Appendix A Nederlandse samenvatting 97
Samenvatting Hydrogels worden breed ingezet voor uiteenlopende toepassingen, in het bijzonder voor drug delivery (geneesmiddelafgifte), biosensing (biologische detectie en waarneming) en tissue engineering (weefseltechnologie), vanwege hun uitstekende biocompatibiliteit en opslagcapaciteit voor kwetsbare bioactieve moleculen. Het hoge watergehalte en driedimensionale polymerennetwerk van de hydrogelen vertoont gelijkenis met natuurlijk weefsel, kan meer moleculen huisvesten en verlaagt de impact van biologische factoren uit de omgeving. Recentelijk staan hydrogelen die in situ onder fysiologische condities gevormd worden, in de belangstelling als potentiële transportvehikels voor geneesmiddelen. Deze interesse vloeit voort uit het feit dat in situ hydrogelvorming het maken van complexe vormen mogelijk maakt en toepasbaar is met een minimale operatieve ingreep. Bovendien kunnen bioactieve macromoleculen, zoals peptiden of eiwitten, verpakt worden in de hydrogel door ze eenvoudigweg te mengen met de polymeeroplossingen voordat gelvorming plaatsvindt. In dit proefschrift wordt de bereiding en karakterisatie van in situ vormende hydrogelen - gebaseerd op biocompatibele polymeren- beschreven, die als toepassing het gecontroleerd afgeven van eiwitten en hydrofobe geneesmiddelen hebben. Om hydrofobe geneesmiddelen te kunnen opnemen in een hydrofiele hydrogelmatrix werden respectievelijk β-cyclodextrine en humaan serum albumine (HSA) geincorporeerd in het hydrogel netwerk. Deze verbindingen dienen als primaire bindingsplaatsen voor de hydrofobe moleculen. De β-cyclodextrine of HSA bevattende hydrogelen kunnen eenvoudig gevormd worden door het mengen van polymeeroplossingen die deze componenten bevatten, waarna via Michael additie reactie het netwerk ontstaat. Bovendien werden supramoleculair en covalent gecrosslinkte licht-gevoelige hydrogelen gesynthetiseerd, waarvan de potentiële toepassing als licht-gecontroleerd eiwit afgifte systeem wordt gedemonstreerd. Hoofdstuk 1 geeft een algemene inleiding over hydrogelen en hun toepassingen. De nadruk ligt op in situ vormende hydrogelen en hun toepassing in drug delivery systemen. Daarnaast worden doel en overzicht van dit proefschrift gepresenteerd. 98
Hoofdstuk 2 behandelt de synthese van een snel in situ vormend hydrogel systeem bestaande uit thiol gefunctionalizeerd β-cyclodextrine en maleimide gefunctionalizeerd dextraan. De gel werd gekarakteriseerd met behulp van reologie metingen en scanningelectronen-microscopie (SEM), en het in vitro afgifte profiel van het hydrofobe geneesmiddel all-transretinoїne zuur werd bestudeerd. Hoofdstuk 3 beschrijft de ontwikkeling van op hydrogel gebaseerde geneesmiddeltransportsystemen met gebruik van de biocompatibele materialen cyclodextrine, dextraan en poly(ethyleneglycol), en hun toepassing in zebravis embryo s. Maleimide gemodificeerde dextranen (Dex-mal) werden gefunctionalizeerd met cyclodextrine. Door het crosslinken (vernetten) uit te voeren ofwel met per-6-thio-βcyclodextrine (PSCD) ofwel met een combinatie van mono-6-thio-β-cyclodextrin (MSCD) en di-gethioleerd poly(ethylene glycol) (DSPEG) werden hydrogelen gevormd. Een constant, ononderbroken afgifte profiel van all-transretinoїne zuur (RA, all-trans retinoic acid) -als model (hydrofoob) geneesmiddel-vanuit deze cyclodextrine gemodificeerde hydrogelen kon in vitro worden waargenomen, zonder het optreden van kortdurende verhoogde afgifte in de initiële fase. Dit gestage afgifteprofiel is een gevolg