SUMMARY Chapter 2 Chapter 3 Chapter 4

Transcriptie

1 APPENDIX

2

3 SUMMARY The overall aim of this thesis was to evaluate the clinical significance of magnetic resonance imaging and body fluid biomarkers for disease progression in multiple sclerosis (MS) with a focus on the earliest stage of the disease, i.e. in clinically isolated syndrome (CIS). The aim of Chapter 2 was to investigate regional brain iron levels in patients with CIS and relapsing remitting MS (RRMS) and to explore their relation with demographical, clinical, and conventional MRI parameters, including T2 lesion load, and normalized brain volumes. Increased iron deposition is supposed to play a role in the pathophysiology of MS. However, previous reports on iron deposition in MS were mainly based on visual analysis of signal reduction on T2-weighted images. R2* relaxometry allows to assess brain iron accumulation quantitatively. We thus used this method for brain iron quantitation. Thirty-two patients with CIS and 37 patients with RRMS underwent 3T MRI and we assessed R2* relaxation rates in deep gray matter structures (thalamus, caudate nuclei, putamen, pallidum, hippocampus, amygdale, and nucleus accumbens) and the brain-stem. Basal ganglia R2* rates correlated with increasing age (r = ; p < 0.01). RRMS patients had significantly higher basal ganglia iron levels compared to CIS (p < 0.05). By applying multivariate linear regression analysis, we identified the patients age, disease duration, and gray matter atrophy as independent predictors of putaminal iron deposition. It was concluded that quantitative assessment by R2* relaxometry indicates increased iron deposition in the basal ganglia of MS patients, which is associated with disease duration and brain atrophy. Assessment of brain iron levels using R2* relaxometry combined with long-term clinical and radiological follow-up appears suited to clarify if brain iron accumulation is implicated in MS pathology. In extension the above-mentioned study, in Chapter 3 we investigated brain iron levels using R2* relaxometry in a larger series of MS patients and compared R2* rates in defined cerebral structures between patients with different stages of the disease and age matched healthy controls (HC). Apart from detailed neurologic examination, patients also underwent neuropsychological testing to allow for a more comprehensive assessment of the clinical impact of increased brain iron deposition in MS. We analyzed 113 patients (35 CIS, 78 MS) and 35 HC with 3T MRI and iron levels in subcortical gray matter structures were assessed by automated, regional calculation of R2* rates. Patients underwent detailed clinical and neuropsychological examination. We found significantly increased basal ganglia iron deposition in MS compared to CIS (p < 0.001) and HC (p < 0.005). R2* rates were correlated with age (r = 0.5, p < 0.001), disease duration (r = 0.5, p < 0.001), the EDSS (r = 0.3, p < 0.005) and with z-values of mental processing speed (r = 0.3; p < 0.01). We then applied step-wise linear regression analysis to identify factors associated to R2* levels. Strongest independent predictor of BG R2* rates was gray matter atrophy (p < 0.001), followed by age (p < 0.001), and T2-lesion load (p < 0.005) in the final step. The model excluded the variables disease duration, EDSS, and z-values of mental processing speed. It was concluded that basal ganglia iron accumulation in MS occurs only with advancing disease and is related to the extent of morphologic brain damage, which argues for iron deposition as an epiphenomenon. The absence of increased iron levels in CIS patients indicates that iron accumulation does not precede the development of MS. In Chapter 4 we explored the extent of cognitive impairment and its relation to MRI metrics including MT imaging in patients with CIS compared to RRMS. Cognitive deficits can be 175

4 176 frequently observed in the course of MS and they are related to morphologic brain changes. However, up to now only little information existed on the extent of cognitive deficits in the earliest phase of the disease, e.g. in CIS. It was also unclear whether subtle structural changes as detected by MT imaging, was a biological correlate of impaired cognitive performance. We included 44 CIS and 80 RRMS patients. All patients underwent the Brief Repeatable Battery of Neuropsychological Tests (BRB-N) and a 3T MRI scan. We found comparable BRB-N subtest results in CIS and RRMS, with impaired mental processing speed being most prevalent in both groups (CIS 13.6%; RRMS 16.3%). Conversely, when using stepwise linear regression analyses to identify independent predictors for decreased mental processing speed, different results emerged comparing CIS and RRMS. While in RRMS, strongest predictors for decreased mental processing speed were normalized cortex volume (p < 0.001) followed by T2-lesion load (p < 0.05), in CIS cortical MT ratio was the only MRI parameter associated with decreased mental processing speed (p < 0.005). We could conclude that cognitive dysfunction is present already in CIS in a pattern similar to RRMS, with impaired mental processing speed being most prevalent. Structural changes within the cortex as detected by MT imaging could be an early biological correlate of impaired mental processing speed in CIS, while cortical atrophy and lesion load are the biological correlate in RRMS. In Chapter 5 we aimed to explore the epitope specificity of serum antibodies directed against the extracellular domain of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), a potential target antigen for autoreactive antibodies, in patients with RRMS. The second aim was to determine whether immunomodulatory treatment and/or clinical exacerbation influenced anti-mog peptide reactivites. We analyzed anti-mog peptide serum antibodies, including IgG, IgM and IgA immunoglobulin isotypes, in 28 RRMS patients before and after one year of immunomodulatory treatment. We found two immunodominant overlapping linear epitopes encompassing amino acid (aa)37 48 and aa Recently experienced clinical exacerbations were associated with a significantly increased frequency of positive immunoreactivity against MOG peptides. One year of immunomodulatory treatment had no significant impact on anti-mog peptide immunoreactivity. The study presented in Chapter 6 aimed to investigate the predictive value of serum anti-mog antibodies to indicate treatment response of acute MS relapses. We developed an ELISA test system for detection of serum IgG and IgM Abs directed against native refolded MOG. Serum samples were analyzed in remission before relapse (baseline), during acute relapse before corticoid treatment and 6 weeks after corticoid therapy. Upon corticoid treatment anti-mog IgG but not anti-mog IgM Ab levels were significantly reduced. Patients whose clinical symptoms completely remitted after an acute MS relapse had a significant increase of anti-mog IgM Ab levels comparing baseline and acute relapse values. It was concluded that measurement of anti-native MOG antibodies might be important for decisions in patients with acute relapses, in particular regarding either dose and/or duration of corticoid or escalating therapies. The aim of Chapter 7 was to validate the potential novel serum biomarker, secretogranin III (SGIII) fragment, as indicator for disease progression in MS. This candidate marker has recently been identified by a high-throughput MALDI-TOF-based mass spectrometry biomarker discovery study. We have analysed serum samples from 90 MS patients (RRMS n = 50, primary progressive (PPMS) n = 50) and 24 healthy volunteers (HC) served as controls. As detection antibody we used polyclonal anti sera obtained from rabbits previously immunized with the

