Screening van residuen van bestrijdingsmiddelen door time-of-flight analysatoren (ToF): Mythe of realiteit? Laure Joly en Vincent Hanot WIV-ISP, Juliette Wytsmanstraat 14, 15 Brussel Bericht aan de passagiers bestrijdingsmiddelen, u moet zich aanbieden aan het loket van de luchthaven Bijna 8 bestrijdingsmiddelen zijn momenteel door de Europese Unie geïnventariseerd. Momenteel is de triple quadrupole MRM-mode (Multiple Reaction Monitoring) met vloeistof- of gaschromatografie de analysator die doorgaans het meest gebruikt wordt om gelijktijdig naar verschillende honderden molecules te zoeken. Met dit toestel wordt elk potentieel bestrijdingsmiddel gevolgd via twee MRM-transities. Het aantal samen te analyseren bestrijdingsmiddelen neemt echter voortdurend toe en het aantal MRM-transities is jammer genoeg niet onbeperkt. Niettemin zijn er op dit ogenblik alternatieve oplossingen in ontwikkeling voor deze triple quadrupole analyses. Hieronder is de ToF (Time of Flight) analysator ongetwijfeld de meest ondersteunde en kan men een screening uitvoeren voorafgaand aan de kwantificering van de bestrijdingsmiddelen. Bovendien blijkt dat dit type massaspectrometrie perfect voldoet aan de nieuwe SANCO 12495/211 criteria [1]. Ten slotte, gezien de laatste ontwikkelingen van de constructeurs, blijkt dat het meer dan ooit tijd is dat onze bestrijdingsmiddelen zich naar de gate begeven om aan boord te gaan De time-of-flight analysator (ToF) maakt het mogelijk de verhouding massa/ionlading (m/z) van een ion af te leiden uit de tijd (t) die het nodig heeft om de flight tube te doorlopen en de detector te bereiken. Voordat de ionen de tube ingaan worden ze geaccelereerd dankzij een elektrische potentiaal (U) met een gekende waarde. De potentiële energie die op die manier opgeslagen wordt komt overeen met Ep = zeu, met e de elementaire lading. Eens in de tube (met lengte L) evolueren de ionen onder ultravacuümtoestand en wordt hun potentiële energie volledig omgezet in kinetische energie : Ec = 1/2mv 2, met v de snelheid van het ion Aangezien Ep = Ec en v = L/t, blijkt dat : m/z = t 2. Cste In de praktijk betekent dit dat een ion met een verhouding m/z gelijk aan er twee keer zo lang over doet om de flight tube te doorlopen dan een ion met een ratio m/z gelijk aan 25. Nu de theorie verwerkt is, is het tijd om 28
de geluidsmuur te doorbreken De opeenvolgende technologische vorderingen hebben de werking van de ToF radicaal veranderd. Eerst en vooral kon door het plaatsen van een reflectron (spiegel of elektrostatische reflector) het verschil in potentiële energie tussen ionen met dezelfde ratio m/z worden gecompenseerd door een verschillende trajectlengte binnen dezelfde reflectron, zodat ze samen op de detector toekomen. In tweede instantie het opstellen van de pusher. Aangezien de electrospray bron op ononderbroken wijze ionen opwekt, wordt het gevaarlijk om een referentietijd (t = ) te bepalen eigen aan elk ion en ter aanduiding van de invoering ervan in de buis. Om dit lastig probleem op te lossen, wordt vandaag de dag een pusher aangewend. Door toepassing van een orthogonale acceleratie van ionen kan dit onderdeeltje de ionen aan de ingang van de ToF bijeenbundelen. Bovendien kan dit ingenieus procedé eveneens de aanwezigheid van ongeladen deeltjes vermijden. Tenslotte ziet men erop toe dat een zeer lage druk (~5.1-11 bar) in de ToF wordt aangehouden en dit om elke fragmentering te vermijden die kan ontstaan doordat versnelde ionen en de omgeving met elkaar botsen. Reflectron Detector Pusher Source Figuur 1: Traject van ionen in een flight tube, de reflectron compenseert het verkregen energieverschil voordat ze de flight tube binnengaan: de blauwe en rode ionen met dezelfde massa komen op hetzelfde moment in de detector toe. 29
