COO-module Signaaltransductie Niveau 2, november 2005 Inleiding 1. Hier zie je drie manieren waarop chemische signalen worden doorgegeven tussen cellen. A. Plaats de juiste namen bij de afbeeldingen. B. Welke van deze kunnen een signaal in een organisme over langere afstand doorgegeven? C. Bij welke manier verwacht je dat de affiniteit van de receptor voor het ligand het hoogst is? 2. Ieder celtype heeft een bepaalde set receptoren in de plasmamembraan die reageert op een specifieke set van signaalmoleculen. Hieronder zie je een aantal van deze sets met een cel die daar receptoren voor heeft. Probeer erachter te komen welk signaal elke set de cel geeft. a. Welke signalen moet de cel ontvangen om te overleven? b. Welke signalen moet de cel ontvangen om te delen? c. Welke signalen moet de cel ontvangen om te differentiëren? d. Welke signalen moet de cel ontvangen om te dood te gaan? 3. Hoe worden de structuren genoemd waarbij signaaloverdracht tussen cellen plaatsvindt via direct contact? 4. Het proces van cel-signalering kan onderverdeeld worden in 3 stappen. Wat zijn deze drie stappen? 1. 2. 3.
5. Nadat een ligand bindt aan zijn receptor start een signaaltransductie-cascade. Hierbij worden signalen via eiwitten doorgegeven. Bij deze overdracht zijn drie verschillende concepten / moleculaire schakelaars te onderscheiden. Welke zijn dat? 1. 2. 3. 6. Dit is een schematische weergave van de reacties waarbij een eiwit wordt gefosforyleerd en gedefosforyleerd. Plaats de ontbrekende stoffen in onderstaande tekening. 7. Hieronder staat de schematische weergave van de werking van een G-eiwit. A. Plaats de ontbrekende stoffen in onderstaande tekening. 8. A. Waar in de cel bevinden zich receptoren voor extracellulaire liganden? Behalve plasmamembraan-receptoren zijn er dus ook intracellulaire receptoren. Deze binden ook liganden die van buiten de cel komen. B. Welke eigenschap moeten de liganden hebben die binden aan de intracellulaire receptoren?
C. Wat gebeurt er met deze receptoren na binding van het ligand? D. In het geval van een steroïdreceptor wordt een proces in de kern aan de gang gezet. Welk proces? 9. Dit is een stukje van een bloedvat. Het is samengetrokken: de gladde spierweefsels zijn gespannen. Via de zenuw kan het bloedvat worden verwijdt. Dit start met de membraanreceptoren voor acetylcholine op de endotheelcellen. Acetylcholine activeert de receptor, en deze activeert in de cel NO-synthase. NO-synthase synthetiseert NO uit arginine. NO is hydrofoob en kan de membraan passeren: NO diffundeert snel naar buiten en naar de gladde spiercellen. Een receptor in de spiercellen krijgt bij binding aan NO een guanylylcyclase-activiteit. Dit enzym maakt uit GTP cyclisch GMP (cgmp, vergelijk adenylylcyclase). Cyclisch GMP laat de spiervezels zich strekken en de spieren zich ontspannen. Het effect van cgmp verdwijnt weer als het wordt afgebroken door fosfodiesterase. Viagra grijpt in op deze route om de erectie langer te laten duren. Welke stap zal Viagra remmen? 10. De membraanreceptoren die de signalen ontvangen bij signaaltransductie werken op verschillende manieren. Welke drie typen membraanreceptoren spelen een voorname rol in signaaltransductie?