van het feit dat cyclodextrine fungeert als bindingsplaats voor RA. Bovendien werden de hydrogel nanodeeltjes geïnjecteerd in vroege zebravisembryo s om in vivo afgifte van RA en biocompatibiliteit van de gel te onderzoeken. Vastgesteld werd dat de gelnanodeeltjes bestaande uit Dex-mal, MSCD and DSPEG, geschikt zijn voor toepassing in zebravisembryo s. Gedemonstreerd werd dat RA afgifte in de embryo s op een gecontroleerde manier plaatsvindt. In Hoofdstuk 4 wordt de synthese van een in situ vormend, covalent gecrosslinkt hydrogel systeem -samengesteld uit humaan serum albumine (HSA) en maleimide gefunctionalizeerd dextraan- beschreven, zonder enige chemische modificatie van het eiwit. De verkregen hydrogel werd gekarakteriseerd met behulp van reologie metingen en scanning electronen microscopie, en getest als geneesmiddelen transportmiddel met diclofenac, ibuprofen en ketoprofen als modelgeneesmiddelen. Hoofdstuk 5 richt zich op het gebruik van een trans azobenzene en cyclodextrine inclusie complex als photo-switchable (licht-geschakelde) crosslinker (vernettingsmiddel) om een op dextraan gebaseerd, photo-responsive (op licht reagerend), supramoleculair 99
hydrogel systeem te construeren, dat potentiële toepassing heeft als een door licht gecontroleerd eiwit afgifte systeem. Hoofdstuk 6 behandelt een fotodegradeerbaar, covalent gecrosslinkt hydrogel systeem geconstrueerd uit de biocompatibele polymeren dextraan and poly(ethylene glycol) waarbij acrylaat-thiol Michael additie chemie als crosslinkende methode gebruikt werd. Lichtgevoeligheid van dit systeem werd geïntroduceerd door een niet-toxische fotolabiele o-nitrobenzyl functionele groep te incorporeren. Hydrogelen werden gesynthetiseerd onder fysiologische condities, zonder dat additionele reagentia nodig waren, door oplossingen van o-nitrobenzyl-gemodificeerde dextraanacrylaten en di-gethioleerde poly(ethylene glycol) te mengen. De afbraak van de hydrogelen onder invloed van UV straling werd bestudeerd met behulp van scanning electronen microscopie, infrarood en UV-vis spectroscopie. Met behulp van green fluorescent protein (GFP) als modeleiwit, werd licht-geïnduceerde eiwit-afgifte door de verkregen macro- en microscopische gel matrices onderzocht. Hieraan werd bovendien een studie van de fotodegradeerbaarheid van de hydrogel via twee foton excitatie toegevoegd, waarbij gebruik werd gemaakt van focused pulsed near infrared (NIR) laser beam als lichtbron. Perspectieven Op hydrogel gebaseerde drug delivery systemen zijn interessant door hun aantrekkelijke karakteristieken, die kunnen leiden tot de gerichte aflevering, verlenging van circulatietijd en reductie van toxiciteit en bijwerkingen van de door de gel getranporteerde geneesmiddelen in het lichaam. In het bijzonder staan hydrogelen die in situ gevormd kunnen worden onder fysiologische condities recentelijk in de belangstelling, aangezien zij veelbelovende drug carriers (geneesmiddeldragers) zijn. Veel van de hydrogelen die zijn ontwikkeld, kunnen door gecontroleerde afgifte de geneesmiddel concentratie binnen nauwe grenzen houden, wat essentieel is om toxiciteit door overdosis of ineffectiviteit door onderdosering te voorkomen. Hydrogel gebaseerde, gecontroleerde drug delivery systemen omzeilen bovendien het frequent of continu moeten toedienen van medicijnen, zodat zij het leven van de patiënt comfortabeler maken. Echter, de huidig beschikbare hydrogelen zijn door hun hydrofiele natuur gelimiteerd als transportmiddel voor hydrofobe medicijnen, vanwege kortdurende verhoogde afgifte van het geneesmiddel in de initiële fase. Door hydrofobe interacties kunnen bovendien grote 100
