Nederlandse NEN 6875 Melk en melkprodukten Bepaling van het gehalte aan Bacillus cereus of aan sporen daarvan Milk and milk products. Determination of Bacillus cereus content or its spores 2e druk, juli 1993 UDC 637.14.055:579.852.11 Dit document mag slechts op een stand-alone PC worden geinstalleerd. Gebruik op een netwerk is alleen. toestaan als een aanvullende licentieovereenkomst voor netwerkgebruik met NEN is afgesloten. This document may only be used on a stand-alone PC. Use in a network is only permitted when a supplementary license agreement for us in a network with NEN has been concluded. 1 Onderwerp Deze norm beschrijft een methode voor de bepaling van het gehalte aan Bacillus cereus of aan sporen daarvan in melk en melkprodukten. Voor algemene aanwijzingen voor microbiologisch onderzoek is een praktijkrichtlijn in voorbereiding. 2 Termen en definities 2.1 Bacillus cereus respectievelijk sporen van B. cereus: Micro-organismen die volgens de beschreven werkwijze op een selectief vast voedingsmedium karakteristieke kolonies vormen en die bij bevestiging kenmerkende reacties vertonen. 2.2 gehalte aan Bacillus cereus respectievelijk sporen van B. cereus: Het aantal kolonievormende eenheden van Bacillus cereus respectievelijk sporen daarvan per volume melk of vloeibaar melkprodukt, of per massa niet-vloeibaar melkprodukt. 3 Beginsel Het gehalte aan B. cereus of aan sporen daarvan wordt uitgedrukt in het aantal kolonievormende eenheden per ml melk of vloeibaar melkprodukt, of per g niet-vloeibaar melkprodukt. Een hoeveelheid analysemonster of verdunning ervan wordt gelijkmatig verdeeld over een selectief voedingsmedium. De karakteristieke kolonies die na bebroeding bij 30 C zijn gevormd, worden, zo nodig na bevestiging, geacht afkomstig te zijn van vegetatieve cellen en/of sporen van B. cereus. Na toepassing van een pasteurisatie worden uitsluitend sporen van B. cereus bepaald. Voor zeer lage gehalten aan sporen van B. cereus kan concentratie door middel van centrifugeren worden toegepast. 4 Voedingsmedia, reagentia en hulpstoffen 4.1 Algemeen Gebruik materialen die voldoende zuiver zijn. Gebruik gedestilleerd of op andere wijze gedemineraliseerd water. Het water mag geen voor micro-organismen giftige bestanddelen bevatten. Voor een goede reproduceerbaarheid van de resultaten verdient het aanbeveling uit te gaan van in de handel verkrijgbare gedroogde ingrediënten of droge voedingsmedia. De instructies van de fabrikant betreffende het oplossen moeten nauwgezet worden gevolgd. Gebruik voor de meting van de ph een ph-meter; referentietemperatuur 25 C. Indien de voedingsmedia na sterilisatie niet direct worden gebruikt, moeten ze in het donker worden bewaard tussen 0 C en 5 C en onder omstandigheden waar geen veranderingen in de samenstelling optreden. Bewaar de voedingsmedia niet langer dan een maand. 4.2 Basismedium pepton 10,0 g vleesextractpoeder 1,0 g D-mannitol (C 6 H 14 O 6 ) 10, 0 g natriumchloride 10,0 g fenolrood 0,025 g agar, afhankelijk van de geleereigenschappen 10 15 g water 900 ml op in het water. Stel de ph van de oplossing zo in dat deze na sterilisatie 7,2 0,1 bedraagt bij 25 C. Verdeel het medium in hoeveelheden van 90 ml in kolven en steriliseer gedurende 15 min bij 121 C 1 C. 4.3 Polymyxine-oplossing polymyxine-b-sulfaat 0,100 g (op basis van ca. 10 000 eenheden/mg) water 100 ml Bereid een oplossing van bovengenoemde samenstelling en steriliseer door middel van membraanfiltratie. een maand houdbaar. 