Nederlandse samenvatting
Nederlandse samenvatting Nederlandse samenvatting Als de kat van huis is dan dansen de muizen, maar het feest wordt nog mooier als de voorbereiding al kan beginnen voor de kat vertrokken is De 24-uurs klok Het voorspellen van periodieke veranderingen in de omgeving is een belangrijke biologische eigenschap. We kunnen deze veranderingen voorspellen dankzij een inwendige, biologische representatie van de tijd van de dag. Daarvoor gebruiken we een inwendige klok. Een inwendige klok bestaande uit een oscillator die kan worden bijgesteld door tijdsinformatie van buitenaf en die deze tijd door geeft naar het lichaam. Bij zoogdieren werd de eerste 24-uurs klok ontdekt in de hersenen (in de suprachiasmatische kernen (SCN) in de hypothalamus). Deze klok stuurt de timing van spontane activiteit en in de fysiologie (bijv. spijsvertering en lichaamstemperatuur) en laat zich gelijkstellen door licht. Als we de oscillator in de SCN niet dagelijks de kans geven zich bij te laten stellen ( entraineren ) wijkt de oscillator iedere dag een klein beetje verder af van de echte tijd buiten. De cyclusduur of periode is dan ongeveer, niet precies 24 uur. Daarom spreekt men van een circadiane (circa = ongeveer, dies = dag) klok. Het signaal dat de externe fase doorgeeft aan de circadiane klok heet een Zeitgeber (tijdgever). Er zijn vele Zeitgebers zoals bijvoorbeeld licht, temperatuur en voedsel. De kern van het oscillator mechanisme in de SCN bestaat uit een handvol genen, hun RNA transcriptieproducten en de uit RNA-translatie resulterende eiwitten, die transcriptie remmen en zo een regulatielus vormen. De eiwitproducten van de genen Clock en Bmal1 vormen een dimeer die zorgt voor transcriptionele activatie (via binding aan het DNA) van genen zoals de Period en Cryptochrome genen en Vasopressine. De eiwitproducten PERIOD en CRYPTOCHROME vormen dimeren die de expressie van Bmal1 onderdrukken. Zodra de PERIOD/CRYPTOCHROME dimeer vervalt, komt de transcriptie van Bmal1 weer op gang en is de lus compleet. Deze oscillerende lus vinden we behalve in de SCN in alle lichaamscellen. Op veel plaatsen in het lichaam vormen deze cellen perifere klokken. Het eiwit vasopressine is geen onderdeel van de terugkoppeling in de oscillerende lus, maar wordt er wel ritmisch door aangestuurd en is dus één van de outputs van het mechanisme. Output van de SCN omvat zowel neuronale verbindingen naar andere hersenstructuren als chemische signalen. Die signalen landen in weefsels die andere processen aansturen zoals hormoon afgifte of activering van het organisme en in perifere klokken. De SCN ligt onder in de hersenen en bovenop het optisch chiasma, de kruising van de oogzenuwen, en krijgt daaruit directe informatie over licht in de ogen,de belangrijkste Zeitgeber. Inwendige klokken zijn niet tot zoogdieren (mensen, muizen en poezen) beperkt, maar worden in vrijwel alle organismen gevonden, uiteenlopend van eencellige blauwalgen, planten tot fruitvliegjes en zebravissen. 133
Oscillator systemen en ritmen De SCN bevat dus de door licht entraineerbare oscillator (LEO). Andere circadiane oscillatoren worden door andere Zeitgebers geëntraineerd, bijvoorbeeld de door voedsel entraineerbare oscillator (FEO). Als een muis of rat alleen op een vaste tijd toegang heeft tot voedsel overdag (wanneer ze normaal inactief zijn), gaan ze dit moment anticiperen met een grote activiteit vlak voor het voedsel beschikbaar komt. Deze activiteit wordt aangestuurd door de FEO. Het is nog onbekend waar deze FEO zich bevindt, maar de lever is er zeker bij betrokken. In de lever van knaagdieren