Vóór de take-off nemen we contact op met de controletoren Identificatie van bestrijdingsmiddelen is gedeeltelijk gebaseerd op de moleculaire massa in het geval van een ToF en niet op MRM ouder-fragment transities zoals het geval zou zijn met een triple quadrupool. Het is dus cruciaal de massa s nauwkeurig te meten wanneer een ToF analysator wordt gebruikt. Om zich ervan te verzekeren dat de gemeten massa zo dicht mogelijk bij de theoretische waarde ligt, worden gevoeligheid, nauwkeurigheid en resolutie als volgt geoptimaliseerd : In eerste instantie worden de werkingsparameters van de bron, van de transfer en van de ToF geoptimaliseerd met een component met een massa die gelijk is aan die van de te ontleden bestrijdingsmiddelen. In tweede instantie wordt een externe kalibratie uitgevoerd om een massa te krijgen die dicht bij de exacte massa op elk punt van het spectrum wordt gemeten. Dergelijke kalibraties worden dagelijks of wekelijks uitgevoerd naargelang het te onderzoeken nauwkeurigheidsniveau. Ten slotte wordt voortdurend een interne kalibratie uitgevoerd: een referentiecomponent of lock mass wordt in de bron geïntroduceerd samen met analyten en dit gedurende de hele analyse. Deze laatste fase maakt het mogelijk de variaties te doorbreken die na verloop van tijd zouden kunnen ontstaan (te wijten aan bijvoorbeeld temperatuursveranderingen). De vluchtomstandigheden lijken nu optimaal en we kunnen ons vluchtplan opstellen Eerst en vooral, rekening houdend met het feit dat er vooraf geen enkele selectie van massa gebeurd is door de ToF analysator, zijn alle ionen die binnen de bron gegenereerd zijn gelijktijdig opgespoord: de meeste opgespoorde ionen zijn die van de matrix. Het chromatogram verkregen voor een matrix van een mandarijn die geen enkel bestrijdingsmiddel bevat wordt weergegeven in figuur 2. Met een triple quadrupool worden dezelfde ionen gegenereerd in de bron, maar de analysator dient als filter en die ionen worden niet opgespoord. Logboek van de copiloot De resolutie is de capaciteit van de analysator om twee verwante verbindingen m/z te scheiden en wordt aangeduid door R=m/ δm. Het meten van de resolutie voor een ion dat van de massa (m) gescheiden is bestaat uit het meten van het massadefect (δm) op halve hoogte. De nauwkeurigheid betreffende de m/z meting van de geanalyseerde molecule geeft het vermogen weer om een massa zo dicht mogelijk bij de theoretische massa te benaderen. Deze meting moet precies en exact zijn. In de massa spectrometrie wordt de meetfout (die de nauwkeurigheid definieert) uitgedrukt ofwel in dalton (absolute waarde), fout (Da) = M exp - M th - ofwel in parts per million (relatieve waarde), fout (ppm) = M exp M th / M th * 1 6 3
2 4 6 8 1 12 14 Time (min) Figuur 2: Chromatogram van een matrix van mandarijn die geen enkel bestrijdingsmiddel bevat Ten slotte worden de bestrijdingsmiddelen geïdentificeerd waarbij men zich baseert op de hoge resolutie en de hoge massanauwkeurigheid van de ToF analysator. De gezochte massa is de monoïsotopische massa die overeenstemt met de eerste piek van het isotopisch profiel. Die piek houdt slechts rekening met de massa s van de meest stabiele isotopen (figuur 3). Ter vergelijking, met een triple quadrupool zijn de gemiddelde ionenmassa s de gezochte massa s. Figuur 3: in het zwart de gemiddelde theoretische massa van cyprodinil en in het paars de theoretische monoïsotopische massa Monoisotopic mass 226.1344 Average mass 226.2969 22 225 23 m/z 31
Na deze beschouwingen, is het tijd voor een proefvlucht Bij de analyse met een ToF vergelijkt een softwareprogramma de theoretische monoïsotopische massa s (M th ) van elk bestrijdingsmiddel met verschillende massa s van het massaspectrum (M exp ). Een tolerantie van 5 à 1 ppm wordt over het algemeen aanvaard. Aan de hand van het totale chromatogram van een monster van mandarijn (figuur 4a), wordt de aanwezigheid van cyprodinil bevestigd met een chromatografische retentietijd van 8.38 min door het chromatogram dat overeenstemt met zijn theoretische monoïsotopische massa (226.1344) met een tolerantie van 1 ppm te filtreren (figuur 4b). a) 1: TOF MS ES+ BPI 1.2e5 2. 4. 6. 8. 1. 12. 14. 8.38 1: TOF MS ES+ 226.134 1PPM 1.42e3 b) 2. 4. 6. 8. 1. 12. 14. Time (min) Figuur 4: (a) chromatogram van een monster van mandarijn, (b) chromatogram van hetzelfde monster dat gefilterd is voor de massa 226.1344 (theoretische massa van cyprodinil) met een tolerantie van 1 ppm Het massaspectrum gekoppeld aan de retentietijd van 8.38 min wordt weergegeven in figuur 5a. De software om de ruis weg te filteren is zeer nuttig om een bestrijdingsmiddel te identificeren onder het zeer groot aantal massa s (figuur 5b). 32
