Chapter 7 SUMMARY / SAMENVATTING

Transcriptie

1 Chapter7 153 Chapter7 SUMMARY/SAMENVATTING OUTLINE 1.Summary 2.Samenvatting

2 154 Chapter7 1.SUMMARY The function of the nervous system depends on the complex architecture and plasticity of its neuronal networks. During development, and to some extent in adult life in very discrete brain regions, neurons are created and integrated into thisnetwork.eachcellthatwillultimatelybecomeaneuronwasproducedbycell proliferation and given a neuronal identity by a process called neuronal differentiation.afterarrestincellproliferation,thedifferentiatingcellwillmigrate, elaborateatreelikemorphology,formsynapticconnectionsandacquiretheability toreceiveandsendelectricsignals.itisevidentthatthefinalneuronistheresultof intricateinteractionswithinthedifferentiatingcell,withothercellsandwiththeir products. However, detailed knowledge of the underlying molecular biology of neuronaldifferentiationisfarfromcomplete. NerveGrowthFactor(NGF)isknowntobeanimportantfactorthatdrives neuronaldifferentiation.toelucidatethemolecularactionsofngf,theratpc12 cell line in particular has been a suitable model. In response to NGF treatment, undifferentiated PC12 cells cease to proliferate and engage in neuronal differentiation. Presentation of NGF to the undifferentiated PC12 cell leads to bindingofngftothetransmembranetrkareceptor.subsequently,anumberof intracellular signaling cascades are activated, including the Extracellular signal RegulatedKinase1/2(ERK1/2)pathway.AfterminutesofNGFexposure,signaling oftheerk1/2andotherpathwaysinducethetranslationindependentexpression ofimmediateearlygenes(iegs).manyoftheseiegsaretranscriptionfactorsthat are heavily and transiently upregulated within 2 hours. Subsequently, a class of genesbecomesexpressed,whoseregulationistranslationdependent.thisclassis termed delayedresponse genes (DRGs). These DRGs represent the more typical constituents of neurons and respond after days of NGF treatment, rather than minutesorhours. Although a number of NGFresponsive genes with a function in neuronal differentiation has been described, the complexity of this process suggests that many more remain unknown. Therefore, the central goal of this thesis was to identify(chapter2and3)andanalyze(chapter4and5)genesimportantforngf inducedneuronaldifferentiationofns1pc12cells. In Chapter 2,a DNA microarray screening procedure was used to identify 5 new NGFresponsive IEGs: Cbp/p300interacting transactivator 2 (Cited2), Kruppellike factor4(klf4),vmafmusculoaponeuroticfibrosarcomaoncogenefamily,proteinf (Maff), Kruppellike factor 10 (Klf10 or Tieg) and Activating transcription factor 3 (Atf3). After stimulation of Ns1 PC12 cells with NGF for 15, 30, 60 and 120 minutes, a typical, transient induction of many known NGFresponsive IEGs was measuredusingdnamicroarrays.subsequently,theremaining27000measured expressionprofileswereanalyzedandyielded10candidateiegs,ofwhich5were