4.4 Eidooieremulsie, ca. 20 % (V/V) Gebruik hiervoor een in de handel in steriele vorm verkrijgbaar en gestandaardiseerd preparaat. 4.5 Voedingsmedium Manitol-eidooier-polymyxine-agar (MYP-agar). basismedium (4.2) 90 ml polymyxine-oplossing (4.3) 1 ml eidooieremulsie (4.4) 10 ml 1993 Nederlands Normalisatie-instituut Kalfjeslaan 2, Postbus 5059, 2600 GB Delft, Telefoon (015) 690 390, Fax (015) 690 190
NEN 6875 Blz. 2 Meng kort voor het gebruik de vereiste hoeveelheden polymyxine-oplossing en eidooieremulsie met het gesmolten en tot ca. 50 C afgekoelde basismedium. Giet het medium uit in petrischalen. Doseer daarbij 15 ml tot 20 ml medium per petrischaal met een middellijn van ca. 9 cm en 35 ml tot 50 ml medium per petrischaal met een middellijn van ca. 14 cm. Bewaar de platen niet langer dan 4 h bij kamertemperatuur; bij ca. 4 C kunnen ze een week worden bewaard. Droog zo nodig de platen voor gebruik zo dat de opgebrachte hoeveelheid monster of verdunning voldoende snel wordt opgenomen. Gebruik hiervoor een stoof of steriele werkbank (5.6). 4.6 Glucoseagar trypton 10,0 g gistextract 1,5 g glucose (C 6 H 12 O 6 ) 0 g natriumchloride 5,0 g broomcresolpurper 0,015 g agar, afhankelijk van de geleereigenschappen 10 15 g Breng hoeveelheden van 15 ml in cultuurbuizen en steriliseer gedurende 15 min bij 121 C 1 C. 4.7 Voges-Proskauermedium (VP-medium) pepton 7,0 g glucose 5,0 g dikaliumwaterstoffosfaat (K 2 HPO 4 ) 5, 0 g natriumchloride 5,0 g Breng hoeveelheden van 5 ml in cultuurbuizen en steriliseer gedurende 15 min bij 121 C 1 C. 4.8 Voges-Proskauerreagens 4.8.1 Kaliumhydroxide-oplossing kaliumhydroxide (85 % (m/m)) 40,0 g water 100 ml Los het kaliumhydroxide op in het water. 4.8.2 -Naftoloplossing -naftol 5,0 g ethanol 96 % (V/V) 100 ml Los de -naftol op in de ethanol. 4.8.3 Creatinekristallen 4.9 Nitraatmedium pepton 5,0 g vleesextract 3,0 g kaliumnitraat (KNO 3 ) 1, 0 g Breng hoeveelheden van 5 ml in buizen en steriliseer gedurende 15 min bij 121 C 1 C. 4.10 Nitrietreagens 4.10.1 5-Amino-2-naftaleensulfonzuuroplossing 5-amino-2-naftaleensulfonzuur 0,1 g azijnzuur 15 % (V/V) 100 ml Los het 5-amino-2-naftaleensulfonzuur op in het azijnzuur en filtreer door snel filtrerend kwantitatief filtreerpapier. een maand houdbaar mits bewaard in een goed gesloten bruine fles. 4.10.2 Sulfanilzuuroplossing sulfanilzuur 0,4 g azijnzuur 15 % (V/V) 100 ml Los het sulfanilzuur op in het azijnzuur en filtreer door snel filtrerend kwantitatief filtreerpapier. een maand houdbaar mits bewaard in een goed gesloten bruine fles. 4.10.3 Volledig nitrietreagens Meng kort voor gebruik gelijke hoeveelheden van de oplossingen 4.10.1 en 4.10.2. Het mengsel is niet houdbaar. 4.11 Zinkpoeder 5 Toestellen, glaswerk en hulpmiddelen Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor een microbiologisch laboratorium en in het bijzonder de onderstaande. 5.1 Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm of ca. 14 cm. 5.2 Spatels om het monstermateriaal gelijkmatig over het oppervlak te verdelen. 