tikt een oscillator, en gaat de transcriptie van dezelfde genen op en neer als in de SCN. Die oscillator past zijn fase aan aan die van de Zeitgeber voedsel. De oscillator in de lever is dus een goede kandidaat om de FEO te huisvesten, toch lijkt dit niet het geval: Een schema van twee dagelijkse maaltijden leidt bij een rat tot twee van die anticiperende activiteitspieken, maar slechts één anticiperende piek in de transcriptie van de oscillatorgenen in de lever. Naast circadiane ritmen kennen we infradiane ritmen met een periode langer dan 24 uur, bijvoorbeeld de menstruele cyclus van ongeveer 28 dagen of de jaarcyclus van winterslapers. Ultradiane ritmen hebben een periode veel korter dan 24 uur bijvoorbeeld de activiteitcyclus van de veldmuis (Microtus arvalis). De veldmuis heeft iedere 2-4 uur een korte episode van rondlopen en eten, zowel s nachts als overdag. De ultradiane activiteit van de veldmuis treedt op naast de circadiane organisatie van activiteit. Er is wel interferentie van beide ritmen. Het proefschrift richt zich op twee onderwerpen op het gebied van klok gereguleerde activiteit: de klassieke licht entraineerbare oscillator en de interacties van deze klok met andere klok systemen. Het neurale substraat van de licht entraineerbare oscillator (LEO) In de SCN van zoogdieren bevindt zich de oscillator die gedrag aanstuurt en entraineert aan de licht-donker Zeitgeber. In de SCN vinden we twee duidelijk onderscheidbare gebieden, elk met een karakteristieke neuropeptiden. In het ventro-laterale gedeelte van de SCN (vlscn), ook wel core genoemd, brengen neuronen vooral vasoactive intestinaal polypeptide tot expressie. Dit deel wordt gezien als de plaats in de SCN waar entrainment aan licht plaatsvindt. De dorso-mediale SCN (dmscn) brengt veel vasopressine tot expressie, wordt ook wel shell genoemd en wordt gezien als de plaats waar de output van de SCN zich bevindt. De verschillende functies van de vlscn en dmscn uiten zich o.a. in de expressie van het c-fos gen. c-fos expressie is een snelle marker voor transcriptionele activiteit in neuronen, een immediate early gene. Onderzoek aan muizen, ratten en hamsters laat zien dat in continu licht (LL), c-fos expressie vooral optreedt in de vlscn. In een licht-donker afwisseling met 12 uur licht en 12 uur donker (LD 12:12), wordt nadat het licht aan is gegaan maximale c-fos expressie waargenomen. Deze piek wordt toegeschreven aan de entrainering aan licht. Dit idee wordt gesteund door onderzoek in ratten waarin de pieken in vlscn c-fos expressie mee verschuiven met veranderende 134
Nederlandse samenvatting tijden waarop het licht aangaat in korte (LD 8:16) en lange dagen (LD 16:8). In continu donker (DD) zien we c-fos expressie in de dmscn, indicatief voor intrinsieke processen, mogelijk betrokken bij het aansturen van gedrag. In dit proefschrift is deze C-FOS expressie onderzocht in de vlscn en dmscn van de veldmuis (hoofdstuk 6). Omdat het dagelijks activiteitspatroon van de veldmuis zo anders is dan dat van ratten, muizen en hamsters, zou dit een effect kunnen hebben op entrainment van de SCN. Er blijkt in de dmscn een C-FOS piek op te treden in het midden van de inactieve fase zien onder LL en LD 12:12 omstandigheden. In de vlscn hebben we onderzocht of de piek in C-FOS expressie gekoppeld blijft aan het aangaan van het licht als we een gemiddelde (LD 12:12) en een lange (LD 16:8) dag vergelijken. De piek blijkt niet mee te schuiven met de dageraad (licht aan) bij de veldmuis. De belangrijkste conclusie hieruit is dat C-FOS niet alleen door licht gestimuleerd wordt maar dat ook