Cover Page. Author: Quispel, W.T. Title: Langerhans cell histiocytosis : genetic and immunologic fingerprinting Issue Date:

Transcriptie

1 Cover Page The handle holds various files of this Leiden University dissertation Author: Quispel, W.T. Title: Langerhans cell histiocytosis : genetic and immunologic fingerprinting Issue Date:

2 CHAPTER SAMENVATTING

3

4 Het doel van dit proefschrift is om meer inzicht te krijgen in de ontstaanswijze van de zeldzame ziekte Langerhans Cel Histiocytose (LCH), die vooral bij kinderen voorkomt. Langerhans cellen (LCs) zijn samen met Dendritische cellen (DCs) de poortwachters van het immuunsysteem. Zij spelen een belangrijke rol bij de opsporing van virussen, bacteriën en (genetisch) afwijkende cellen. Plaatsen waar zij normaal patrouilleren zijn de epidermale laag van de huid, slijmvliezen, lymfklieren en longen. Vervolgens zetten deze cellen een adequate immuunrespons in gang door migratie naar de lymfklier. In tegenstelling tot normale weefsels waar slechts enkele LCs en DCs aanwezig zijn, wordt LCH gekenmerkt door weefsels met een abnormale ophoping van cellen die verwant zijn aan deze poortwachters. Alhoewel de naam LCH doet vermoeden dat deze ziekte wordt veroorzaakt wordt door LCs, blijkt uit recent onderzoek dat LCHcellen het meest lijken op een subtype DC. LCH laesies kunnen zich manifesteren in weefsels waar normaliter LCs en DCs verblijven maar wordt opmerkelijk genoeg ook in andere organen aangetroffen zoals beenmerg, botten, lymfeklieren, lever, milt, schildkier en delen van ons zenuwstelsel. De uitingsvormen van LCH zijn divers. Het varieert van één tot meerdere laesies in één orgaan systeem (singlesysteem LCH) die soms spontaan kunnen genezen tot een vorm waarbij meerdere essentiële orgaansystemen zijn aangetast (multisysteem LCH) die altijd chemotherapie behoeft. Multisysteem patiënten hebben het hoogste risico op overlijden en op verschijning van nieuwe LCH laesies (LCH reactivatie). Dit risico kan worden verminderd door een lange en intensieve vorm van chemotherapie. Het huidige internationale klinische onderzoek LCH-IV richt zich op de vraag of de uitkomst van multisysteem patiënten verder verbetert door een nog langere therapieduur van 24 in plaats van 12 maanden. Echter, deze langere therapieduur kan ook meer bijwerkingen veroorzaken. Om te voorkomen dat patiënten onnodig lang worden behandeld is het noodzakelijk om patiënten te identificeren die een hoog risico hebben om te reactiveren of om te overlijden. Op dit moment bepalen enkel de klinische symptomen óf een patiënt wordt behandeld, het type en de duur van de therapie. De cellulaire en serum biomarkers die geassocieerd zijn met slechte LCH uitkomst worden dus nog niet betrokken in deze beslissing. In dit proefschrift hebben wij een aantal biomarkers geïdentificeerd die het beloop van LCH kunnen voorpellen. Hiermee kan mogelijk voor een individuele patiënt bepaald worden of een lange of korte behandeling noodzakelijk is. Recentelijk zijn niet erfelijke, genetische afwijking in LCH-cellen aangetoond. Deze mutaties (BRAF, MAP2K1 en MAP3K1) zijn ook veelvuldig gevonden in verschillende soorten kanker. Hiernaast bevatten de laesies diverse componenten van het immuunsysteem. Het genetische en immunologische aandeel in de ontstaanswijze en invloed op het beloop van LCH van is tot nu toe nog onbekend. Daarom hebben we genetische (Hoofdstuk 2 en 6) en immunologische (Hoofdstuk 3-6) vingerafdrukken gemaakt van LCH laesies bij de eerste LCH manifestatie en vóór aanvang van behandeling. 145

