UDC 663.813.014:547.466.062 Vruchtesappen Bepaling van het gehalte aan vrije aminozuren Kolomchromatografische methode Fruit juices - Determination of free amino acids content Column chromatographic method NEDERLANDSE NORM 1e druk, april 1984 1 Onderwerp en toepassingsgebied Deze norm beschrijft een kolomchromatografische bepaling van vrije aminozuren in vruchtesappen. 2 Definitie gehalte aan vrij aminozuur: De hoeveelheid DL-aminozuur in een monster gedeeld door de massa van het monster. Opmerking Het gehalte aan vrij aminozuur wordt uitgedrukt in mmol/kg. Dit document mag slechts op een stand-alone PC worden geinstalleerd. Gebruik op een netwerk is alleen. toestaan als een aanvullende licentieovereenkomst voor netwerkgebruik met NEN is afgesloten. This document may only be used on a stand-alone PC. Use in a network is only permitted when a supplementary license agreement for us in a network with NEN has been concluded. 3 Beginsel De vrije aminozuren, aanwezig in een op ph = 2 gebrachte hoeveelheid vruchtesap, worden door middel van kolomchromatografie gescheiden in de afzonderlijke aminozuren met behulp van geschikt gekozen elutiemiddelen. Deze aminozuren worden direct of in gederivatiseerde vorm bepaald met een daarvoor geschikte detector. Via berekening van de verhouding van de geregistreerde piekoppervlakken ten opzichte van een standaard wordt het gehalte aan vrije aminozuren in het vruchtesap bepaald. 4 Reagentia en hulpstoffen Alle reagentia en chemicaliën moeten geschikt zijn voor vloeistofchromatografische doeleinden en vrij zijn van ammoniumhoudende verbindingen. Gebruik dubbel gedestilleerd water of daarmee in kwaliteit overeenkomend water met een geleidingsvermogen van ten hoogste 10 us. 4.1 Interne standaard. Gebruik een interne standaard zoals aangegeven in bijlage B.1. 4.2 Standaardmengsel van aminozuren. Gebruik een standaardmengsel van aminozuren zoals aangegeven in bijlage С 4.3 Chemicaliën. Gebruik chemicaliën zoals aangegeven in de gebruiksaanwijzing van de fabrikant van de vloeistofchromatograaf. 5 Toestellen en hulpmiddelen Gebruikelijke laboratoriumtoestellen en hulpmiddelen en in het bijzonder de volgende. 5.1 Een vloeistofchromatograaf (zie bijlage A) geschikt voor het bepalen van aminozuren, bestaande uit de volgende onderdelen: - één of meer, al dan niet dubbelwandige, vloeistofchromatografiekolommen, voorzien van een geschikte kolomvulling; - één of meer vloeistofpompen; - verwarmingssysteem met thermostaat voor regeling van de kolomtemperatuur, waarbij de temperatuurvariatie niet groter mag zijn dan ± 0,1 C; - indien nodig: een thermostaatbad waarin het reactiemengsel met de eluerende aminozuren kan reageren, waarbij de temperatuurvariatie niet groter mag zijn dan ± 0,5 C; - spectrofotometer geschikt om de al dan niet gederivatiseerde aminozuren te detecteren; - schrijver; - voorziening om piekoppervlakken te meten, bij voorkeur een elektronisch integratiesysteem. 5.2 ph-meter volgens NEN 2833. De meter moet voor gebruik worden geijkt op bufferoplossingen met nauwkeurig bekende ph.