5 SGIII peptide Cys-KPGGSQDKSLHNRELSAERPLNEQIAEAEED-A. All analyses were performed by Western Blot. Using a reference sample, the presence and intensity of the different bands were rated in a semi-quantitative and blinded manner. For quantitative analyses of Western Blot band intensities we used Odyssey infrared imaging software. We found several SGIII isoforms discriminating MS patients from controls, including Western Blot bands at 12 kd, 23 kd, 37 kd and 100 kd (p < 0.01). Compared to RRMS, patients with PPMS had significantly higher band intensities at 37 kd (p < 0.05). When correlating Western Blot results with clinical data we found that the band intensities of 37 kd correlated with physical disability (r=0.238, p<0.05). Higher band intensities at 23 kd and 100 kd were observed in untreated MS patients compared to those receiving immunomodulatory therapy (p < 0.05). From these first validation results we could conclude that specific isoforms of SGIII might be useful for MS subtyping, particularly to define PPMS and to monitor disease progression and treatment effects. In Chapter 8 we aimed to explore the value of CSF markers for axonal damage in patients with a CIS and their relation with accumulating tissue damage as indicated by MRI. CSF neurofilaments and N-acetylaspartatic acid (NAA) are among the most promising ones to indicate the extent of axonal loss. We thus assessed CSF levels of neurofilament heavy (NfH), neurofilament light (NfL) and NAA in 67 CIS patients and 18 controls with neurological diseases of non-inflammatory aetiology (NC). CIS patients also underwent a baseline MRI at 3T, including sequences for assessing T2 lesion load, and normalized regional and whole brain volumes and after one year a follow-up MRI was obtained in 28 of them. NfL (p < 0.001) and NfH (p = 0.05) levels were significantly increased compared to NC. We found a strong correlation of NfH (r = 0.713, p < 0.005) and NfL (r = 0.929, p < 0.001) levels with age in NC. This correlation was less strong in CIS for NfH (r = 0.325, p < 0.01) and absent for NfL levels. In CIS patients, NfH correlated with physical disability (r = 0.304, p < 0.05) and with brain volume loss over time (r = 0.518, p < 0.01) but not with the change in T2 lesion load. It was concluded that our findings provide evidence for increased neurofilaments present already in the earliest stage of MS. The association of NfH levels with physical disability and brain volume but not lesional changes supports the association of these markers with axonal damage. The aim of chapter 9 was to explore the value of CSF neural cell adhesion molecule (NCAM) as a biomarker for use in clinical practice in patients with CIS and MS. NCAM plays a central role in neuronal repair and regeneration. In MS, reduced CSF NCAM levels have been observed and a continuous increase of CSF NCAM has been described in a limited number of acute MS patients who clinically improved after treatment. However, up to now it was unclear whether soluble NCAM correlates with clinical and MRI findings in CIS and MS. We therefore analyzed CSF NCAM in 85 patients (CIS n = 66; MS n = 19). Patients underwent detailed clinical examination and 3T MRI. In 32 patients a follow-up MRI was performed after an average one year. CSF samples from 17 patients with other neurological diseases served as controls. No differences in CIS and MS compared to the controls were observed. We found significantly reduced CSF NCAM levels in MS compared to CIS (p = 0.05) and in clinically active compared to non-active patients (p < 0.05). Higher CSF NCAM levels correlated with tissue loss of whole brain, gray matter and cortex over time (r = , p < 0.05 p < 0.005). It was concluded that CSF NCAM is altered in MS dependent on disease stage and activity. CSF NCAM could increase upon regenerative processes, which however may limit brain tissue damage for only a short interval in view of the positive correlation of NCAM with long-term brain tissue loss. Indirectly, however, this could 177

6 178 be evidence for a more active disease process. Further studies are required to investigate the relation of CSF NCAM levels with modern MRI techniques, including magnetization transfer imaging for structural analyses. In conclusion the results of this thesis led to several new insights into the clinical significance of MRI and body fluid biomarkers for disease progression in MS, focusing on the earliest stage of the disease, i.e. in CIS. The use of non-conventional MRI techniques, such as R2* relaxometry for brain iron quantitation and MT imaging to quantitatively measure structural brain changes, enabled new possibilities to establish markers associated with MS disease progression. The relation of R2* relaxometry with tissue destruction suggests that this iron mapping technique may potentially be used as a marker for neurodegeneration in MS. Cortical MT imaging may be an early sign of structural tissue alterations related to impaired mental processing speed in CIS patients. Novel identified body fluid candidate biomarkers, including serum secretogranin III and NCAM, to indicate disease progression in a subset of MS patients are currently being validated in large MS cohorts. We demonstrated that serum antibodies against MOG peptides and native refolded MOG may indicate disease activity and progression in MS. However, recent studies indicate that antibodies directed against the native, membrane bound and glycosylated form of MOG are more relevant in children with acute disseminated encephalomyelitis. CSF neurofilaments are reliable markers to indicate the extent of axonal damage in CIS and MS and may thus be helpful to monitor clinical status and treatment efficacy in future studies. Ultimately, the results of the present thesis support the notion that combined approaches of biochemical and quantitative MRI measures together with improved clinical outcome measures in clinical and MRI follow-up settings might be fundamental to establish assessment tools for axonal damage and/or neuronal repair in the earliest phase of MS.