de fase van de interne klok hierbij een rol speelt. De koppeling aan licht en donker is dus indirect. Het is moeilijk iets over de functionele significantie van zo n verschil te zeggen. De resultaten geven geen ondersteuning voor de hypothese dat in de LEO twee klokken actief zijn, één die de ochtend en één die de avond volgt. c-fos expressie in de dmscn is mogelijk gekoppeld aan de transcriptionele activiteit (mogelijk door de binding van CLOCK/BMAL1 dimeer) van vasopressine. Vasopressine is niet de enige en essentiële output voor het aansturen van activiteit: Brattleboro ratten hebben van nature geen functionele vasopressine, maar laten wel circadiane patronen in activiteit zien. Er zijn wel sterke verbanden tussen vasopressine en de aansturing van activiteit door de SCN in muizen en veldmuizen. In hoofdstuk 2 hebben we het vasopressine systeem onderzocht in de SCN van muizen die van nature voorkomen als dieren met een sterke en een zwakke organisatie van circadiane organisatie van activiteit. Het was bij deze dieren al vastgesteld dat deze variatie correleert met vasopressine aanwezigheid in de SCN. Het blijkt nu dat het verschil in vasopressine gehalte in de SCN niet terug te vinden is in de mate van transcriptie. De hoeveelheden mrna (transcriptie product) is gelijk tussen de verschillende muizen lijnen. Maar de afgifte van vasopressine in hersenplakjes in vitro (dus buiten het lichaam) verschilt wel. Muizen met een sterke circadiane organisatie van activiteit blijken minder vasopressine af te geven per neuron. Is dit een paradoxaal resultaat? Deze muizen zijn minder goed in het reageren op een lichtpuls, wat kan worden opgevat als een teken van een stringente pacemaker. In hoofdstuk 2 concluderen we dat niet de transcriptie van vasopressine, maar posttranscriptionele regulatie van vasopressine in de SCN van deze muizen correleert met circadiane organisatie van activiteit. De aansturing van gedrag door vasopressine kan verder worden beïnvloed door processen buiten de SCN. Zulke processen kunnen van groot belang zijn. In hoofdstuk 3 is de vasopressine afgifte onderzocht in de SCN van muizen waar het oscillator mechanisme niet functioneert. Muizen die mutant zijn in de Per1 en Per2 genen (Per dubbel mutanten) synchroniseren wel met de licht-donker cyclus, maar verliezen circadiane organisatie van gedrag onder DD. De moleculaire klok in de Per dubbel mutanten wordt verondersteld niet meer te functioneren. In vitro laat SCN weefsel van deze dieren echter nog steeds een piek in de vasopressine afgifte zien. Dit is opvallend 135
aangezien vasopressine transcriptie, zoals eerder gemeld, onder controle staat van de circadiane oscillator in de SCN. Verder onderzoek zal moeten aantonen waar de oorzaak ligt van de vasopressine piek. Is een deel van de oscillator nog steeds intact in Per dubbel mutanten, of ligt de aansturing van deze piek posttranscriptioneel? Ritmen die door voedsel worden geëntraineerd (FEO) Periodieke voedselbeschikbaarheid kan activiteit en perifere oscillatoren entraineren. Over deze voedsel entraineerbare ritmen en het substraat daarvan, de FEO, is minder bekend dan over de licht entraineerbare ritmen en de LEO. We weten dat de oscillator in de lever geëntraineerd kan worden door een ritmisch voedselaanbod. De moleculaire klok in de lever loopt wat achter op de klok in de SCN als er continu voedsel is. Impliceert een vaste faserelatie tussen SCN en lever dat de SCN betrokken is bij de voedselanticiperende activiteit? In ieder geval kan de activiteit van ratten vlak voor het voedsel komt onafhankelijk van de SCN plaats hebben, want