G-eiwit-gekoppelde receptoren 11. Dit is een schematische weergave van een G-eiwit gekoppelde receptor. Het eiwit passeert de membraan 7 maal via α-helixen. Daarom wordt deze familie van eiwitten 7- α -helixreceptoren genoemd. Bij binding van een ligand aan de receptor treedt er een conformatieverandering op in het cytoplasmatisch deel van de receptor. Wat gebeurt er vervolgens? 12. Als het ligand bindt aan de G-eiwit gekoppelde receptor, verandert deze van vorm. Hierdoor ontstaat een bindingsplaats aan de binnenkant van de cel voor het membraan-gebonden G-eiwit. Wat gebeurt er met het G-eiwit als deze aan de receptor bindt? 13. Een G-eiwit bestaat uit drie delen: de subeenheden (α, β en γ). A. Wat gebeurt er met het trimere G-eiwit nadat GDP uitgewisseld is voor GTP? B. Hoe wordt een actief G-eiwit geïnactiveerd? C. Welke subeenheid bevat een GTP-ase activiteit? Second messengers 14. Tijdens verschillende signaaltransductie-cascades worden kleine moleculen aan- of vrijgemaakt. Deze moleculen dragen bij aan het doorgeven van het signaal. Via deze stap treedt ook een versterking of amplificatie van het signaal op. Eén molecuul van het ligand activeert het receptoreiwit. Dit geactiveerde eiwit kan een aantal G-eiwitten activeren, zodat er een aantal geactiveerde G-α-eiwitten ontstaan. Elk geactiveerd G-α-eiwit kan een enzym activeren. Dit is de eerste amplificatie-stap. Elke geactiveerd enzym kan verscheidene second messengers genereren voordat het weer wordt geïnactiveerd. Dit is de tweede amplificatie-stap.
Cyclisch AMP is een belangrijke second messenger en een onderdeel van veel G-eiwit pathways. A. Waaruit wordt camp gemaakt, en door wat? B. Waardoor wordt het enzym geactiveerd? 15. De membraangebonden b-adrenergische receptor kan drie liganden binden: isoproterenol (IP), epinefrine (EP), en norepinefrine (NEP). In de grafieken zijn de binding van deze liganden aan de receptoren en de activiteit van adenylylcyclase weergegeven als functie van de hormoonconcentratie. A. Welk hormoon heeft de hoogste affiniteit voor de β-adrenergetische receptor? B. Welk hormoon geeft bij een concentratie van 10-6 M de hoogste concentratie camp? 16. Een cel wordt gestimuleerd met epinefrine (E). Via de β-adrenerge receptor wordt uiteindelijk camp verhoogd. Vervolgens wordt een tweede ligand (X) toegevoegd, die een andere G-eiwitgekoppelde receptor bindt. Dit leidt tot een verlaging van camp. Welke stof wordt door ligand (X) geremd?
17. Deze cel heeft een laag gehalte camp. Er zijn een aantal eiwitten en stoffen nodig om de concentratie camp in de cel te verhogen. Zet deze in de tekening.
Enzymgekoppelde receptoren Enzymgekoppelde receptoren zijn receptoren waarbij een enzym direct geactiveerd wordt. Dit kan op twee manieren: 1. De receptor bevat zelf een enzymatische activiteit in het cytosolaire deel, die wordt geactiveerd na dimerisatie van de receptor. Een viertal voorbeelden zijn: - tyrosinekinase-receptoren - tyrosinefosfatase-receptoren (ligand onbekend) - seronine/threoninekinase-receptoren - guanylylcyclase-receptoren 2. Na activatie van de receptor bindt een cytosolair enzym, waardoor deze geactiveerd wordt. Een tweetal voorbeelden zijn: - tyrosine-kinase-geassocieerde receptoren - histidine-kinase-geassocieerde receptoren In dit COO gebruiken we de tyrosinekinase-receptoren (type 1) als voorbeeld. 18. Als het ligand bindt aan tyrosinekinase-receptor, verandert deze van vorm. Wat gebeurt er vervolgens met de receptor? 19. Je voert drie experimenten uit met cellen met EGF-receptoren: Proef 1: Je voegt aan een celkweek een monovalent antilichaam tegen de receptor toe. Proef 2: Je voegt aan een andere celkweek een bivalent antilichaam tegen de receptor toe. Proef 3: In een laatste experiment voeg je een monovalent antilichaam tegen de receptor toe, waarna je een bivalent antilichaam tegen het monovalente antilichaam toevoegt. Uit de cellen isoleer je eiwitten, die je scheidt met gel-elektroforese. Na het runnen blot je de gel. Deze blot incubeer je met antilichamen tegen de receptor, en antilichamen tegen de gefosforyleerde receptor. A. Waar verwacht je een signaal te zien? Antilichamen tegen de receptor Antilichamen tegen de gefosforyleerde receptor Proef1 Proef 2 Proef 3 B. Waarom verwacht je dit?