7 NEDERLANDSE SAMENVATTING Het doel van dit proefschrift was om de klinische nut te evalueren van een aantal biologische markers, gemeten met behulp van MRI en in lichaamsvloeistoffen, voor ziekteprogressie bij multiple sclerose, in het bijzonder in de eerste fase van de ziekte, i.e. in patiënten met een klinisch geïsoleerd syndroom (clinically isolated syndrome (CIS)). Het doel van Hoofdstuk 2 was om ijzerconcentraties te bepalen in verschillende hersengebieden van patiënten met CIS en relapsing remitting multiple sclerosis (RRMS), en deze de relatie van deze concentraties met demographische, klinische, en conventionele MRI uitkomstmaten, zoals T2 lesion load, en genormaliseerde hersenvolumes te onderzoeken. Verhoogde ijzerdepositie speelt waarschijnlijk een rol in de pathofysiologie van MS. Echter, eerdere studies naar ijzerdepositie in MS waren met name gebaseerd op visuele analyse van een afname in signaal op T2-gewogen beelden. R2* relaxometry is een methode waarbij de ijzerdepositie kwantitatief bepaald kan worden. We hebben deze methode gebruikt om ijzerconcentraties in de hersenen te quantificeren. In totaal 32 patiënten met CIS en 37 patiënten met RRMS ondergingen een 3T MRI scan en de R2* relaxatiesnelheden werd bepaald in diepe grijze stof-structuren (thalamus, caudate nuclei, putamen, pallidum, hippocampus, amygdala, en nucleus accumbens) en de hersenstam. Basale ganglia R2* relaxatiesnelheden correleerden met een toename in leeftijd (r = ; p < 0.01). RRMS patiënten hadden significant hogere basale ganglia ijzerconcentraties vergeleken met CIS (p < 0.05). Door multivariate lineaire regressie analyse toe te passen, zagen we dat leeftijd, ziekteduur, en grijze stof atrofie onafhankelijke voorspellers voor ijzerdepositie in de putamen waren. De conclusie was dat kwantitatieve evaluatie met behulp van R2* relaxometry een toename in ijzerdepositie in de basale ganglia in MS patiënten aantoont, wat correleert met de ziekteduur en mate van hersenatrofie. De bepaling van ijzerdepositie met behulp van R2* relaxometry in combinatie met lange termijn klinische en radiologische follow-up is een goede methode om te kijken of ijzerdepositie in de hersenen en rol speelt in de MS pathologie. Naar aanleiding van deze studie, hebben we in Hoofdstuk 3 de ijzerconcentraties in de hersenen in een grotere groep MS patiënten onderzocht met behulp van R2* relaxometry, en we hebben de R2* snelheden in specifieke hersenstructuren van patiënten in verschillende ziekte stadia bepaald en daarnaast in gezonde controlepersonen van dezelfde leeftijd. Naast een gedetaileerd neurologisch onderzoek, ondergingen de patiënten ook neuropsychologische tests zodat we de effecten van ijzerdepositie op klinische uitkomstmaten uitgebreider konden evalueren. We onderzochten 3T MRI scans van 113 patiënts (35 CIS, 78 MS) en 35 gezonde controles. De ijzerdepositie in subcorticale grijze stof-structuren werd geanalyseerd met behulp van een geautomatiseerde, regiospecifieke berekeningen van de R2* snelheid. Daarnaast werden er uitgebreide klinische en neuropsychologische uitkomsten verzameld van deze patiënten. We vonden significant verhoogde ijzerdepositie in de basale ganglia van RRMS patiënten vergeleken met CIS patiënten (p < 0.001) en gezonde controles (p < 0.005). R2* snelheden waren gecorreleerd aan leeftijd (r = 0.5, p < 0.001), ziekteduur (r = 0.5, p < 0.001), EDSS scores (r = 0.3, p < 0.005) en met Z-getransformeerde waarden voor cognitieve verwerkingssnelheid (r = 0.3; p < 0.01). Vervolgens hebben we stapsgewijze lineaire regressie analyse toegepast om risicofactoren te kunnen identificeren die geassocieerd waren met R2* levels. De sterkste onafhankelijke voorspeller van basale ganglia R2* snelheden was grijze stof atrofie (p < 0.001), gevolgd door leeftijd (p < 0.001), 179