5.3 Membraanfilters, poriëngrootte 0,45 m met bijbehorende filtreerapparatuur. 5.4 Waterbaden, waarvan een ingesteld op een temperatuur van 50 C 1 C en een op een temperatuur van 75 C 1 C. 5.5 Broedstoof, ingesteld op 30 C 1 C. 5.6 Stoof, ingesteld op een temperatuur van ca. 50 C of steriele werkbank. 5.7 Centrifuge, met een radiale versnelling van ten minste 1000 g n, met bijbehorende steriliseerbare centrifugebuizen met een inhoud van ten minste 50 ml.
NEN 6875 Blz. 3 6 Voorbehandeling van het monster Behandel het monster voor volgens NEN 6872. 7 Werkwijze Zie voor de monsterneming NEN 3748. 7.1 Bepaling van het gehalte aan B. cereus (vegetatieve cellen en/of sporen) 7.1.1 Bereid van vaste en dikvloeibare produkten de eerste 7.1.2 Bereid zo nodig verdere decimale verdunningen. 7.1.3 Ga verder volgens 7.4. 7.2 Bepaling van het gehalte aan sporen van B. cereus Voor de bepaling van uitsluitend het gehalte aan sporen van B. cereus moet het vloeibare analysemonster, of de eerste decimale verdunning van vaste of dikvloeibare produkten, vooraf worden gepasteuriseerd. Ga in dat geval als volgt te werk. 7.2.1 Bereid van vaste en dikvloeibare produkten de eerste Zorg ervoor dat de pasteurisatie volgens 7.2.4 binnen 15 min na het begin van de bereiding van de eerste decimale verdunning is gestart om ontkieming van sporen vóór het pasteuriseren te voorkomen. Indien de eerste decimale verdunning direct in smeltend ijs wordt gezet, mag deze tijd 1 h bedragen. 7.2.2 Breng 5 ml tot 10 ml analysemonster of eerste decimale verdunning in een steriele buis. Voorkom hierbij dat onderzoekmateriaal in aanraking komt met het deel van de wand van de buis dat ligt boven het uiteindelijke vloeistofniveau in de buis. 7.2.3 Breng de buis in het waterbad van 75 C (5.4) en zorg ervoor dat het vloeistofniveau in de buis ten minste 4 cm onder het waterniveau staat. 7.2.4 Gebruik voor het vaststellen van de pasteurisatieintensiteit een controlebuis. Bepaal het tijdstip waarop de inhoud van de buis een temperatuur van 74 C heeft bereikt en pasteuriseer daarna 5 min. De tijd van opwarmen mag ten hoogste 5 min bedragen. Koel de buis na pasteurisatie onmiddellijk af tot ca. 20 C. 7.2.5 Bereid zo nodig verdere decimale verdunningen. 7.2.6 Ga verder volgens 7.4. 7.3 Bepaling van zeer lage gehalten aan sporen van B. cereus Voor de bepaling van zeer lage gehalten aan sporen van B. cereus kan concentratie door middel van centrifugeren worden toegepast. Ga in dat geval als volgt te werk. Concentratie kan van belang zijn voor melk en poedervormige produkten. 7.3.1 Bereid van vaste en dikvloeibare produkten de eerste Zorg ervoor dat de pasteurisatie volgens 7.3.4 binnen 15 min na het begin van de bereiding van de eerste decimale verdunning is gestart om ontkieming van sporen vóór het pasteuriseren te voorkomen. Zie de opmerking onder 7.2.1. 7.3.2 Breng ca. 50 ml analysemonster of eerste decimale verdunning in een steriele kolf. Voorkom hierbij dat onderzoekmateriaal in aanraking komt met het deel van de wand van de kolf dat ligt boven het uiteindelijke vloeistofniveau in de kolf. 7.3.3 Breng de kolf in het waterbad van 75 C (5.4) en zorg ervoor dat het vloeistofniveau in de kolf ten minste 4 cm onder het waterniveau staat. 