5 DE GENETISCHE VINGERAFDRUK VAN LCH-CELLEN In ongeveer 65% van de LCH patiënten zijn BRAF V600E, MAP2K1 en MAP3K1 gemuteerde LCH-cellen gedetecteerd. Zij zijn eiwitten, kinases, die tot het Mitogen- Activated Protein kinases (MAPK) behoren. Normaal gesproken worden deze kinases alleen geactiveerd door verschillende soorten boodschappermoleculen, zoals chemokines, cytokines, groeifactoren of stressfactoren. Indien geactiveerd, leidt het tot verminderde celdood en verhoogde cellulaire overleving, deling en migratiecapaciteit. Door de mutaties wordt het MAPK-pad voortdurend geactiveerd wat ophoping van LCH-cellen kan veroorzaken. Eerder onderzoek heeft onverwachts aangetoond dat het MAPK-pad echter ook geactiveerd is in LCH-cellen die géén BRAF V600E mutatie hebben (BRAF wild type ). Dit zou kunnen betekenen dat er nog andere mutaties in LCH-cellen aanwezig zijn die de MAPK-pad activatie kunnen bewerkstelligen. In Hoofdstuk 2 hebben we samen met onze collega s uit het Dana Farber Cancer Institute in Boston gezocht naar additionele MAPK-activerende mutaties in LCH-cellen. Laesionale CD1a + LCH-cellen werden geïsoleerd uit ingevroren LCH biopten door middel van flowcytometrie-geleide sortering. Om de doorgaans niet-erfelijke mutaties, of wel somatische mutaties, in de LCH-cellen op te sporen is hun genetische materiaal (DNA) vergeleken met het erfelijke DNA van dezelfde patiënt dat geïsoleerd werd uit granulocyten of wangslijmvliescellen. De genetische vingerafdruk werd vergeleken met whole exome sequencing. Wij constateerden dat één patiënt van wie de LCH-cellen géén BRAF V600E mutatie hebben inderdaad een somatische mutatie in ARAF bevatten, een ander component van het MAPK-pad. De mutatie in het ARAF gen werd gedetecteerd op de plaats waar kinases geactiveerd worden. Door middel van functionele testen hebben wij aangetoond dat, net zoals mutaties in BRAF, MAP2K1 en MAP3K1, de aanwezigheid van de ARAF mutatie leidt tot constante intracellulaire kinase activering van het MAPK-pad. Dit kon worden afgeremd door de BRAF-inhibitor vemurafenib, die door de Amerikaanse Food and Drug Administration is goedgekeurd voor klinische toepassingen. Hoewel de huidige inclusiecriteria van internationale klinische onderzoeken niet toestaan dat patiënten zonder een BRAF V600E mutatie worden behandeld met deze inhibitor, biedt onze bevinding mogelijk nieuwe behandelopties voor deze categorie patiënten. 146

6 IMMUNOLOGISCHE VINGERAFDRUK VAN LCH LAESIES De CXCR4-CXCR12 as faciliteert de migratie van LCH-cellen en vergelijkbare cellen Een onbeantwoorde vraag in de ontstaanswijze van LCH is waarom en op welke manier de LCH-cellen in andere weefsels verschijnen dan waar normaliter de LCs verblijven. Conventionele LCs zijn in staat om vanuit weefsels naar de lymfeklieren te migreren. Nadat zij delen van de indringers hebben opgenomen verschijnen er onder invloed van cytokines een aantal receptoren, die vergelijkbaar zijn met antennes, op het oppervlakte van de LC. Met zijn receptoren signaleert de LC de aanwezigheid van chemokines op andere plaatsen in het lichaam. Door de aantrekkingskracht en binding van chemokines op de passende receptor migreert de LC richting de lymfeklier. Het chemokine-chemokine receptor paar CXCL12-CXCR4 speelt via de activatie van het MAPK-pad een sleutelrol in de overleving, proliferatie van cellen. Tevens induceert CXCL12-CXCR4 de migratie van LCs, andere immuun cellen en kanker cellen (metastasen). In Hoofdstuk 3 tonen wij aan dat CXCR4 op LCH-cellen betrokken is bij hun verspreiding naar weefsels die CXCL12 tot expressie brengen. Bij patiënten met actieve LCH zijn door ons LCH-gelijkende cellen gedetecteerd in perifeer bloed- en beenmergmonsters, wat nog niet eerder was aangetoond. Door deze cellen te isoleren en functioneel te testen demonstreerden wij ook een sleutelrol voor CXCR4 bij de migratie van deze LCH-gelijkende cellen naar CXCL12. Van klinisch belang is dat patiënten die initieel gediagnostiseerd werden met één enkele LCH laesie hadden een hogere kans om meerdere LCH laesies te ontwikkelen indien hun eerst gebiopteerde laesie CXCR4-positieve LCH-cellen bevatte. Deze observatie kwalificeert CXCR4 als een potentiele prognostische marker voor minder goede ziekte uitkomst. Pathofysiologisch zou dit verklaard kunnen worden doordat weefselgebonden LCH-cellen via CXCR4 expressie de capaciteit hebben te migreren naar weefsels die CXCL12 tot expressie brengen en daar enkele of meerdere LCH laesies te vormen. Aantrekking van diverse immuun cellen naar de LCH laesie Om een reguliere immuunrespons in gang te zetten, maakt de LC in de lymfeklier delen van de indringers kenbaar aan lymfocyten, een type witte bloedcel. Lymfocyten kunnen vervolgens op verschillende manieren naar de weefsels migreren en binnendringen. De meest gangbare manier is via gespecialiseerde bloedvaten (High endothelial Venules (HEVs)) en de expressie van diverse soorten chemoattractieve moleculen in de weefsels. HEVs en georganiseerde lymfocyten aggregaties worden ook vaak gezien in weefsels van niet-lymfeklier origine. Indien de aggregaten gelijke histologische karakteristieken vertonen als klassieke lymfklieren worden zij 147