8 180 en T2-lesie volume (p < 0.005). Het model excludeerde de volgende variabelen: ziekteduur, EDSS en Z-getransformeerde waarden voor cognitieve verwerkingssnelheid. De conclusie was dat ijzerdepositie in de basale ganglia alleen in latere fases van MS optreedt, en gerelateerd is aan de mate van structurele hersenschade, wat suggereert dat ijzer depositie een epifenomeen is in MS. Bovendien suggereert de afwezigheid van ijzerdepositie in patiënten met CIS ook dat ijzer accumulatie niet voorafgaat een de ontwikkeling van MS. In Hoofdstuk 4 hebben we de mate van cognitieve achteruitgang in relatie to MRI parameters, zoals magnetization transfer (MT) beeldvorming, vergeleken tussen patiënten met CIS en patiënten met RRMS. Cognitieve problemen worden frequent waargenomen in MS en ze zijn gerelateerd aan weefselveranderingen in de hersenen. Echter, tot nu toe was er maar beperkte informatie aanwezig over de mate van cognitieve achteruitgang in de vroegste fase van de ziekte, dus in CIS. Het was ook niet duidelijk of subtiele weefselveranderingen zoals waargenomen op MT imaging een biologische correlaat was van cognitieve dysfunctie. We hebben 44 CIS en 80 RRMS patiënten geïncludeerd. Alle patiënten ondergingen een korte neuropsychologische test, de Brief Repeatable Battery of Neuropsychological Tests (BRB-N) en een 3T MRI scan. We vonden vergelijkbare BRB-N subtest resultaten in CIS en RRMS patiënten, waarbij met name de cognitieve verwerkingssnelheid aangedaan was in beide groepen (CIS 13.6%; RRMS 16.3%). Echter, na toepassing van stapsgewijze lineaire regressie om onafhankelijke voorspellers van een verlaagde cognitieve verwerkingssnelheid vast te stellen, kwamen er andere resultaten aan het licht voor CIS en RRMS. Terwijl in RRMS het genormaliseerde cortex volume de sterkste voorspeller van cognitieve verwerkingssnelheid was (p < 0.001), en daarna T2-lesie volume (p < 0.05), was in CIS de corticale MT ratio de enige MRI-parameter die geassocieerd was met afgenomen cognitieve verwerkingssnelheid (p < 0.005). We concluderen daarom dat cognitieve achteruitgang al in CIS optreedt, met een vergelijkbaar patroon als in RRMS, waarbij een verlaagde cognitieve verwerkingssnelheid het meest vaak voorkwam. Structurele veranderingen in de cortex, zoals waargenomen kan worden met behulp van MT-imaging, kan een biologische substraat voor verlaagde verwerkingsnelheid zijn in CIS, terwijl corticale atrofie en lesie volume waarschijnlijk de biologische substraten voor afgenomen cognitieve verwerkingssnelheid in RRMS zijn. Het doel van Hoofdstuk 5 was om te bepalen tegen welke specifieke epitopen op het extracellulaire domein van myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) serum antilichamen in MS patiënten gericht zijn. Deze epitopen zijn mogelijk zeer belangrijk voor autoreactieve antilichamen in RRMS. Het secundaire doel was om te onderzoeken of immunomodulerende behandeling en klinische achteruitgang een invloed hadden op de reactiviteit van antilichamen in MS patienten tegen het MOG-peptide. We hebben hiervoor de reactiviteit van IgG, IgM en IgA immunoglobulines tegen verschillende anti-mog peptiden bepaald in serum van 28 RRMS patiënten voor en na een jaar behandeling met immunomodulerende therapie. We vonden twee overlappende, immunodominante, lineaire epitopen, te weten de aminozuursequenties en Recente klinische exacerbaties waren geassocieerd met een significant verhoogde frequentie van immunoreactiviteit tegen de MOG peptiden. Er was geen effect van een jaar lang durende immunomodulerende behandeling op de anti-mog peptide immunoreactiviteit. De studie die beschreven staat in Hoofstuk 6 had als doel de voorspellende waarde van serum anti-mog antilichamen voor behandelingseffect tijdens acute MS Schubs te onderzoeken. We hebben een ELISA assay ontwikkeld om serum IgG en IgM antilichamen die

9 gericht zijn tegen natief gevouwen MOG aan te tonen. Serum monsters werden onderzocht tijdens een remissie voorafgaand aan een Schub (baseline), voorafgaand aan een behandeling met corticosteroiden tijdens een acute Schub, en 6 weken na de behandeling. Anti-MOG IgG concentraties waren significant afgenomen na behandeling met coriticosteroiden, maar dat gold niet voor anti-mog IgM antilichaam concentraties. Patiënten bij wie de klinische symptomen volledig waren hersteld na een acute MS Schub hadden een significante toename in anti-mog IgM antilichaam concentraties ten opzichte van concentraties op baseline en tijdens de Schub. De conclusie was dat het meten van anti-natief MOG antilichamen van belang kan zijn voor klinische beslissingen tijdens acute Schubs, met name voor wat betreft de dosis en of duur van behandeling met corticosteroiden of een escalatie-therapie. Het doel van Hoofdstuk 7 was om een nieuwe serum biomarker, een fragment van secretogranine III (SGIII), te valideren als potentiële biomarker voor ziekteprogressie in MS. Deze nieuwe biomarker was recent geïdentificeerd in een studie van onze groep waarin MALDI-TOF- massa spectrometrie was toegepast om biomarkers te identificeren. We hebben serum monsters van 90 MS patiënten (RRMS, n = 50 and primary progressive (PPMS), n = 50) geanalyseerd en van 24 gezonde controles. Om het eiwit aan te tonen hebben we een polyklonaal antilichaam ontwikkeld door immunisatie van konijnen met het SGIII-specifieke peptide Cys-KP GGSQDKSLHNRELSAERPLNEQIAEAEED-A. Alle analyses zijn gedaan met behulp van Western Blot. De aanwezigheid en intensiteit van verschillende banden werd op een semi-kwantitatieve en geblindeerd geëvalueerd, en genormaliseerd met behulp van een referentiemonster. Voor de kwantificatie hebben Odyssey beeldverwerkings-software gebruikt. De resultaten lieten verschillende SGIII isovormen zien die verschillend tot expressie kwamen in MS patiënts en controles, met name was dat het geval voor de Western Blot banden met de massa van 12 kd, 23 kd, 37 kd en 100 kd (p < 0.01). Patiënten met PPMS hadden een significant sterkere intensiteit van de banden op 37 kd dan de patiënten met RRMS (p < 0.05). Correlatie van de Western Blot resultaten met klinische uitkomstmaten liet zien dat de intensiteit van de band op 37 kd correleerde met fysieke achteruitgang (r=0.238, p<0.05). MS patiënten die onbehandeld waren hadden een hogere intensiteit van de banden op 23 en 100 kd vergeleken met mensen die immunomodulerende therapie ontvangen (p < 0.05). Uit deze eerste validatie kunnen we concluderen dat specifieke isovormen van SGIII bruikbaar kunnen zijn om MS subtypes te onderscheiden, met name de PPMS en RRMS subtypen, en om ziekteprogressie en behandelingseffecten te monitoren. Het doel van Hoofdstuk 8 was om de waarde van een aantal mogelijke biomarkers voor axonale schade in liquor te bepalen in patiënten met CIS, en de relatie van deze markers met beschadiging van hersenweefsel, gemeten met behulp van MRI, te onderzoeken. De concentraties van neurofilamenten en N-acetyl aspartaat (NAA) in liquor zijn op dit moment de meest veelbelovende markers om de mate van axonale schade vast te stellen. Daarom hebben we de concentraties van de markers neurofilament zware isovorm (NfH), neurofilament lichte isovorm (NfL) en NAA in liquor geanalyseerd in 67 CIS patiënten en 18 controles met noninflammatoire neurologische aandoeningen (NC). De CIS patiënten ondergingen op baseline een MRI met een 3Tesla scanner, met daarnaast sequenties om het T2 lesie volume te analyseren. Bij 21 CIS patiënten was een jaar later het genormaliseerde regiospecifieke en totale hersenvolume nogmaals geanalyseerd. Concentraties van NfL (p < 0.001) en NfH (p = 0.05) levels waren significant verhoogd vergeleken met NC. We vonden een sterke correlatie tussen zowel NfH (r = 0.713, p < 181