3 Chapter7 155 validated by qpcr. The NGFinduced expression of all 5 genes was shown to be mediatedbytheerk1/2andthepi3kpathway;tobeindependentoftranslation andtooccurinboththesubclonalns1pc12andtheparentalpc12cellline.these 5 transcription factors were not previously reported as NGFresponsive IEGs, however they had been identified as important regulators of cell differentiation and proliferation in other systems. The observations provide important new informationonthemolecularmechanismsunderlyingngfinduceddifferentiation ofns1pc12cells. InChapter3,aDNAmicroarraystudywasperformedthatcharacterizedtemporal and functional changes of the Ns1 PC12 cell transcriptome during 4 subsequent daysofngfinduceddifferentiation.analysisofthetranscriptionprofilesof1595 NGFregulatedgenesshowedalargediversityintranscriptionalregulationacross time. For the first time, this revealed in (Ns1) PC12 cells that NGFinduced differentiationisnotcharacterizedbyprogressiveupordownregulationofgenes, but rather represents a nonlinear transcriptional process. In addition, ontology analysis was performed to quantify which biological processes and molecular functions were specifically regulated by NGF in time. This analysis indicated that NGF typically regulates genes implicated in protein biosynthesis, intracellular signaling,cellstructure,chromatinpackagingandremodeling,intracellularprotein trafficking,mrnatranscriptionandcellcycleprocesses.inthischapter,itwasalso discussed how NGFresponsive genes may mediate transcriptional regulation duringdifferentiation.finally,amongthenewlydiscovered,highlyngfresponsive transcriptswasasplicevariantofthedoublecortinlikekinase(dclk)gene:dclk short. Therefore, the function of DCLKshort in neuronal differentiation and the mechanismsthatdetermineitsexpressionwerefurtherinvestigatedinns1pc12 cellsinchapter4and5. In Chapter 4, DCLKshort was identified to mediate NGFinduced neuritogenesis. While DCLKshort protein is found basally expressed in Ns1 PC12 cells, NGF treatment substantially increased the protein levels of DCLKshort. Moreover, serine30ofdclkshortappearedtobephosphorylatedbyerk1/2inresponseto NGF treatment. Although nuclear translocation of DCLKshort upon NGFdriven phosphorylation was hypothesized, this occurred to an insignificant degree. Also overexpression of DCLKshort (phospho)protein left expression of IEGs cfos and Egr1 unaffected. Therefore, an extracellular function for DCLKshort (phosphorylation) was investigated. Interestingly, DCLKshort colocalized with filamentousactiningrowthconesofextendingneurites.moreover,itsintracellular distribution was dependent on an intact actin cytoskeleton. Together this suggested a role for DCLKshort in NGFinduced neuritogenesis, possibly phosphorylationdependent. Indeed, overexpressed wild type or serine 30 phosphomutant DCLKshort had a different effect on the number of outgrowing neuritesandontheinductionofamarkerofneuriteoutgrowth,growthassociated Protein 43 (GAP43). A function of DCLKshort as a phosphoprotein regulating

4 156 Chapter7 cytoskeleton architecture is well in line with other proteins of the Doublecortin gene family and with the current understanding of how NGF induces neuritogenesis. In Chapter 5, the regulation of DCLKshort expression in Ns1 PC12 cells was addressed.dclkshortwasshowntobeupregulatedbyngfandforskolin(fsk).in line with previous in vivo studies, glucocorticoid receptor activation by Dexamethasone was able to partially suppress this induced upregulation in Ns1 PC12 cells. In general, FSK and NGF induce gene transcription through camp response elements (CREs), present in promoters of target genes. Although a predicted CRE was present in the DCLKshort promoter, DCLKshort was upregulatedlaterthan8hours.therefore,dclkshortwasassumedtobeadrg, displayingtranslationdependentupregulation.remarkably,bothbasaldclkshort expressionanditsupregulationweremediatedbythepredictedcre.thissuggests that this promoter element is occupied by different, stimulusdependent protein complexes with different transcriptional potencies. Together, DCLKshort expression is subject to presently unresolved, yet intriguing regulatory mechanisms.asacampresponsivetranscript,dclkshortregulationisinlinewith manyothertranscriptsimportantinneuronaldifferentiation. Inconclusion,thecombinedapproachofgenomewideexpressionprofilingandthe functional analysis of one selected transcript, i.e. DCLKshort, were fruitful in pursuitofabetterunderstandingofngfinduceddifferentiationofns1pc12cells. Thereby, these findings may contribute to a more general understanding of the molecularbiologyofneuronaldifferentiationandultimately,ofthefunctioningof thenervoussystem.