SG211126-9 2184 (8.421) Cm (2153:2191) 4.78e4 1.19e4 a) 217.1115 SG211126-9 226.135 2184 (8.421) Cm (2152:2191-(2128:2151+2191:2217)) 3.284 b) m/z 2 4 6 8 m/z 2 4 6 8 Figuur 5: massaspectra gekoppeld aan de retentietijd van 8.38 min zonder (a) en met (b) aftrek van de ruis. Na deze geslaagde luchtdoop, is het tijd voor een langeafstandsvlucht Bij een screening worden honderden bestrijdingsmiddelen onderzocht: er wordt gepeild naar de gekende retentietijd/theoretische monoïsotopische massa van ieder bestrijdingsmiddel. De voorafgaande stappen worden honderden keren automatisch of halfautomatisch herhaald. De verschillende spanningen van de bron (capillair, conisch) en de transmissiespanningen van een ToF kunnen echter niet worden geïndividualiseerd. Immers, omgekeerd aan wat gebeurt met een triple quadrupool zijn met een ToF gemiddelde generieke vereisten voor alle bestrijdingsmiddelen van toepassing. Elke niet optimale spanning voor een gegeven bestrijdingsmiddel vermindert bijgevolg de kans dat die intact op de detector aankomt. Een gebrekkige spanning is voldoende om een bestrijdingsmiddel slecht te ioniseren, slecht te fragmenteren of niet door te geven. Een lichte massaverschuiving bij het kalibreren is ook voldoende om het bestrijdingsmiddel uit de tolerantiezone van 1 ppm te wippen. Die verschuivingen komen voor wanneer de intensiteit van het signaal te zwak is: de vorm van de piek is slecht gedefinieerd en de massanauwkeurigheid vermindert, maar ook wanneer het signaal te intens is. Verzadiging van de detector leidt tot een vervorming van de piek en er vindt een verschuiving van de massa plaats. Een kalibratieverlies na verloop van tijd of een kortstondige verblinding van de detector door een zeer intense piek van de matrix kunnen eveneens leiden tot problemen met massanauwkeurigheid. De matrices waarin de bestrijdingsmiddelen worden onderzocht zijn zeer gevarieerd en beïnvloeden elk op hun manier de ionisatie, de transmissie en de opsporing van bestrijdingsmiddelen: een drastisch verlies van gevoeligheid kan worden opgemerkt met een bijzondere matrix voor een gegeven bestrijdingsmiddel zonder dat de vorige analyses in andere matrices een dergelijk probleem konden doen vermoeden. De snelheid van de scan beïnvloedt eveneens de gevoeligheid: hoe trager, hoe hoger de gevoeligheid van het toestel, maar daartegenover vermindert het aantal punten per piek. Dit treft de deconvolutie software en dus ook de massanauwkeurigheid. De verschillende constructeurs stellen alles in het werk om tegelijk de gevoeligheid, de resolutie en de nauwkeurigheid op de nieuwe generatie ToF te verbeteren. Maar het kritisch oog van de analist is nog altijd nodig om vals positieve en vals negatieve resultaten met een ToF te vermijden. Een vals positief resultaat is op zich geen probleem omdat de bevestiging dit resultaat nietig kan verklaren, een vals negatief resultaat daarentegen heeft geen tweede kans. Dit is het einde van de reis, dus is het tijd 33
om zachtjes te landen Tot slot, de ToF is een zeer performant toestel gebaseerd op een eenvoudig principe: de tijd meten waarbinnen een ion een traject aflegt om de massa ervan te kennen. De hoge resolutie, de hoge nauwkeurigheid en de grote gevoeligheid van die toestellen maken het mogelijk om zich enkel te baseren op het meten van de monoïsotopische massa van het bestrijdingsmiddel om die te kunnen identificeren. Men moet daarentegen steeds kritisch blijven wat de resultaten betreft ten opzichte van alle moeilijkheden die bestrijdingsmiddelen met zich kunnen meebrengen in de extractie- en zuiveringsfase, bij de chromatografie en opsporing of bij de verwerking van de resultaten door de software. Gelukkig worden de voornaamste foutenbronnen (vals positieven en vals negatieven) tegengehouden door de verschillende waarschuwingen in de SANCO-criteria. De analist moet aantonen dat hij de detectielimiet (SDL, screening detection limit) van het bestrijdingsmiddel in minstens 95 van de monsters kan opsporen. Vandaag de dag gebruiken verschillende laboratoria op Europees vlak de ToF technologie om in routine screening analyses uit te voeren. Logboek [1] SANCO 12495/211 Method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in food and feed Laure.Joly@wiv-isp.be 34