7 geclassificeerd als tertiare lymfoide structuren (TLS). In LCH laesies worden naast LCHcellen met name T-lymfocyten ofwel T-cellen aangetroffen. Om te achterhalen hoe deze T-cellen de LCH laesies binnenkomen hebben we in Hoofdstuk 4 onderzocht of bovengenoemde T-cel attractieve elementen en TLS aanwezig zijn in LCH laesies. Deze elementen werden in ongeveer 20% van de LCH laesies gedetecteerd wat geassocieerd was met de aanwezigheid van een hoog aantal T-cellen. De LCH laesies bevatten in verschillende mate lymfocyten aggregatie, die in ten minste 8 van de 16 patiënten werden geclassificeerd als TLS. Hierbij was de hoogste mate van lymfocyten aggregatie, de lymfoid-folliculaire aggregaten, met name aanwezig bij patiënten met één enkele LCH laesie. Van klinisch belang is dat vóór de start van behandeling patiënten het laagste risico hadden om een nieuwe LCH laesie te ontwikkelen indien hun laesie lymfoidfolliculaire aggregatie bevatte. Pathofysiologisch valt dit mogelijk te verklaren doordat de combinatie van aanwezigheid van zowel TLS, HEVs en hoge aantallen T-cellen in met name solitaire LCH laesies zorgt dat het immuunsysteem in staat is om bij de eerste LCH manifestatie de laesie te beheersen en verspreiding van LCH-cellen te voorkomen. Activatie en remming van lokale T-cellen In de lymfeklier worden conventionele T-cellen (T-CONV) normaliter via meerdere (co-stimulatoire) interacties door de LC geactiveerd en opgeleid tot een bepaald subtype T-cel. Hierbij onderscheiden de T-cellen het door de LC gepresenteerde indringer-molecuul als lichaamseigen of lichaamsvreemd. Als de T-cellen in staat zijn geïnfecteerde of genetische veranderde cellen te elimineren worden zij cytotoxische T-cellen genoemd. Een ander subtype T-cel (T-helper cellen) reguleren verschillende immuunreacties door de uitscheiding van cytokinen waardoor diverse immuuncellen worden geactiveerd. Bij de T-helper cellen wordt een aparte subset onderscheden die regulator T-cellen (T-reg) worden genoemd. T-reg zijn in staat om immuunreacties te onderdrukken. Zij bewerkstelligen dit door de excretie van immunosuppressieve cytokinen en door cel-cel interacties waardoor de activatie en functie van de binnengekomen T-cellen en andere immuuncellen worden belemmerd. Lokaal in de LCH laesies worden mogelijk T-cel gemedieerde immuunreacties gestimuleerd. In Hoofdstuk 5 hebben wij onderzocht of en waardoor T-cellen in de laesies worden geactiveerd. De detectie van een scala aan T-cel activatiemarkers op T-CONV in de laesie duidt op de activatie van T-cellen. Geactiveerde T-CONV waren in de hoogste aantallen aanwezig als de laesies eiwitten en costimulatoire moleculen bevatten die de lokale activatie van T-cellen kunnen faciliteren. De aanwezigheid van geactiveerde T-cellen betekent echter niet automatisch dat zij als effector cellen functioneren tegen de LCH-cellen. Wij hebben namelijk in laesies ook cytokinen en costimulatoire moleculen waargenomen die juist T-reg inductie en daarmee T-CONV inhibitie bewerkstelligen. Elke laesie kon worden geclassificeerd volgens een 148