geneesmiddelaggregaten gevormd worden tijdens het insluiten van deze verbindingen in de hydrogel, waardoor een hoge lokale concentratie ontstaat, die bijwerkingen kan veroorzaken of zelfs toxisch kan zijn. Om te komen tot een hydrogel gebaseerd, gecontroleerd afgifte systeem voor hydrofobe geneesmiddelen, hebben we β- cyclodextrine of humaan serum albumine in de hydrogel matrix geïntroduceerd als primaire bindingsplaats voor dergelijke hydrofobe moleculen. In vitro gecontroleerde afgifte van model hydrofobe medicijnen werd vervolgens bestudeerd. Voorlopige in vivo resultaten, behaald met gebruik van zebravisembryo s als diermodel, geven een positief beeld, maar systematische in vivo vervolgstudies in andere zoogdieren zullen nodig zijn voordat de klinische fase bereikt wordt. In de afgelopen paar jaar zijn vele eiwitten ontwikkeld met therapeutische werking bij een veelheid aan ziektebeelden, zoals bijvoorbeeld kanker, autoimmuunziekten en metabole afwijkingen. Klinische toepassing van de meeste van deze therapeutisch actieve eiwitten wordt echter verhinderd door fundamentele technische belemmeringen, in het bijzonder op het gebied van aflevering van de eiwitten. Hydrogelen zijn ideale kandidaten om toe te passen als afgifte systeem voor eiwitten, omdat zij een grote hoeveelheid water in het polymeernetwerk bevatten en in dat opzicht op lichaamsweefsel lijken. Op die manier worden eiwitten in een beschermend drie dimensionaal netwerk opgeslagen, waarin zij hun actieve vorm behouden en niet kunnen denatureren tijdens toediening. Constante afgifte van eiwitten door hydrogel systemen werd reeds gepubliceerd, waarbij de ingekapselde eiwitten door de hydrogel matrix werden afgegeven op tijdsafhankelijke wijze. Echter, een systeem voor afgifte van eiwitten, dat naar believen kan worden aangezet en de afgifte zo op aanvraag controleert, kan mogelijk de therapeutische effectiviteit verhogen en systemische toxiciteit verlagen. Om een dergelijk systeem te ontwikkelen hebben wij zowel gecrosslinkte als niet-gecrosslinkte op UV-straling reagerende hydrogelen ontworpen, om de ingekapselde eiwitten te kunnen afgeven op door UV straling aangestuurde wijze. Door green fluorescent protein als model eiwit te gebruiken, werd deze methode van afgifte in vitro gedemonstreerd. Omdat UV-licht door huid en weefsel kan worden geabsorbeerd, is biologische toepassing van onze hydrogelen vooralsnog beperkt. Toekomstig onderzoek zal zich concentreren op het 101
ontwikkelen van hydrogelen die reageren op nabij infrarood licht, een veelbelovende klinische toepassing. Recente vooruitgang in het nanotechnologieveld hebben de ontwikkelingen op het gebied van hydrogel gebaseerde drug delivery systemen versneld, hydrogelen op nanoschaal (nanogelen) hebben de aandacht getrokken omdat zij de mogelijkheid bieden van intracellulaire drug delivery en toediening door middel van intraveneuze injectie. Nanogelen behouden de eigenschappen van hydrogelen maar hebben een sterk vergroot oppervlak en manipuleerbare grootte en vorm, wat kan bijdragen aan verbeterde efficiëntie van drug delivery aan tumoren. Macroscopische hydrogelen worden in proof-of-concept studies gebruikt omdat ze eenvoudig te maken en karakteriseren zijn. Veelbelovende macroscopische hydrogelen kunnen dan met behulp van diverse technieken opnieuw geformuleerd worden naar nanogelen, en een bijdrage leveren aan het drug delivery onderzoeksveld. 102