7.3.4 Gebruik voor het vaststellen van de pasteurisatieintensiteit een controlekolf. Bepaal het tijdstip waarop de inhoud van de kolf een temperatuur van 74 C heeft bereikt en pasteuriseer daarna 5 min. De tijd van opwarmen mag ten hoogste 10 min bedragen. Koel de kolf na pasteurisatie onmiddellijk af tot ca. 20 C. 7.3.5 Breng op aseptische wijze 30 ml gepasteuriseerd onderzoekmateriaal in een steriele centrifugebuis. Centrifugeer gedurende 30 min met een centrifugale versnelling van ten minste 1000 g n. 7.3.6 Giet de bovenstaande vloeistof af. Verwijder zo nodig eerst de roomlaag. 7.3.7 Breng 3 ml verdunningsvloeistof (NEN 6872) in de buis en dispergeer het sediment daarin. 7.3.8 Ga verder volgens 7.4. Gebruik daarbij petrischalen met een middellijn van 14 cm. 7.4 Enting en bebroeding 7.4.1 Maak een keuze uit het wel of niet gepasteuriseerde vloeibare monster, de wel of niet gepasteuriseerde eerste decimale verdunningen, de na concentratie verkregen vloeistof of decimale verdunningen van genoemde vloeistoffen (7.1, 7.2 of 7.3) zo, dat bij enting van de onder 7.4.2 genoemde hoeveelheid aan het einde van de bebroedingsperiode ten minste een petrischaal kan worden verwacht met in totaal niet meer dan 100 kolonies voor petrischalen met een middellijn van 9 cm en niet meer dan 200 kolonies voor petrischalen met een middellijn van 14 cm. 7.4.2 Pipetteer een hoeveelheid van het wel of niet gepasteuriseerde vloeibare monster, van de gekozen verdunningen of van de vloeistof die is verkregen na concentratie, centraal op het voedingsmedium in telkens twee petrischalen met voedingsmedium (4.5) en verdeel deze hoeveelheid met een steriele spatel (5.2) gelijkmatig over het voedingsmedium. Pipetteer 0,1 ml indien petrischalen met een middellijn van 9 cm worden gebruikt en 0,3 ml indien petrischalen met een middellijn van 14 cm worden gebruikt. 7.4.3 Plaats de petrischalen met de bodem naar boven in een broedstoof bij 30 C 1 C en bebroed gedurende 18 h tot 24 h. Voor een betere herkenbaarheid van de kolonies kan het soms gewenst zijn de incubatietijd tot ca. 48 h te verlengen. 7.5 Telling van het aantal kolonies Gebruik voor de telling van het aantal kolonies petrischalen met een middellijn van 9 cm die in totaal niet meer dan 100 kolonies bevatten, dan wel petrischalen met een middellijn van 14 cm die in totaal niet meer dan 200 kolonies bevatten. Nauwelijks zichtbare kolonies hoeven hierbij niet in aanmerking te worden genomen. Tel de voor B. cereus karakteristieke kolonies: zij hebben een karakteristieke vorm, zijn gewoonlijk omgeven door een witte neerslaghof en laten de kleur van de voedingsbodem
NEN 6875 Blz. 4 onveranderd. Petrischalen waarin een of geen karakteristieke kolonies voorkomen, mogen niet bij de telling worden betrokken. In geval alleen petrischalen van respectievelijk 9 cm en 14 cm beschikbaar zijn met in totaal meer dan 100 respectievelijk 200 duidelijk zichtbare kolonies, schat dan, indien mogelijk, het aantal karakteristieke kolonies in petrischalen met de hoogste verdunning. 