Chapter 10. Summary & Samenvatting

Transcriptie

1 Chapter Summary & Samenvatting

2 164 Chapter Summary & Samenvatting 165 Summary The nuchal translucency (NT) is a small translucent area in the neck region of late first-trimester fetuses, which can be visualized ultrasonographically at weeks of gestation. It normally disappears after 14 weeks of gestation. Increased NT represents nuchal edema and is associated with chromosomal abnormalities. The NT measurement is incorporated in the first-trimester screening for trisomy 21, 18 and 13. In case of an increased NT with a normal karyotype, the risk of a cardiac defect is increased. Furthermore, increased NT seems to be associated with a variety of structural and genetic anomalies, but there is little evidence for these associations. Yet, the majority of euploid fetuses with increased NT has a healthy outcome. Although NT measurement is implemented worldwide in first-trimester screening for aneuploidy for over two decades, the pathophysiology of increased NT is still not understood. The two main theories to clarify an increased NT are cardiac failure and a disorder in lymphatic development. The hypothesis of cardiac failure as cause for increased NT has been based on the high frequency of cardiac defects in fetuses with increased NT and on the finding of abnormal ductus venosus flow velocity waveforms in fetuses with enlarged NT. Recent research has emphasized the involvement of abnormal lymphatic development in the origin of increased NT. This has been based on the abnormally enlarged jugular lymphatic sacs, which show a disturbance in venous-lymphatic differentiation in aneuploid fetuses with increased NT. The lymphatic system develops in the neck by budding and migration of lymphatic endothelial cells from the cardinal veins to form the jugular lymphatic sacs. In normal development, the jugular lymphatic sacs reorganize into lymphatic nodes after weeks of gestation. The thoracic duct then connects with the left jugular lymphatic sac, followed by the ingrowth of the thoracic duct into the internal jugular vein. This forms the main site of lymphatic drainage into the venous system. A delayed lymphatic development can result in an excess of lymphatic fluid in the neck region. With continued fetal development, the jugular lymphatic sacs remodel into lymph nodes and drain the excess of fluid in the neck region, thereby explaining both the temporary and regional nature of increased NT. The aim of this thesis was to study the involvement of abnormal jugular lymphatic development and cardiac disorders in euploid fetuses with normal and increased NT. Also, the morphology of the ductus venosus was investigated in normal development and in relationship to increased NT and cardiac defects. Chapter 1 provides an introduction on the NT and describes the outline of this thesis. In chapter 2 the underlying genetic mechanisms that explain the high incidence of cardiac anomalies in fetuses with increased NT are described. Fifteen candidate genes, involved in both abnormal cardiac and lymphatic development in mouse embryos, were identified. We found that alterations in 14 out of 15 identified candidate genes caused nuchal edema. A mutual