20. Het cytosolaire deel van EGF-receptoren bevat een tyrosinekinase-activiteit die een rol speelt in de activatie van de EGF-signaaltransductie cascade. Om verder inzicht in deze activatie te krijgen voer je een aantal experimenten uit. Je maakt gemuteerde EGF-receptoren: - type I: het kinase-deel is gemuteerd, zodat dat niet meer functioneel is - type II: missen de tyrosine-aminozuren die gefosforyleerd kunnen worden In cellen zonder EGF-receptoren worden deze verschillende EGF-receptoren tot expressie gebracht: A. Bij welke cellijnen worden de EGF-receptoren gefosforyleerd? B. Wat betekenen deze resultaten voor het mechanisme van fosforylatie van de EGF-receptor? C. Aan de gefosforyleerde tyrosines van de tyrosinekinase-receptoren kunnen verschillende eiwitten binden: fosfolipase-c, PI-3-kinase, Grb-2, Src, enzovoort. Wat hebben deze eiwitten gemeen waardoor ze aan de gefosforyleerde tyrosines kunnen binden? 21. Tyrosinekinase-receptoren activeren onder andere de Ras-route. Ras, een klein G-eiwit, komt voor in actieve en inactieve vorm, vergelijkbaar met de trimere G-eiwitten. De overgang tussen deze vormen wordt gereguleerd door twee enzymen: GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor) en GAP (GTP-ase Activating Protein). Zet deze enzymen en de andere stoffen op de juiste plaats in het schema.
Samenvatting In de animatie worden de verschillende stappen van de EGF-receptor signaaltransductie nog eens getoond: a. EGF bindt aan speciale receptoren in de celmembraan. b. Receptoren waaraan EGF is gebonden bewegen naar elkaar toe en binden aan elkaar. c. De receptoren kunnen elkaar fosforyleren, en aan een aantal tyrosines van elke receptor bindt een fosfaatgroep. d. Eén van deze fosfaatgroepen vormt een bindingsplaats voor het eiwit Grb-2. Zodra dit is gebonden verandert het van vorm. e. Hierdoor ontstaat een bindingsplaats voor een tweede eiwit, GEF (Ras Guanine nucleotide Exchange Factor). f. GEF stimuleert het membraangebonden Ras zijn GDP te verwisselen voor een GTP. Ras wordt hierdoor geactiveerd en bindt (in dit voorbeeld) aan membraangebonden RAF. g. RAF wordt geactiveerd en is daardoor in staat MEK te fosforyleren. h. MEK wordt geactiveerd en fosforyleert op zijn beurt ERK. i. Geactiveerd ERK kan MAP fosforyleren en is dus een MAP-kinase. MEK is dan dus een MAPkinase-kinase, en RAF een MAP-kinase-kinase-kinase. EGF-receptor: Epidermale Groei Factor Receptor: een transmembrane tyrosinekinase-receptor voor EGF. EGF Epidermale Groei Factor: een 6000 dalton groot eiwit, dat een rol speel bij onder andere de groei van huidcellen. Ras Ras is een klein G-eiwit, dat via een vetzuurstaart in de membraan verankerd is. De GDP-vorm is inactief, de GTP-vorm is actief. Ras activeert RAF. RAF RAF is een serine/threonine kinase, dat MEK fosforyleert en activeert. MEK MEK is een tyrosine/threonine kinase, dat MAP-kinase fosforyleert en activeert. ERK ERK, een MAP-kinase, is een serine/threonine kinase dat onder andere naar de kern translokeert en daar transcriptie factoren fosforyleert en activeert. Grb-2 Grb-2: een adaptor eiwit, dat via een SH2-domein aan een specifieke gefosforyleerde tyrosine van de EGF-receptor bindt. GEF GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor) zorgt ervoor dat de GDP van Ras omgewisseld wordt door een GTP. SOS kan binden aan Grb-2. SOS SOS: een GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor) dat ervoor zorgt dat de GDP van Ras omgewisseld wordt door een GTP. SOS kan binden aan Grb-2. 22. Geef van de onderdelen van deze cascade de manier aan waarop het signaal doorgegeven wordt. fosforylatie GDP/GTP-uitwisseling Eiwit-eiwit-interactie