7.6 Bevestiging 8 Berekening 8.1 Berekening van het gehalte aan B. cereus (vegetatieve cellen en/of sporen) 8.1.1 Bereken met behulp van de uitkomsten verkregen volgens 7.5 en eventueel 7.6 het gehalte aan B. cereus met de formule: N c C n1 0,1 n 2 f Indien gewenst, en zeker als het typische karakter van de kolonies niet goed tot uiting komt, kunnen onderstaande bevestigingsreacties worden uitgevoerd. 7.6.1 Selectie en reinkweken van kolonies voor bevestiging Onderzoek per petrischaal, willekeurig verdeeld over het getelde aantal, enkele verdachte kolonies, bij voorkeur de vierkantswortel van het totale aantal per petrischaal, doch indien aanwezig ten minste vijf kolonies. Strijk deze kolonies uit op platen met voedingsmedium (4.5) zo dat na bebroeden losliggende kolonies kunnen worden verwacht. Bebroed 18 h tot 24 h bij 30 C. Kies van iedere plaat ten minste een losliggende kolonie voor onderstaande biochemische bevestiging. 7.6.2 Biochemische bevestiging 7.6.2.1 Glucosefermentatie Beënt glucoseagar (4.6) met bacteriemateriaal van een volgens 7.6.1 reingekweekte kolonie, door middel van een rechte steek in de glucoseagar. Bebroed gedurende 24 h bij 30 C. Een gele kleur door de hele buis wijst op glucosefermentatie. 7.6.2.2 Acetylmethylcarbinolvorming Beënt VP-medium (4.7) met bacteriemateriaal van een volgens 7.6.1 reingekweekte kolonie. Bebroed gedurende 24 h bij 30 C. Pipetteer vervolgens 1 ml bebroed medium in een buis en voeg 0,2 ml kaliumhydroxide-oplossing (4.8.1), 0,6 ml -naftoloplossing (4.8.2) en enkele creatinekristallen (4.8.3) toe. Schud krachtig en laat 60 min staan. Een rose kleur binnen 60 min betekent dat acetylmethylcarbinol is gevormd. Is de reactie negatief, bebroed dan de buis nogmaals gedurende 24 h bij 30 C en herhaal de reactie. 7.6.2.3 Nitraatreductie Beënt nitraatmedium (4.9) met bacteriemateriaal van een volgens 7.6.1 reingekweekte kolonie. Bebroed gedurende 24 h bij 30 C. Reageer vervolgens op nitraatreductie. Voeg daartoe per buis 0,2 ml tot 0,5 ml volledig nitrietreagens (4.10.3) toe. Vorming van een rode kleur binnen 15 min wijst op aanwezigheid van nitriet, dus op nitraatreductie. Voeg wanneer deze kleur niet wordt gevormd, een weinig zinkpoeder (4.11) toe. Vindt dan na 10 min geen roodkleuring plaats dan heeft toch nitraatreductie plaatsgehad. 7.6.3 Interpretatie B. cereus vergist glucose, vormt acetylmethylcarbinol en reduceert nitraat. 7.7 Blancobepaling Verricht voldoende blancobepalingen ter controle van de voedingsmedia, de verdunningsvloeistof en het glaswerk. waarin: N c is het gehalte aan B. cereus, in aantal kolonievormende eenheden per ml of per g; C is de som van de getelde karakteristieke kolonies; n 1 is het aantal petrischalen met de laagste verdunning waarin aantallen kolonies zijn verkregen die mogen worden geteld volgens 7.5; n 2 is het aantal petrischalen met de hierop volgende verdunning waarin aantallen kolonies zijn verkregen die mogen worden geteld volgens 7.5; f is het volume, in ml, of de massa, in g, van het onverdunde monster dat, eventueel na verdunning volgens NEN 6872, aanwezig is in de petrischaal met de laagste verdunning. Indien een concentratiestap is toegepast is f het volume, in ml, of de massa, in g, van het oorspronkelijke analysemonster dat/die overeenkomt met de hoeveelheid gesuspendeerd sediment in de petrischaal met de laagste verdunning. EN 1. De getalwaarde van f wordt vanouds aangeduid als de verdunningsfactor. : Bij een verdunningsfactor 10 2 wordt 10 2 g of 10 2 ml van het onverdunde monster in de petrischaal gebracht. 