10 ) als NfL concentraties (r = 0.929, p < 0.001) met leeftijd in de groep van NC. Deze correlatie was zwakker in CIS patiënten voor NfH (r = 0.325, p < 0.01) en afwezig voor NfL. NfH correleerde met fysieke achteruitgang (r = 0.304, p < 0.05) en met verlies van hersenvolume gedurende een jaar (r = 0.518, p < 0.01) in CIS patiënten, maar niet met de verandering in het totale T2 lesie volume. De conclusie was dat onze bevindingen bewijs leveren dat verhoging in concentraties van neurofilamenten reeds in de vroegste stadia van MS plaatsvinden. De correlatie van de NfH concentratie met klinische achteruitgang en afname in hersenvolume, maar niet met verandering in lesie volume ondersteunt het idee dat deze markers geassocieerd zijn aan axonale schade. Het doel van Hoofdstuk 9 was om te bepalen of de liquor concentraties van neural cell adhesion molecule (NCAM) als biomarker in de klinische praktijk kan dienen in patiënten met CIS en MS. NCAM speelt een centrale rol in neuronaal herstel en regeneratie. Verlaagde concentraties van NCAM in liquor waren waargenomen in een MS patiënten in een studie met een beperkt aantal MS patiënten, en een geleidelijke toename werd gezien in MS patiënten in een relapse die een klinische verbetering lieten zien na een immunomodulerende behandeling. Echter, tot nu toe was het onduidelijk of oplosbaar NCAM ook gecorreleerd was aan klinische en MRI uitkomstmaten in CIS en MS. Daarom hebben we NCAM concentraties geanalyseerd in liquor van 85 patiënten (CIS n = 66; MS n = 19). Patiënten ondergingen een gedetailleerd klinisch onderzoek en een 3T MRI scan. Een follow-up MRI scan na gemiddeld één jaar was verkregen van 32 patiënten. Liquor monsters van 17 patiënten met andere neurologische aandoeningen dienden als controles. De NCAM concentraties waren vergelijkbaar tussen CIS en MS patiënten samen ten opzichte van de controles. De resultaten lieten zien dat NCAM concentraties in liquor van RRMS patiënten significant lager waren dan in CIS patiënten (p = 0.05) en ook lager in patiënten met klinische exacerbatie (Schub) vergeleken met patiënten in een stabiele fase (p < 0.05). Hogere concentraties van NCAM in liquor correleerden met het totale weefselverlies in de hersenen, en in de grijze stof en de cortex, over een periode van een jaar (r = , p < 0.05 p < 0.005). De conclusie was dat NCAM is veranderd in liquor van MS patiënten afhankelijk van de fase en activiteit van de ziekte. NCAM concentraties kunnen toenemen tijdens regeneratie, wat waarschijnlijk alleen op korte termijn gunstige effecten op weefselverlies heeft, gezien de correlatie met weefselverlies op lange termijn. Echter, een verlaagde NCAM concentratie kan ook bewijs zijn voor een actiever ziektebeloop. Er zijn aanvullende studies nodig om de relatie tussen NCAM concentraties in liquor en moderne MRI uitkomstmaten te onderzoeken, zoals MTI of meer gedetailleerd analyses van de hersenstructuren. We concluderen dat de resultaten van dit proefschrift tot verschillende nieuwe inzichten hebben geleid voor de betekenis van biomarkers op MRI en in lichaamsvloeistoffen in MS, met name voor de vroegste fase van de ziekte, CIS. Het gebruik van onconventionele MRI-technieken, zoals R2* relaxometry om ijzer in hersenen te kwantificeren en MTI om hersenweefselschade vast te stellen, biedt nieuwe mogelijkheden om markers voor ziekte progressie te identificeren. De relatie R2* relaxometry met weefselschade suggereert dat deze ijzer detectiemethode potentieel gebruikt kan worden als marker voor neurodegeneratie in MS. Corticale MTI kan gebruikt worden om vroege weefselveranderingen die gerelateerd zijn aan verslaagde cognitieve verwerkingssnelheid te detecteren in patiënten met CIS. Nieuwe kandidaat biomarkers voor ziekteprogressie in lichaamsvloeistoffen, zoals secretogranin III, zullen verder gevalideerd moeten worden in grote MS cohorten. We