23. PI-3-kinase is een enzym dat geactiveerd wordt via tyrosinekinase-gekoppelde receptoren. Hiernaast zie je een voorbeeld van zo'n receptor: de PDGFreceptor (platelet-derived growth factor-receptor). Het kinase-gebied is verdeeld in twee delen. Er zijn 5 tyrosinen die gefosforyleerd kunnen worden, en elk een bindingsplaats vormen voor SH2-bevattende eiwitten, zoals: - PI-3-kinase kan aan elk van de bovenste twee tyrosinen binden, - aan de middelste tyrosine kan GAP binden (GTP-ase activating protein), dat in staat is om Ras te inactiveren door de gebonden GTP te hydrolyseren in GDP, en - aan de onderste twee tyrosinen kan fosfolipase-c binden. In de volgende vragen zal worden ingegaan op de werking van PI-3-kinase en fosfolipase-c. Fosfatidyl-inositol (PI) is de uitgangsstof voor de vorming van verschillende signaalmoleculen. PI kan omgezet worden in twee verschillende vormen van PIP. PIP kan worden omgezet in twee verschillende vormen van PIP 2. PIP 2 kan worden omgezet in PIP 3. A. Welke van deze reacties wordt of worden gekatalyseerd door PI-3-kinase? Er kunnen dus verschillende tussen- en eindproducten ontstaan via de PI-kinasen. Fosfolipase-C is in staat om één van deze stoffen te splitsen in de twee signaalmoleculen IP 3 (inositol 1,4,5- trifosfaat) en DAG. B. Welke van deze fosfatidyl-inositiden kan door fosfolipase-c-β (of -γ) op deze manier gesplitst worden? C. Welke functie hebben een aantal andere fosfatidyl-inositol-fosfaten? D. Via welk domein binden deze eiwitten aan deze inositol-fosfolipiden?
Animatie activatie proteïnekinase B: a. Aan de geactiveerde receptor bindt PI-3-kinase, dat daardoor wordt geactiveerd. b. PI-3-kinase kan een aantal PI(4,5)P 2 fosforyleren tot PI(3,4,5)P 3. c. Deze PIP 3 functioneren als docking sites voor verschillende eiwitten, zoals PDK1 (PIafhankelijke kinase 1) en proteïnekinase B. d. PDK1 verandert van vorm en is nu in staat het naburige proteïnekinase B te fosforyleren. e. Proteïnekinase B verandert van vorm en laat los, zodat het nu zelf ook geactiveerd is, zodat het andere eiwitten kan fosforyleren. 24. Door stimulatie van de tyrosine-kinase-receptoren van een cel met een groeifactor treedt uiteindelijk celdeling op. Je wilt dit proces verder gaan onderzoeken, en start met het onderzoeken van de rol van PI-3-kinase. In het eerste experiment gebruik je Wortmannin, dat PI-3-kinase remt. Je voegt dit toe aan cellen, die daarna worden gestimuleerd met PDGF (Platelet Derived Growth Factor). Deze cellen blijken niet meer te delen na stimulatie met PDGF. A. Verwacht je effect van Wortmannin op de fosforylatie van de receptor na toedienen van PDGF? Gefosforyleerde tyrosines vormen bindingsplaatsen voor enzymen, zoals PI-3-kinase dat met het SH2-domein hieraan bindt. De specificiteit van de binding van het SH2-domein aan de gefosforyleerde tyrosines wordt bepaald door de aminozuren die de tyrosine flankeren. PI 3 -kinase wordt vervolgens geactiveerd, wat noodzakelijk is voor celgroei. Je wilt de gefosforyleerde tyrosines bepalen waaraan PI-3-kinase bindt. Er zijn 4 tyrosines op de receptor, dus ook 4 mogelijke fosforylatie-sites. Je synthetiseert daarom 4 verschillende pentapeptiden (peptides van 5 aminozuren), die elk een tyrosine-residu bevatten. Door cellen te laden met een overmaat pentapeptiden met een bindingsplaats voor PI-3-kinase, hoop je te verhinderen dat PI-3-kinase aan de receptoren bindt, en de cel niet zal reageren op PDGF met celgroei. Resultaten: Reactie na toevoeging van groeifactor type pentapeptide 1 2 3 4 cel met niet-gefosforyleerde pentapeptiden + + + + cel met gefosforyleerde pentapeptiden + - - + + = celgroei B. Aan welke pentapeptide(n) bindt PI-3-kinase?