2. De laagste verdunning is de verdunning met het hoogste gehalte aan monstermateriaal. 3. Indien meer dan twee verdunningen beschikbaar zijn die mogen worden meegeteld, moet de formule worden gewijzigd. Voor drie verdunningen wordt deze: N c C n1 0,1 n 2 0,01 n 3 f waarin n 3 het aantal petrischalen is met de op n 2 volgende verdunning waarin aantallen kolonies zijn verkregen die mogen worden geteld volgens 7.5. 8.1.2 Rond de uitkomst af tot op twee significante cijfers. 8.1.3 Indien op alle petrischalen minder dan 10 kolonies van B. cereus zijn geteld, geef dan als gehalte op n/f met de toevoeging benaderd. Hierin is n het gemiddelde aantal kolonies van B. cereus in de petrischalen met de laagste verdunning en heeft f de waarde die overeenkomt met de laagste verdunning. 8.1.4 Indien op alle petrischalen met een middellijn van respectievelijk 9 cm en 14 cm in totaal meer dan 100 respectievelijk meer dan 200 duidelijk zichtbare kolonies voorkomen, geef dan als gehalte op n/f met de toevoeging benaderd. Hierin is n het gemiddelde van de geschatte aantallen kolonies van B. cereus in de petrischalen met de hoogste verdunning en heeft f de waarde die overeenkomt met de hoogste verdunning. 8.1.5 Het resultaat kan ook worden uitgedrukt in een getal tussen 1,0 en 9,9 vermenigvuldigd met 10 x ml 1 of 10 x g 1 waarin x de passende macht van 10 is.
Bestelformulier Stuur naar: NEN Standards Products & Services t.a.v. afdeling Klantenservice Antwoordnummer 10214 2600 WB Delft Ja, ik bestel NEN Standards Products & Services Postbus 5059 2600 GB Delft Vlinderweg 6 2623 AX Delft T (015) 2 690 390 F (015) 2 690 271 www.nen.nl/normshop ex. NEN 6875:1993-07 nl Melk en melkprodukten - Bepaling van het gehalte aan <em> Bacillus cereus</em> of aan sporen daarvan 24.20 Wilt u deze norm in PDF-formaat? Deze bestelt u eenvoudig via www.nen.nl/normshop Gratis e-mailnieuwsbrieven Wilt u op de hoogte blijven van de laatste ontwikkelingen op het gebied van normen, normalisatie en regelgeving? Neem dan een gratis abonnement op een van onze e-mailnieuwsbrieven. www.nen.nl/nieuwsbrieven Gegevens Bedrijf / Instelling T.a.v. O M O V E-mail Klantnummer NEN Uw ordernummer BTW nummer Postbus / Adres Postcode Plaats Telefoon Fax Factuuradres (indien dit afwijkt van bovenstaand adres) Postbus / Adres Postcode Plaats Datum Handtekening Retourneren Fax: (015) 2 690 271 E-mail: klantenservice@nen.nl Post: NEN Standards Products & Services, t.a.v. afdeling Klantenservice Antwoordnummer 10214, 2600 WB Delft (geen postzegel nodig). Voorwaarden De prijzen zijn geldig tot 31 december 2016, tenzij anders aangegeven. Alle prijzen zijn excl. btw, verzend- en handelingskosten en onder voorbehoud bij o.m. ISO- en IEC-normen. Bestelt u via de normshop een pdf, dan betaalt u geen handeling en verzendkosten. Meer informatie: telefoon (015) 2 690 391, dagelijks van 8.30 tot 17.00 uur. Wijzigingen en typefouten in teksten en prijsinformatie voorbehouden. U kunt onze algemene voorwaarden terugvinden op: www.nen.nl/leveringsvoorwaarden. Normalisatie: de wereld op één lijn. preview - 2016