ook bij ratten zonder SCN zien we deze voedsel anticiperende activiteit. Maar in afwezigheid van de SCN zien we geen oscillaties in de lever van ratten. De klok in de lever lijkt dus de tijd over te nemen van de SCN als er continu voedsel is. Bij een opgelegd maaltijdritme verandert de oscillator in de lever zijn fase in overeenstemming daarmee. Wat is nu precies de relatie tussen de LEO en de FEO? Is dit een ontkoppeling van de SCN en de lever onder invloed van voedselschema s? Er zijn wat haken en ogen aan die veronderstelling: zo eet een knaagdier onder constante voedselaanwezigheid op momenten dat zijn SCN dat dicteert. Is het de SCN, of de activiteit geassocieerd met eten die aan de lever zijn timing oplegt? In hoofdstuk 4 hebben we de oscillator in de lever van de veldmuis onderzocht. Hoewel de veldmuis een ultradiane eter is, laat de SCN heldere circadiane oscillaties zien van de klokgenexpressie. Als we de veldmuis toegang geven tot een loopwiel, wordt de circadiane organisatie van de activiteit versterkt. We onderzochten wat het effect hiervan op de oscillator in de lever is. In de lever van veldmuizen met de sterke ultradiane organisatie (geen loopwiel) zien we geen circadiane oscillatie in de expressie van klok genen in de lever. Bij sterke circadiane organisatie (wel loopwiel) wordt de oscillator in de lever circadiaan. Nog overtuigender wordt de circadiane oscillatie in de lever als we de dieren toegang tot voedsel voor acht uur per dag ontzeggen. Bij de veldmuis gaat ultradiaan eetgedrag dus samen met een circadiaan niet oscillerende klok in de lever. Veranderingen in het activiteitspatroon ten gevolge van aanwezigheid van een loopwiel of voedselaanwezigheid vertalen zich ook naar circadiane oscillaties in de lever. Met nadruk moeten we hier zeggen in de veldmuis, want toen we een huismuis een ultradiaan eetpatroon (en activiteits patroon) oplegden veranderde er niets aan de circadiane oscillaties in de leverklok van deze dieren. Hoe sterk is nu precies het effect van voedsel aanwezigheid op circadiane organisatie van activiteit? Wat gebeurt er als voedsel aanwezigheid en licht met elkaar in conflict komen? De door licht en voedsel geëntraineerde ritmen in gedrag en gen expressie worden, veronderstellen we, aangedreven vanuit verschillende oscillatoren (LEO en FEO). In de activiteit zien we zowel componenten aangedreven door de LEO (bijv. dag/nacht ritmen) als door de FEO (bijv. anticipatie van voedselaanwezigheid). In hoofdstuk 5 136
Nederlandse samenvatting hebben we twee experimenten uitgevoerd om de interactie van voedsel- en lichtgestuurde componenten in de activiteit van de veldmuis te onderzoeken. Ten eerste hebben we veldmuizen geëntraineerd aan een enkele lichtpuls van 30 minuten per dag en tegelijkertijd aan een dagelijkse episode van voedselafwezigheid, beginnend op het moment dat de dieren actief worden (dit is per definitie het begin van de subjectieve nacht ). Nadat de veldmuizen hieraan gewend waren, hebben we de lichtpuls 4 uur naar voren verschoven. In de helft van de gevallen hebben we de dagelijkse episode van voedselafwezigheid gelaten waar die was en voor de andere helft deze meeverschoven met het licht, om zo een competitie te creëren tussen de twee Zeitgebers. Bij dieren zonder loopwiel, verschuift de activiteit mee alleen als ook het voedselbeschikbaarheidschema verschuift met het licht, anders niet. Bij continu voedselaanbod verschuift de activiteit met het licht mee maar minder snel dan wanneer er ook verschuivende voedselonthouding is. We zien dus dat de Zeitgeber voedsel de Zeitgeber licht zowel