Second messengers (2) 25. In de membraan zit het lipid fosfatidyl-inositol (PI). Als dit op twee plaatsen gefosforyleerd wordt onstaat het molecuul PIP 2. PIP 2 speelt een belangrijke rol bij de signaaltransductie. A. Geef aan op welke plaats PI wordt gefosforyleerd door PI-4-kinase. Na fosforylatie door PI-4-kinase ontstaat er fosfatidyl-inositoi-4-fosfaat (PIP). B. Geef aan op welke plaats PIP weer wordt gefosforyleerd door PIP-5- kinase. 26. PI in de membraan kan worden gefosforyleerd tot er PIP 2 ontstaat. Fosfolipase-C kan PIP 2 afbreken. Hierbij wordt PIP 2 gesplitst in IP 3 en DAG. Geef (hierboven) aan waar PIP 2 gesplitst gaat worden. 27. Fosfolipase-C kan PIP 2 splitsen in IP 3 en DAG. DAG blijft in het membraan achter. Het wateroplosbare second messenger IP 3 komt vrij in de cytosol. A. Wat is het effect van IP 3 in de cel? B. Via welke receptoren kan fosfolipase-c geactiveerd worden?
28. De calciumconcentratie in het cytoplasma van deze cel is erg laag, terwijl buiten de cel en in het ER de calciumconcentratie hoog is. Van het ER is een klein deel afgebeeld. Een extracellulair signaal kan het vrijkomen van calciumionen uit het ER veroorzaken. Bouw de pathway waarmee de cel kan reageren op een externe prikkel om de Ca2+-concentratie te verhogen. 29. In eukaryotische cellen is de vrije Ca 2+ -concentratie vaak lager dan buiten de cel. Op welke 5 manieren kan de cel daarvoor zorgen?
Animatie activatie CaM-kinase Het vrijkomen van Ca 2+ activeert het proteïnekinase C, dat weer verschillende andere doeleiwitten in de cel heeft, onder andere genregulerende. Daarnaast worden ook nog andere kinases geactiveerd, zoals het calmodulinekinase (CaM-kinase II). 30. De twee pathways die via de G-eiwit gekoppelde receptoren en tyrosinekinase-receptoren worden geactiveerd staan niet apart. In de figuur die zodadelijk opgebouwd wordt zul je zien dat er 'cross talk' tussen de pathways plaatsvindt. De pathways leiden tot de activatie van kinases die hun substraten activeren door fosforylatie. Sommige van deze substraten kunnen door verschillende kinases, en dus verschillende pathways, geactiveerd worden. A. Maak het schema af. B. Geef in het schema de second messengers aan.
31. De receptorsignalering moet op een gegeven moment weer geïnactiveerd worden. Hier zie je de schematische weergaven hoe dat op vijf verschillende manieren kan. Zet de juiste namen onder de afbeeldingen.