cluster + meerdere punten AM 8 Monster 8 () 2-5 3,4 4,3 Reproduceerbaarheid van waarneming op meerdere locaties Het CISH-reproduceerbaarheidsonderzoek voor meerdere locaties was gebaseerd op 226 consecutieve casussen die werden herhaald in drie onderzoekscentra. Totale overeenkomstpercentages voor CISH-reproduceerbaarheid met >5 als de grens voor positiviteit, bedroegen 99,0%, 98,6% en 98,1%, wat een sterke reproduceerbaarheid aangeeft voor het testen met de SPOT-Light HER2 CISH-set. Tabel 18: CISH-reproduceerbaarheid voor alle consecutieve casussen Onderzocht door centrum A en B Centrum A Centrum B: CISH-resultaten CISH-resultaten Geamplificeerd Niet-geamplificeerd Totaal Geamplificeerd 34 0 34 Niet-geamplificeerd 2 170 172 Totaal 36 170 206 20 casussen werden gemeld met ontbrekende of ongeldige CISH-testresultaten en deze werden niet opgenomen in de tabel. Totaal percentage van overeenkomst = (34+170)/206 99,0% (95% CI: 96,5%, 99,9%) PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 20 van 25