5 Chapter SAMENVATTING Het functioneren van het zenuwstelsel wordt bepaald door de complexe vormgeving en de plasticiteit van zijn neuronale netwerken. Tijdens de ontwikkeling, en tot op zekere hoogte in een enkel klein hersengebied ook bij volwassenheid, worden neuronen geproduceerd en gentegreerd in dit netwerk. Iedere cel die uiteindelijk een neuron wordt, is geproduceerd door celdeling en verwerft een neuronale identiteit door een proces dat neuronale differentiatie heet.nadebeëindigingvandeceldeling,zaldedifferentiërendecelmigreren,een boomachtige morfologie ontwikkelen, synaptische verbindingen vormen en het vermogen krijgen om elektrische signalen te ontvangen en te versturen. Het is duidelijkdathetuiteindelijkeneuronhetresultaatisvanverfijndeinteractiesinde celzelf,metanderecellenenmethunproducten.echter,preciezekennisvande onderliggende moleculaire biologie van neuronale differentiatie is tot op heden onvolledig. Nerve Growth Factor (NGF) is bekend als een belangrijke eiwit dat neuronale differentiatie aanstuurt. Om de moleculaire rol van NGF te begrijpen vormt de PC12 cellijn een interessant model. In reactie op NGFbehandeling stoppen PC12 cellenmetdelenenbeginnenzeaanneuronaledifferentiatie.deblootstellingvan NGF aan de PC12 cel leidt tot binding aan de transmembrane TrkAreceptor. Vervolgenswordteenaantalintracellulairesignaaltransductieketensgeactiveerd, waaronderdeextracellularsignalregulatedkinase1/2(erk1/2)pathway.binnen minuten induceert signaaloverdracht van de ERK 1/2 en andere pathways de translatieonafhankelijke expressie van immediateearly genes (IEG's). Veel van deze IEG's zijn transcriptiefactoren waarvan de expressie binnen een tijdsbestek vantweeuur,sterkentijdelijkwordtverhoogd.daarnawordteenklassegenen, waarvanderegulatietranslatieafhankelijkis,totexpressiegebracht:dedelayed response genes (DRG's). Deze DRG's vertegenwoordigen de meer kenmerkende eiwittenvanneuronenenreagereneerdernadagendannaminutenofurenvan NGFbehandeling. Hoewel een aantal NGFresponsieve genen met een functie tijdens neuronale differentie reeds beschreven is, suggereert de complexiteit van dit proces dat er nogveelbetrokkengenenonbekendzijn.daaromwasdecentraledoelstellingvan dit proefschrift om genen, met een belangrijke rol in NGFgenduceerde differentiatie van Ns1 PC12 cellen, te identificeren (Hoofdstuk 2 en 3) en te analyseren(hoofdstuk4en5). In Hoofdstuk 2 is een DNA microarrayscreening gebruikt om 5 nieuwe, NGF responsieve IEG's te identificeren: Cbp/p300interactingtransactivator2 (Cited2), Kruppellike factor 4 (Klf4), vmaf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family, protein F (Maff), Kruppellike factor 10 (Klf10 of Tieg) en Activating transcriptionfactor3(atf3).na15,30,60en120minutendurendestimulatievan

6 158 Chapter7 Ns1 PC12 cellen met NGF werd aan de hand van DNA microarrays de typische, tijdelijkeinductievanveelbekendeieg'sgemeten.vervolgenswerdendeoverige gemeten expressieprofielen geanalyseerd, hetgeen resulteerde in 10 kandidaat IEG's, waarvan er 5 met qpcr werden gevalideerd. Ook is bij dit onderzoekaangetoonddatdengfgenduceerdeexpressievanalle5genenviade ERK 1/2 en de PI3K pathway verliep; dat de opregulatie translatieonafhankelijk was en dat de opregulatie zowel in de subclonale Ns1 PC12 als in de PC12 moedercellijn plaatsvindt. Eerder werd nog niet gerapporteerd dat deze 5 transcriptiefactoren NGFresponsieve IEG's zijn, maar wel dat het belangrijke regulatoren zijn van celdifferentiatie en proliferatie in andere systemen. Deze observaties geven belangrijke, nieuwe informatie over de moleculaire mechanismenvanngfgenduceerdedifferentiatie. In Hoofdstuk 3 is een DNA microarraystudie verricht die de tijdsafhankelijke en functionele veranderingen van het Ns1 PC12 transcriptoom, gedurende 4 opeenvolgende dagen van NGFgenduceerde differentiatie, karakteriseert. De analyse van de expressieprofielen van 1595 NGFresponsieve genen toonde een grote variatie aan in transcriptionele regulatie in de tijd. Voor het eerst was hiermee in Ns1 PC12 cellen zichtbaar gemaakt dat NGFgenduceerde differentiatie niet tot uitsluitend een toenemende of afnemende genexpressie leidt, maar eerder een nonlineair verschijnsel is. Ook werd er een ontologie analyse uitgevoerd om te berekenen welke biologische processen en welke moleculairefunctiesspecifiekdoorngfindetijdwordengereguleerd.ditlietzien datngfregulatiewordtgekenmerktdoorhetbenvloedenvaneiwitbiosynthese, intracellulairesignaaltransductie,chromatinepakkingenherschikking,intracellulair eiwittransport, mrnatranscriptie en celcyclus processen. In dit hoofdstuk werd ook besproken hoe NGFresponsieve genen een rol kunnen spelen in transcriptionele regulatie tijdens differentiatie. Tot slot, onder de nieuw gedentificeerde en sterk NGFresponsieve transcripten bevond zich een splice variantvanhetdoublecortinlikekinase(dclk)gen:dclkshort.inhoofdstuk4en 5 zijn daarom in Ns1 PC12 cellen de functie van DCLKshort in neuronale differentiatieendemechanismendiedeexpressievanhetdclkshortgenbepalen verderonderzocht. In Hoofdstuk 4 werd beschreven dat DCLKshort eiwit een rol heeft in NGF genduceerdeneurietuitgroei.hoeweldclkshorteiwitreedsbasaalinns1pc12 cellen tot expressie komt, leidt NGFbehandeling tot een substantieel verdere verhoging van DCLKshort eiwitniveaus. Bovendien is gebleken dat NGF behandelingleidttotfosforyleringvanerk1/2serine30vandclkshort.hoewel de hypothese werd getoetst dat DCLKshort naar de celkern gaat door NGF gestimuleerde fosforylatie, bleek dit in verwaarloosbare mate te gebeuren. EvenminhadoverexpressievanDCLKshort(fosfo)eiwitgeeneffectopdeinductie van de IEG's cfos en Egr1. Daarom werd een rol van DCLKshort (fosforylering) buiten de celkern onderzocht. Opmerkelijk genoeg bevond DCLKshort zich op