3 166 Chapter Summary & Samenvatting 167 denominator in the majority of the candidate genes was their expression in endothelial cells. Embryonic endothelial signalling is involved in various developmental systems, such as the formation of the heart, blood vasculature and lymphatic vasculature. Changes in these candidate genes thus affect the cardiac and lymphatic system, and may result in the formation of nuchal edema. We conclude that alterations in these candidate genes, encoding for endothelium, provide a genetic origin for the strong relationship between increased NT and cardiac anomalies. The jugular lymphatic sac has a close anatomical localisation to the cranial nerves. Aneuploid mouse embryos with nuchal edema show abnormally developed cranial nerves adjacent to the anomalously distended jugular lymphatic sacs. Nerves and endothelium share multiple developmental genes. In chapter 3 the involvement of neural crest cells, the cranial nerve progenitors, is investigated in lymphatic endothelial development in euploid mouse embryos. We found that neural crest cells are present in jugular lymphatic sacs. We also examined jugular lymphatic development upon blocking neural crest cell migration and differentiation by altering retinoic acid synthesis. Retinoic acid is essential for the differentiation and migration of neural crest cells and induces lymphatic endothelial cell differentiation. The disruption of neural crest cell development resulted in abnormal jugular lymphatic sacs and nuchal edema. We conclude that neural crest cell disturbances and lymphatic anomalies are involved in the pathophysiology of increased NT. This may explain a part of the fetal anomalies associated with increased NT, because cardiac defects, craniofacial anomalies and skeletal abnormalities are related to both increased NT and disturbed neural crest cell development. In chapter 4 the involvement of cardiac failure, secondary to a cardiac defect, and abnormal lymphatic development was investigated in increased NT. The nuchal region, jugular lymphatic development and cardiac anatomy were examined in various euploid mouse models with cardiac and lymphatic anomalies with and without nuchal edema. We found that the presence of nuchal edema consistently coincided with abnormalities of the jugular lymphatic sacs and developed independently of cardiac anatomy. All mouse models with normal NT showed a normal size of the jugular lymphatic sacs, irrespective of the presence of a cardiac defect. This demonstrates that abnormal jugular lymphatic development is involved in nuchal edema formation in euploid embryos. The fact that nuchal edema developed regardless of the presence of a cardiac defect, implies that nuchal edema can not solely be explained by cardiac failure, because of a cardiac defect. Prior studies have reported on the strong association between increased NT, cardiac defects and abnormal first-trimester ductus venosus flow velocity waveforms. It remains unknown whether abnormal ductus venosus flow velocity waveforms are a reflection of altered cardiac function or are caused by local morphological alterations in the ductus venosus. The existence of a ductus venosus sphincter that actively regulates blood flow to the fetal heart is still disputed. Chapter 5 describes the proposal of the use of a uniform anatomical definition for the ductus venosus. In chapter 6 we focus on the systematic examination of the morphological development of the ductus venosus in wild-type mouse and human embryos. We demonstrate the absence of a ductus venosus sphincter. This indicates that ductus venosus flow velocity waveforms are most likely a reflection of intracardiac pressure. In chapter 7 we examine the morphology of the ductus venosus in abnormal development, namely in multiple mutant mouse models with different cardiac and lymphatic defects, with and without nuchal edema. The morphology of the ductus venosus was comparable in all analysed mutant and control mouse models. We did not find a ductus venosus sphincter, similar to the wild type mouse embryos described in chapter 6. Ductus venosus morphology is thus not altered by cardiac and lymphatic defects or the presence of nuchal edema. We conclude that ductus venosus flow velocity waveforms most probably reflect intracardiac pressure in embryos with abnormal lymphatic and cardiac development, regardless of the presence of nuchal edema. In chapter 8 abnormal ductus venosus flow velocity waveforms and its relationship with cardiac and lymphatic defects and increased NT is further explored in late first-trimester human fetuses (n=5). Postmortem examination of the ductus venosus, heart and jugular lymphatic sacs in euploid and aneuploid human fetuses with normal and abnormal ductus venosus flow velocity waveforms and normal and increased NT was performed. All euploid and aneuploid fetuses showed similar ductus venosus morphology, independent of the presence of aneuploidy, cardiac defects or increased NT. All fetuses with increased NT showed abnormally developed jugular lymphatic sacs. We conclude the absence of an anatomical origin for abnormal ductus venosus flow velocity waveforms in late first-trimester human fetuses. We confirm the finding that ductus venosus flow velocity waveforms most probably reflect intracardiac pressure in human fetuses. We also confirm the involvement of abnormal jugular lymphatic development in the pathophysiology of increased NT in euploid and aneuploid human fetuses. This thesis ends with a general discussion of the results presented in this thesis and future perspectives in chapter 9. This thesis supports the contention that abnormal lymphatic development is a prominent factor in the etiology of increased NT. Disturbances in neural crest cell and endothelium are important denominators in the origin of increased NT. Cardiac failure, secondary to cardiac defects, can not cause increased NT alone. A second conclusion of this thesis is the absence of a sphincter at the ductus venosus inlet. Ductus venosus flow velocity waveforms are most probably a reflection of intracardiac pressure and are not caused by a local morphological alteration. Future research should focus on postmortem examination following ultrasound assessment of the nuchal region, heart and ductus venosus in large numbers of human fetuses with and without increased NT with different chromosomal abnormalities, cardiac defects, other structural malformations and genetic anomalies. Further investigation of neural crest cell disturbances should be explored in human fetuses with increased NT.