2 6 Voorbehandeling van het monster Meng het laboratoriummonster goed en filtreer of centrifugeer het ter verwijdering van zwevende bestanddelen. 7 Werkwijze Opmerking Het laboratoriummonster moet direct worden geanalyseerd of worden ingevroren om bederf door bacteriën en schimmels te voorkomen. 7.1 Chromatografische condities Stel de apparatuur in zoals aangegeven in de gebruiksaanwijzing van de fabrikant. De chromatografische condities voor een goede scheiding zijn van zoveel factoren afhankelijk, dat deze norm slechts een algemene richtlijn kan geven. 7.2 Bepaling van responsfactoren Chromatografeer enige malen een geschikte hoeveelheid standaardmengsel aminozuren (bijlage C), al dan niet voorzien van een interne standaard (chromatogram s). Bereken per aminozuur van deze chromatogrammen de gemiddelde responsfactor zoals aangegeven in bijlage A onder A.5.4 of A.5.5 en de variatiecoëfficiënt volgens NEN 1047 blad 3.1. De variatiecoëfficiënt mag niet meer bedragen dan 3%. Bereken voorts de scheiding (p) zoals aangegeven in bijlage A onder A.5.1 van enige "kritische" aminozuren, die zijn aangegeven in bijlage A onder A.4. De scheiding (p) moet ten minste 67% bedragen. Voor het bepalen van de responsfactoren dienen de retentietijden constant te blijven. 7.3 Bepaling in het analysemonster Weeg een geschikte hoeveelheid van het voorbehandelde monster af en voeg hierbij een zodanige hoeveelheid interne standaard (zie bijlage B) dat de te verkrijgen pieken van de belangrijkste aminozuren in het analysemonster en de piek van de interne standaard ongeveer even groot zijn. Chromatografeer onder dezelfde instrumentele omstandigheden als gebruikt bij het standaardmengsel. De retentietijden, berekend zoals aangegeven in bijlage A onder A.5.2, dienen in vergelijking met die van het standaardmengsel binnen nader aan te geven grenzen te vallen. 7.4 Voer de bepaling in duplo uit. 8 Berekening (zie ook bijlage A.5.3) 8.1 Methode met interne standaard Bereken het gehalte aan aminozuur / met behulp van de formule:,. rn s -A r K si Kj r - m-a s waarin: F is de gebruikte verdunningsfactor; m s is de hoeveelheid interne standaard, in mmol; Aj ïïthet piekoppervlak van het te bepalen aminozuur /, in mm 2 of integratoreenheden; K si is de responsfactor van het te bepalen aminozuur /ten opzichte van de interne standaard s; m is de massa van het analysemonster, in g; A s is het piekoppervlak van de interne standaard, in mm 2 of integratoreenheden; kj is het gehalte aan aminozuur /, in mmol/kg. 8.2 Methode met externe standaard Bereken het gehalte aan aminozuur / met behulp van de formule: m waarin: F is de gebruikte verdunningsfactor; Aj is het piekoppervlak van het te bepalen aminozuur /, in mm 2 of integratoreenheden; Kj is de responsfactor van het te bepalen aminozuur /; /г? is de massa van het analysemonster, in g; kj is het gehalte aan aminozuur /, in mmol/kg.
3 8.3 Neem als resultaat het rekenkundig gemiddelde van twee bepalingen volgens 8.1 en 8.2, als aan de voorwaarde van de herhaalbaarheid (9) is voldaan. Geef het gehalte aan aminozuren op in twee decimalen. 9 Herhaalbaarheid Het verschil tussen de uitkomsten van een bepaling in duplo, kort na elkaar uitgevoerd door dezelfde analist onder dezelfde omstandigheden, mag niet groter zijn dan 5 % van hun gemiddelde. Dit geldt voor aminozuurgehalten van 0,5 mmol/kg of meer. 10 Verslag Vermeld in het verslag: a. type en identificatie van het laboratoriummonster; b. de verkregen gehalten aan vrije aminozuren, in mmol/kg; c. de gevolgde methode door de vermelding: volgens.