11 hebben laten zien dat serum antilichamen tegen MOG peptiden en natief gevouwen MOG een reflectie kunnen geven van ziekteactiviteit en progressie in MS. Echter, recente studies laten zien dat antilichamen tegen het natieve, membraangebonden en geglycosyleerd MOG relevanter zijn in kinderen met acute disseminated encephalomyelitis. Neurofilamenten in liquor zijn betrouwbare markers om de mate van axonale schade in CIS en MS aan te tonen en kunnen daarom waarde hebben om in toekomstige studies het klinische beloop en behandelingseffectiviteit vast te stellen. Tot slot ondersteunen de resultaten uit dit proefschrift het idee dat een gecombineerde aanpak, waarbij zowel biochemische en kwantitatieve MRI maten samen met verbeterde klinische uitkomstparameters gebruikt worden, een belangrijke stap vooruit vormt om axonale schade en neuronaal herstel vast te stellen in de vroegste fase van MS. 183

12

13 LIST OF ABBREVIATIONS APP amyloid precursor protein CD cluster of differentiation CI cognitive impairment CIS clinically isolated syndrome CNS central nervous system CSF cerebrospinal fluid EAE experimental autoimmune encephalomyelitis ELISA enzyme linked immunosorbent assay HC healthy controls MAG myelin associated glycoprotein MAP microtubule-associated protein MBP myelin basic protein MFC magnetic field correlation MHC major histocompatibility complex MOG myelin oligodendrocyte glycoprotein MRI magnetic resonance imaging MRS magnetic resonance spectroscopy MS multiple sclerosis MTI magnetization transfer imaging MTR magnetization transfer ratio NAA N- acetylaspartic acid NABT normal appearing brain tissue NAWM normal appearing white matter NCAM neural cell adhesion molecule Nf neurofilament NfH neurofilament heavy chain protein NfL neurofilament light chain protein NfM neurofilament intermediate chain protein NMO neuromyelitis optica PPMS primary progressive multiple sclerosis RRMS relapsing remitting multiple sclerosis SGIII secretogranin III SPMS secondary progressive multiple sclerosis SWI susceptibility-weighted imaging 185

14

15 LIST OF PUBLICATIONS Pichler A, Enzinger C, Fuchs S, Plecko-Startinig B, Gruber-Sedlmayr U, Linortner P, Langkammer C, Khalil M, Ebner F, Ropele S, Fazekas F Differences and similarities in the evolution of morphologic brain abnormalities between paediatric and adult-onset multiple sclerosis. Mult Scler. 2012; Epub ahead of print. Fazekas C, Khalil M, Enzinger C, Matzer F, Fuchs S, Fazekas F No impact of adult attachment and temperament on clinical variability in patients with clinically isolated syndrome and early multiple sclerosis. Clin Neurol Neurosurg. 2012; Epub ahead of print. Teunissen CE, Khalil M Neurofilaments as biomarkers in multiple sclerosis. Mult Scler. 2012; 18(5): Schmied MC, Zehetmayer S, Reindl M, Ehling R, Bajer-Kornek B, Leutmezer F, Zebenholzer K, Hotzy C, Lichtner P, Meitinger T, Wichmann HE, Illig T, Gieger C, Huber K, Khalil M, Fuchs S, Schmidt H, Auff E, Kristoferitsch W, Fazekas F, Berger T, Vass K, Zimprich A Replication study of multiple sclerosis (MS) susceptibility alleles and correlation of DNAvariants with disease features in a cohort of Austrian MS patients. Neurogenetics. 2012; 13(2): Enzinger C, Fuchs S, Pichler A, Wallner-Blazek M, Khalil M, Langkammer C, Ropele S, Fazekas F Predicting the severity of relapsing-remitting MS: The contribution of cross-sectional and short-term follow-up MRI data. Mult Scler. 2011; 17(6): Jehna M, Langkammer C, Wallner-Blazek M, Neuper C, Loitfelder M, Ropele S, Fuchs S, Khalil M, Pluta-Fuerst A, Fazekas F, Enzinger C Cognitively preserved MS patients demonstrate functional differences in processing neutral and emotional faces. Brain Imaging Behav. 2011; 5(4): Khalil M, Enzinger C, Langkammer C, Petrovic K, Loitfelder M, Tscherner M, Jehna M, Bachmaier G, Wallner-Blazek M, Ropele S, Schmidt R, Fuchs S, Fazekas F Cognitive impairment in relation to MRI metrics in patients with clinically isolated syndrome. Mult Scler. 2011; 17(2): Khalil M, Langkammer C, Ropele S, Petrovic K, Wallner-Blazek M, Loitfelder M, Jehna M, Bachmaier G, Schmidt R, Enzinger C, Fuchs S, Fazekas F Determinants of brain iron in multiple sclerosis: A quantitative 3T MRI study. Neurology. 2011; 77(18): Khalil M, Teunissen C, Langkammer C Iron and neurodegeneration in multiple sclerosis. Mult Scler Int. 2011; 2011:

16 Kincses Z, Ropele S, Jenkinson M, Khalil M, Petrovic K, Loitfelder M, Langkammer C, Aspeck E, Wallner-Blazek M, Fuchs S, Jehna M, Schmidt R, Vécsei L, Fazekas F, Enzinger C Lesion probability mapping to explain clinical deficits and cognitive performance in multiple sclerosis. Mult Scler. 2011; 17(6): Loitfelder M, Fazekas F, Petrovic K, Fuchs S, Ropele S, Wallner-Blazek M, Jehna M, Aspeck E, Khalil M, Schmidt R, Neuper C, Enzinger C Reorganization in cognitive networks with progression of multiple sclerosis: Insights from fmri. Neurology. 2011; 76(6): Ropele S, de Graaf W, Khalil M, Wattjes MP, Langkammer C, Rocca MA, Rovira A, Palace J, Barkhof F, Filippi M, Fazekas F MRI assessment of iron deposition in multiple sclerosis. J Magn Reson Imaging. 2011; 34(1): Rovaris M, Rocca MA, Barkhof F, Calabrese M, De Stefano N, Khalil M, Fazekas F, Fisniku L, Gallo P, Miller DH, Montalban X, Polman C, Rovira A, Sombekke MH, Sormani MP, Stromillo ML, Filippi M Relationship between brain MRI lesion load and short-term disease evolution in non-disabling MS: a large-scale, multicentre study. Mult Scler. 2011; 17(3): Teunissen C, Koel-Simmelink M, Pham T, Knol J, Khalil M, Trentini A, Killestein J, Nielsen J, Vrenken H, Popescu V, Dijkstra C, Jimenez C Identification of biomarkers for diagnosis and progression of MS by MALDI-TOF mass spectrometry. Mult Scler. 2011; 17(7): Mader S, Lutterotti A, Di Pauli F, Kuenz B, Schanda K, Aboul-Enein F, Khalil M, Storch MK, Jarius S, Kristoferitsch W, Berger T, Reindl M Patterns of Antibody Binding to Aquaporin-4 Isoforms in Neuromyelitis Optica. PLOS ONE. 2010; 5(5): e10455 Khalil M, Enzinger C, Langkammer C, Tscherner M, Wallner-Blazek M, Jehna M, Ropele S, Fuchs S, Fazekas F Quantitative assessment of brain iron by R(2)* relaxometry in patients with clinically isolated syndrome and relapsing-remitting multiple sclerosis. Mult Scler. 2009; 15(9): Khalil M, Enzinger C, Wallner-Blazek M, Scarpatetti M, Barth A, Horn S, Reiter G Epstein-Barr virus encephalitis presenting with a tumor-like lesion in an immunosuppressed transplant recipient. J Neurovirol. 2008; 14(6): Gneiss C, Tripp P, Ehling R, Khalil M, Lutterotti A, Egg R, Mayringer I, Künz B, Berger T, Reindl M, Deisenhammer F Interferon-beta antibodies have a higher affinity in patients with neutralizing antibodies compared to patients with non-neutralizing antibodies. J Neuroimmunol. 2006; 174(1-2):

17 Gneiss C, Tripp P, Reichartseder F, Egg R, Ehling R, Lutterotti A, Khalil M, Kuenz B, Mayringer I, Reindl M, Berger T, Deisenhammer F Differing immunogenic potentials of interferon beta preparations in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 2006; 12(6): Khalil M, Reindl M, Lutterotti A, Kuenz B, Ehling R, Gneiss C, Lackner P, Deisenhammer F, Berger T Epitope specificity of serum antibodies directed against the extracellular domain of myelin oligodendrocyte glycoprotein: Influence of relapses and immunomodulatory treatments. J Neuroimmunol. 2006; 174(1-2): Khalil M, Kuenz B, Lutterotti A, Ehling R, Gneiss C, Egg R, Mayringer I, Deisenhammer F, Reindl M, Berger T Levels of serum IgM antibody against native refolded MOG predict responsiveness to corticosteroids for treatment of acute multiple sclerosis relapses. Proceedings of the 8th International Congress of Neuroimmunology held in Nagoya, JAPAN OCT 15-19, 2006, International Proceedings MEDIMOND Lutterotti A, Kuenz B, Gredler V, Khalil M, Ehling R, Gneiss C, Egg R, Deisenhammer F, Berger T, Reindl M Increased serum levels of soluble CD14 indicate stable multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 2006; 181(1-2): Reindl M, Khalil M, Berger T Antibodies as biological markers for pathophysiological processes in MS. J Neuroimmunol. 2006; 180(1-2):50-62 Kuenz B, Lutterotti A, Khalil M, Ehling R, Gneiss C, Deisenhammer F, Reindl M, Berger T Plasma levels of soluble adhesion molecules specam-1, sp-selectin and se-selectin are associated with relapsing-remitting disease course of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 2005; 167(1-2): Ehling R, Lutterotti A, Wanschitz J, Khalil M, Gneiss C, Deisenhammer F, Reindl M, Berger T Increased frequencies of serum antibodies to neurofilament light in patients with primary chronic progressive multiple sclerosis. Mult Scler. 2004; 10(6): Gneiss C, Reindl M, Lutterotti A, Ehling R, Egg R, Khalil M, Berger T, Deisenhammer F Interferon-beta: the neutralizing antibody (NAb) titre predicts reversion to NAb negativity. Mult Scler. 2004; 10(5):