8 specifiek immunosuppressief cytokine profiel. T-reg waren in alle cytokine profielen aanwezig. Met name in laesies die costimulatoire LCH-cellen bevatten, die mogelijk T-reg kunnen induceren, werden gespecialiseerde T-reg gezien. Dit suggereert dat LCH-cellen in staat zijn om door de inductie van T-reg aan het immuunsysteem te ontsnappen. In deze studie werd geen verband aangetoond tussen een geactiveerde of immunosuppressieve laesies en specifieke LCH manifestatie of klinische uitkomst. Dit toont aan dat het niet zinvol is om een immunologische vingerafdruk voor deze specifieke elementen te maken. Het type 1 cytokine pad is functioneel in LCH patiënten Een andere en juist immuunreactie-bevorderende cytokine (Interferon-gamma (IFN-γ)) is essentieel in het activeren van T-cellen die als effector cellen functioneren tegen afwijkende cellen, zoals bijvoorbeeld LCH-cellen. IFN-γ speelt een sleutelrol in de activatie van het type 1 cytokine pad, wat zorgt voor de effectieve immuunreactie tegen lichaamsvreemde indringers. Tevens lijken patiënten met specifieke mutaties in het gen coderend voor IFN-γ Receptor 1 (ADIFNGR1 patiënten) klinisch op polyostotische LCH patiënten. Onderscheid tussen deze ziekten is belangrijk omdat LCH therapie schadelijk kan zijn voor ADIFNGR1 patiënten. In Hoofdstuk 6 hebben we onderzocht of LCH veroorzaakt wordt door een niet functioneel type 1 cytokine pad en of hiermee een onderscheid gemaakt kan worden tussen LCH en ADIFNGR1 patiënten. We tonen aan dat weefselkleuringen voor CD1a en belangrijke elementen van het type 1 cytokine pad deze ziekten niet onderscheiden. Geen van de genetisch geanalyseerde LCH patiënten toonde variaties in de meest voorkomende exonen van het IFN-γ Receptor 1 gen. Dit verklaart dat ten alle tijden in alle LCH patiënten een functioneel intacte IFN-γ signalering werd waargenomen. Dit in tegenstelling tot perifere mononucleaire bloedcellen van ADIFNGR1 patiënten die niet reageren op IFN-γ. Onze studie toont aan dat het functioneel testen van het type 1 cytokine pad simpel, snel en correct onderscheid maakt tussen LCH en ADIFNGR1 patiënten. Deze testen kunnen op ieder moment van het diagnostisch proces worden toegepast, zelfs nadat een LCH behandeling is gestart. CONCLUSIE EN HYPOTHESE Op basis van de resultaten beschreven in dit proefschrift en uit literatuur hebben wij een nieuwe LCH hypothese geformuleerd die geïllustreerd wordt in Figuur 1. De resultaten van het onderzoek beschreven in dit proefschrift ondersteunen het concept dat LCH laesies gezien moeten worden als een cocktail van genetisch afwijkende LCH-cellen die zich ophopen in weefsels met een immunologisch variabele omgeving. 14

9 Figuur 1. Hypothese van de ontstaanswijze van LCH (1) In ons voorgestelde hypothese worden LCH voorlopercellen geraakt door een mutatie in het beenmerg of perifere bloed. (2) Verschillende factoren in het serum faciliteren de differentiatie van voorlopercellen in cellen met LCH kenmerken. Het hoge niveau van het cytokine TNF in het serum verhoogt en stabiliseert de expressie van CXCR4 bij de LCH voorlopercellen (Hoofdstuk 3). (3) Vervolgens bewerkstelligt CXCR4 expressie hun capaciteit om te reageren en te migreren naar laesionaal geproduceerd CXCL12. (4) Door de lokale uitscheiding en/ of presentatie van CXCL12 door bloedvaten dringen deze cellen de laesie binnen. Samen met de aantrekking van LCH (voorloper) cellen, dringen lymfocyten en andere immuuncellen de weefsels binnen via vergelijkbare mechanismen of via HEVs (Hoofdstuk 4). (5) LCH-cel differentiatie kan ook in de laesies plaatsvinden onder de invloed van verschillende cytokinen of groeifactoren (TGF-β, GM-CSF, Bone morphogenetic protein-7 of TNF en IL-4) (Hoofdstuk 5). In de laesies hebben de LCH-cellen interactie met deze immuuncellen. (6) Als lymfocyten aggregaties aanwezig zijn, faciliteren zij de influx, opvoeding en activatie van T-cellen. Dit leidt tot een immuunrespons waardoor de ophoping en verspreiding van LCHcellen wordt geremd en LCH tot één laesie beperkt blijft (Hoofdstuk 4 en 5). Dit wordt ook ondersteund door de aanwezigheid van IFN-γ-producerende T-cellen in de laesies (Hoofdstuk 6). (7) In tegenstelling tot deze mogelijke immuunreactie tegen de LCH-cellen, kunnen de LCH-cellen blijkbaar efficiënt accumuleren door de activatie van het MAPK-pad. Deze activatie wordt gefaciliteerd door de aanwezigheid van externe stimuli of somatische mutaties (Hoofdstuk 2 en 3). (8) Een immunosuppressief milieu kan de ontsnapping van LCH-cellen aan het immuunsysteem bewerkstellingen. () Na de verminderde expressie van LCH-gebonden adhesiemoleculen kunnen CXCR4 + LCH-cellen via bloedvaten naar de bloedstroom ontsnappen. Als circulerende LCH-gelijkende cellen of voorloper LCH-cellen via CXCR4 expressie naar CXCL12-positieve weefsels migreren kunnen zij daar nieuwe LCH laesies vormen. 150

10

11