kan tegenwerken of versterken, afhankelijk van of ze verschillende of de zelfde veranderingen ondergaan. Dieren met loopwiel reageren veel sterker op de verschuiving in het licht. Dat laat zich goed verklaren door de versterking van het circadiane activiteitsritme door het loopwiel. SCN entrainment is immers voornamelijk gevoelig voor de Zeitgeber licht. Als we in de activiteit deze component versterken, versterken we ook dat gedeelte van de activiteit dat reageert op de verschuiving in de lichtpuls. We zien hier dus eigenlijk de aansturing van activiteit door drie oscillator systemen (de LEO, de FEO en daarnaast het ultradiane systeem), een complex geheel. In het tweede gedeelte van hoofdstuk 5 wilden we de afzonderlijke gedragscomponenten die worden aangestuurd vanuit de verschillende oscillator systemen bestuderen. Om dit te bereiken hebben we gelijktijdig Zeitgebers aangeboden met verschillende perioden. We hebben de lichtpuls iedere 23½ uur aangeboden en iedere 25 uur het voer voor acht uur weggehaald. We zorgen er zo dus voor dat de LEO en de FEO iedere dag 1½ uur verder uit elkaar lopen. De activiteit vertoont in dit protocol twee componenten. Overduidelijk is een activiteitscomponent met een periode van 25 uur. Minder sterk aanwezig is een tweede component die niet de periode heeft van de licht cyclus, maar een periode die dicht in de buurt komt van 24 uur. Dit ritme van vrijwel 24 uur is een circadiaan ritme dat niet geëntraineerd is. Wellicht is de activiteitsregulatie bij de veldmuis sterker gericht op voedsel dan bij andere knaagdieren die tot noch toe gebruikt zijn in dit soort competitie experimenten. Dat hadden we eigenlijk ook wel kunnen verwachten van een dier dat letterlijk dag en nacht wakker wordt om te eten. Een multiple clock system Vele concepten in de chronobiologie zijn als eerste onderzocht in een systeem waar de SCN de heersende circadiane pacemaker was. Ondertussen kennen we vele oscillator systemen die gelijktijdig verschillende fases en perioden tot expressie brengen. In dit proefschrift is een aantal van deze systemen onderzocht hetzij op Zeitgebergevoeligheid (voedsel en licht) hetzij op periode (ultradiaan en circadiaan). Integratie van deze os- 137
cillator systemen zorgt voor grote complexiteit. In de ene situatie geven twee verschillende klokken dezelfde tijd aan, simpelweg omdat de periode en/of fase van hun Zeitgebers gelijk zijn, onder andere omstandigheden zijn de ritmen van dezelfde klokken niet te combineren. De koppelingen tussen alle klok systemen, hun Zeitgebers en output maken het in toenemende mate moeilijk klok systemen van elkaar te onderscheiden. Wat veroorzaakt de piek in vasopressine afgifte in de SCN als de moleculaire oscillator kapot is? Als c-fos expressie in de SCN niet meegaat met ochtend en avond, welk ritmisch proces geeft het dan wel weer? In welke richtingen lopen de causale connecties tussen loopwielaanwezigheid, ultradiane en circadiane ritmiek, voedselaanwezigheid en spontane eetmomenten? Wat is klokinput, wat is de Zeitgeber en wat is klokoutput? De interacties die in dit proefschrift aan bod zijn gekomen zijn samengevat in figuur 4 van hoofdstuk 7 om iets van de complexiteit te illustreren. Het belangrijkste hierin is de centrale rol die activiteit speelt in al deze interacties en systemen. Een centrale rol die we hier hebben kunnen bestuderen dankzij de gedragsverschillen tussen de veldmuis en de huismuis en dankzij de veelzijdigheid van gedragsmatige activiteit, die tegelijkertijd aangestuurd wordt door klok systemen, en fase en periode rapporteert aan andere systemen. 138