18

19 CURRICULUM VITAE Michael Khalil was born on February 12, 1974 in Innsbruck, Austria. He graduated from Innsbruck Medical University in During his studies his enthusiasm for neuroimmmunology was raised. From 2001 to 2003 he worked on his medical theses at the Clinical Department of Neurology, Innsbruck Medical University, (Promoter: Prof. Dr. Thomas Berger) with the title Anti-MOG and Anti-MBP antibody subclasses in multiple sclerosis patients during interferonbeta therapy. From 2003 to 2006 he worked as a post-doc in the Neuroimmunological Research Unit at Innsbruck Medical University under the supervision of Prof. Dr. Thomas Berger and Prof. Dr. Markus Reindl. In 2006 he started his residency at the Department of Neurology, University of Graz, Austria. Supervised by Prof. Dr. Franz Fazekas he focused his research on neuroimaging in multiple sclerosis. From 2010 to 2011 he worked as a post-doc at NUBIN, Department of Clinical Chemistry, VU University Medical Center Amsterdam, The Netherlands under the supervision of Dr. Charlotte Teunissen. He currently works as a medical doctor at the Department of Neurology, Medical University of Graz, Austria. 191

20

21 ACKNOWLEDGEMENT Foremost I would like to express my sincere gratitude to my promoters Marinus A. Blankenstein, Franz Fazekas and Charlotte E. Teunissen for the continuous support of my PhD thesis. Prof. Marinus A. Blankenstein. It was a great honour for me to work at your department and for having the opportunity to work in a group of highly experienced researches and to deepen my knowledge in the field of biomarker research. Your discussions and insightful comments were always a great help and inspiration for my work. Prof. Franz Fazekas. I wish to express my warm and sincere thanks for your continuous support, motivation, expertise, encouraging and personal guidance which has provided a good basis for the present thesis. It is a great pleasure and honour for me having the possibility to work in your research group. Dr. Charlotte E. Teunissen. Dear Charlotte, I warmly thank you for supervising my research projects at your laboratory, your detailed and constructive comments, and for your important support throughout this work. Besides my promoters, I would like to thank the reading committee Prof. F. Barkhof, Prof. T. Berger, Prof. C. Enzinger, Prof. C.D. Dijkstra, Dr. A. Petzold and Prof. C.H. Polman for the critical review of the thesis and insightful comments. I sincerely thank all patients for their willingness to participate in our studies. Only with your contribution we were able to perform this research. I wish to thank my dear lab fellows at VU Medical Center: Marleen Koel-Simmelink, Harry Twaalfhoven, Wesley Jongbloed and Hans Heijst thank you for your great advice in laboratory methods. Kees van Uffelen thanks for your help in transferring the samples. Marissa Vane, Alessandro Trentini, Sisi Durieux-Lu and Magda Grabowska thank you for your important help and efforts in analysing the samples. Dr. Axel Petzold. Dear Axel, thank for your knowledge and expertise and for the interesting and fruitful discussions, which were always encouraging and inspiring for me. Arjan Malekzadeh, Sandra Mulder, Dorine Wouters, Rob Verhuis, Marta Del Campo Milan, Nina Bakker, Argonde van Harten and Payam Behradkia it was a great pleasure to meet you and work with you at VUmc. I would also like to thank Jannie v/d Vegte and Magda Land from the administration as well as Reimer Faber. Special thanks also to the co-workers from the biobank. I wish to thank my dear co-workers at Medical University of Graz: Prof. Siegrid Fuchs. I sincerely thank you for your great support on clinical data and for your collaboration in the MS outpatient department. Prof. Christian Enzinger. Dear Christian, I warmly thank you for your continuous motivation and support and for your insightful comments on the research projects. Prof. Stefan Ropele. Dear Stefan, I am grateful to you for your support and advice on MRI techniques and analyses. Prof. Juan-Jose Archelos. I sincerely thank you for your collaboration on CSF studies. Prof. Reinhold Schmidt and Prof. Helena Schmidt. I sincerely thank you for your collaboration in the neurologic laboratory. 193

22 Dr. Gerhard Bachmaier. Thank you for your great support on data bank management and data analysis. Mirja Wallner-Blazek, Christian Langkammer, Katja Petrovic, Arthur Mader, Margit Jehna and Marisa Loitfelder. I wish to express my warm thanks for your enormous effort and support on data analysis. Alexander Pichler, Thomas Seifert-Held and Tadeja Urbanic Purkart thank you for your collaborations. I wish to thank all co-workers of the Neurologic Laboratory at Medical University of Graz with special thanks to Annemarie Ferstl-Rohrbacher, Kerstin Kröll, Roberta Bichler, Elfi Hofer and Anita Harb. I wish to thank my roommates Thomas Gattringer, Daniela Gebauer and Christoph Birkl for lively discussions. From Innsbruck Medical University I would like to thank: Prof. Thomas Berger. Dear Thomas, I wish to express my warm and sincere thanks for being my supervisor during my research fellow ship at Innsbruck Medical University and for promoting my medical thesis. Your knowledge, encouraging and guidance were always a great help for me. Prof. Markus Reindl. Dear Markus, I am grateful to you for being my supervisor at the Neuroimmunological Laboratory at Innsbruck Medical University. Your expertise, understanding and encouraging always were a great help for my work. Prof. Florian Deisenhammer. Dear Florian, I warmly thank you for your great support and advice on CSF research, which was always of great value for me. Rainer Ehling, Bettina Künz, Andreas Lutterotti, Claudia Gneiss, Harald Hegen, Simone Mader and Franziska Di Pauli, I wish to thank you for the great time when working together and for your collaborations. Ingrid Gstrein and Kathrin Schanda I warmly thank you for your advice on technical issues. Nadia Stefanova, Martina Hölzl, Karin Steinlechner, Viktoria Gredler, Susanne Glatzl, Elisabeth Krinzinger and Barbara Seebacher it was a great pleasure working with you at Innsbruck Medical University. My loving thanks are due to my Mom, my brother Andreas and my sister Lisi. I warmly thank my extended family, my father- and mother-in-law and my brothers-in-law. It is time to thank my beloved children Laura, Tabea and David. Words are not enough to express my loving thanks to my wife Ines. Without her encouragement and understanding it would have been impossible for me to finish this work. 194