4 Bijlage A Het chromatografische systeem A.1 Eisen te stellen aan het chromatografische systeem Het chromatografische systeem moet geschikt zijn om de onder A.3 genoemde aminozuren te scheiden. A.2 Eisen te stellen aan het chromatogram A.2.1 Invloeden op de scheiding De scheiding van de aminozuren is van vele factoren afhankelijk zoals: - fysisch-chemische eigenschappen van de aminozuren; - eigenschappen van de kolomvulling; - ph en ionensterkte van de gebruikte buffers; - toevoegingen aan de buffers; - temperatuur van de kolom; - pompsnelheid. Het blijkt dat sommige aminozuren door bovenstaande factoren sterker worden beïnvloed dan andere aminozuren (bijlage C). A.2.2 A.2.3 A.2.4 Derivatisering De extinctie die wordt gemeten na de derivatisering, kan sterk afhankelijk zijn van de reactietemperatuur en de reactietijd. Het constant houden van de reactietemperatuur en de reactietijd is dan ook noodzakelijk. Lineariteit In het gebied waarin wordt gewerkt, moet voor de desbetreffende aminozuren een lineair verband bestaan tussen extinctie en concentratie. Retentietijd De retentietijden van de aminozuren uit het monster mogen enigszins veranderen, mits de responsfactoren van de aminozuren uit het standaardmengsel van aminozuren ongewijzigd blijven. A.3 Belangrijke aminozuren Voor het karakteriseren van vruchtesappen zijn onder meer de volgende aminozuren van belang: alanine y-aminoboterzuur arginine asparagine asparaginezuur glutaminezuur glycine proline serine Andere aminozuren die nog kunnen voorkomen: cystine glutamine histidine isoleucine leucine lysine methionine ornithine fenylalanine threonine tyrosine valine A.4 Kritische combinaties van aminozuren Sommige combinaties van aminozuren zijn ook onder optimale omstandigheden moeilijk of niette scheiden. Het betreft de volgende kritische combinaties: de basische aminozuren: de neutrale en zure aminozuren: - ornithine-lysine - threonine-serine - histidine-ammoniak - asparagine-glutaminezuur - proline-glycine - glycine-alanine - valine-cystine
Bestelformulier Stuur naar: NEN Standards Products & Services t.a.v. afdeling Klantenservice Antwoordnummer 10214 2600 WB Delft Ja, ik bestel NEN Standards Products & Services Postbus 5059 2600 GB Delft Vlinderweg 6 2623 AX Delft T (015) 2 690 390 F (015) 2 690 271 www.nen.nl/normshop ex. :1984 nl Vruchtesappen - Bepaling van het gehalte aan vrije aminozuren - Kolomchromatografische methode 24.20 Wilt u deze norm in PDF-formaat? Deze bestelt u eenvoudig via www.nen.nl/normshop Gratis e-mailnieuwsbrieven Wilt u op de hoogte blijven van de laatste ontwikkelingen op het gebied van normen, normalisatie en regelgeving? Neem dan een gratis abonnement op een van onze e-mailnieuwsbrieven. www.nen.nl/nieuwsbrieven Gegevens Bedrijf / Instelling T.a.v. O M O V E-mail Klantnummer NEN Uw ordernummer BTW nummer Postbus / Adres Postcode Plaats Telefoon Fax Factuuradres (indien dit afwijkt van bovenstaand adres) Postbus / Adres Postcode Plaats Datum Handtekening Retourneren Fax: (015) 2 690 271 E-mail: klantenservice@nen.nl Post: NEN Standards Products & Services, t.a.v. afdeling Klantenservice Antwoordnummer 10214, 2600 WB Delft (geen postzegel nodig). Voorwaarden De prijzen zijn geldig tot 31 december 2016, tenzij anders aangegeven. Alle prijzen zijn excl. btw, verzend- en handelingskosten en onder voorbehoud bij o.m. ISO- en IEC-normen. Bestelt u via de normshop een pdf, dan betaalt u geen handeling en verzendkosten. Meer informatie: telefoon (015) 2 690 391, dagelijks van 8.30 tot 17.00 uur. Wijzigingen en typefouten in teksten en prijsinformatie voorbehouden. U kunt onze algemene voorwaarden terugvinden op: www.nen.nl/leveringsvoorwaarden. Normalisatie: de wereld op één lijn. preview - 2016