7 Chapter7 159 dezelfdeplekalsfilamenteusactineindegroeiconusvanuitgroeiendeneurieten. BovendienwasdeverspreidingvanDCLKshortindecelafhankelijkvaneenintact actinecytoskelet.tezamensuggereerdeditdatdclkshorteenrolheeftinngf genduceerdeneurietuitgroei,diemogelijkafhankelijkisvanfosforylatie.inderdaad hadoverexpressievanwildtypeofserine30fosfomutantdclkshortverschillend effectophetaantaluitgroeiendeneurietenenopdeinductievaneenmarkervan neurietuitgroei,growthassociatedprotein43(gap43).eenrolvoordclkshortals een fosfoeiwit dat betrokken is bij de regulatie van het cytoskelet komt goed overeen met de gepostuleerde rol van andere eiwitten van de Doublecortin genfamilie.dezevondstisvanbelangvoorhetbegripvanneurietuitgroeidiedoor NGFgestimuleerdwordt. InHoofdstuk5werddeexpressievanDCLKshortinNs1PC12cellenbestudeerd. HetbleekdatDCLKshortexpressiewordtverhoogddoorNGFendoorForskoline (FSK).ActivatievandeglucocorticodreceptordoorDexamethasononderdruktedit gedeeltelijk,hetgeenovereenkomtmeteerdereinvivostudies.overhetalgemeen induceren NGF en FSK gentranscriptie door campresponselementen (CRE's) die zichbevindeninpromotersvanresponsievegenen.hoewelerzicheenvoorspelde CREbevondindeDCLKshortpromoter,vonddetoenameinDCLKshortexpressie laterdanna8uurplaats.daaromwerderaangenomendatdclkshorteendrgis endatdeze opregulatie dustranslatieafhankelijkis.opmerkelijkgenoegwasde basale expressie van DCLKshort én diens opregulatie afhankelijk van de voorspelde CRE. Dit suggereert dat dit promoterelement wordt bezet door verschillende, stimulusafhankelijke eiwitcomplexen met verschillend effecten op transcriptie. Samengevat blijkt dat DCLKshort expressie wordt bepaald door vooralsnog onopgeloste, maar intrigerende mechanismen. Het campresponsieve kenmerkvandedclkshortexpressievertoontovereenkomstmetderegulatievan veelanderetranscriptendiebelangrijkzijnvoorneuronaledifferentiatie. Concluderend,degecombineerdeaanpakvangenoombredeexpressiestudieende daaruitvoortvloeiendefunctioneleanalysevaneenenkelgeselecteerdtranscript, DCLKshort,heeftgeleidtoteenbeterbegripvanNGFgenduceerdedifferentiatie vanns1pc12cellen.hiermeekunnendezebevindingenbijdragentoteenbeter algemeen begrip van de moleculaire biologie van neuronale differentiatie en, uiteindelijk,vanhetfunctionerenvanhetzenuwstelsel.

8