4 168 Chapter Summary & Samenvatting 169 Samenvatting De nuchal translucency (NT), ook wel nekplooi genoemd, is een kleine transsoniteit in de nekregio van de foetus in het eerste trimester van de zwangerschap, welke echoscopisch kan worden afgebeeld. Deze transsoniteit verdwijnt normaliter na 14 weken zwangerschapsduur. Een verdikte nekplooi bestaat uit oedeem en is geassocieerd met chromosomale afwijkingen. De echoscopische nekplooi meting is onderdeel van de eerste trimester screening voor trisomie 21, 18 en 13. Echter, een foetus met een verdikte nekplooi en normale chromosomen heeft een verhoogd risico op een hartafwijking. Een verdikte nekplooi lijkt verder geassocieerd te zijn met een scala van structurele en genetische afwijkingen. Hier is echter weinig wetenschappelijk bewijs voor. De meerderheid van de euploïde foetussen met een verdikte nekplooi heeft niettemin een normale uitkomst. Ondanks het wereldwijde gebruik van de nekplooi meting sinds meer dan twee decennia als eerste trimester screening voor chromosomale afwijkingen, is de oorzaak van de verdikte nekplooi nog onbekend. De twee belangrijkste theorieën om een verdikte nekplooi te verklaren zijn hartfalen en een abnormale lymfeontwikkeling. De hypothese van hartfalen als oorzaak van de verdikte nekplooi is gebaseerd op het voorkomen van meer hartafwijkingen en een veranderd doorstromingsprofiel van de ductus venosus bij foetussen met een verdikte nekplooi. Recent onderzoek heeft de betrokkenheid van abnormale lymfeontwikkeling als verklaring voor de verdikte nekplooi benadrukt. Dit is gebaseerd op de abnormaal vergrootte jugulaire lymfezakken, welke een verstoring in veneus-lymfatische differentiatie laten zien in aneuploïde foetussen met een verdikte nekplooi. De ontwikkeling van het lymfesysteem begint in de nek met de formatie van de jugulaire lymfezakken. De lymfezakken worden gevormd door een groep endotheelcellen die ontspringen vanuit de vena cardinalis en tot lymfe-endotheel differentiëren. De lymfezakken reorganiseren zich normaliter tot lymfeklieren vanaf weken zwangerschapsduur. De ductus thoracicus verbindt zich vervolgens met de linker lymfezak, gevolgd door de ingroei van de ductus thoracicus in de vena jugularis interna. Hierdoor vindt drainage van het lymfevocht naar het veneuze systeem plaats. Een vertraagde lymfeontwikkeling kan leiden tot een overvloed van lymfevocht in de nekregio. Met de voortgaande foetale ontwikkeling kunnen de jugulaire lymfezakken reorganiseren in lymfeklieren en kan de overvloed aan vocht in de nekregio wegstromen. Dit kan zowel het tijdelijke als ook het lokale karakter van de verdikte nekplooi verklaren. Het doel van dit proefschrift is om de betrokkenheid van de abnormale jugulaire lymfeontwikkeling en hartafwijkingen te bestuderen in euploïde foetussen met een normale en verdikte nekplooi. Tevens is de morfologie van de ductus venosus onderzocht in normale ontwikkeling en in relatie tot de verdikte nekplooi en hartafwijkingen. In hoofdstuk 1 wordt een introductie gegeven over de nekplooi en de opbouw van dit proefschrift wordt uiteengezet. In hoofdstuk 2 worden onderliggende genetische mechanismen beschreven die de hoge incidentie van hartafwijkingen bij foetussen met een verdikte nekplooi verklaren. Vijftien kandidaat genen zijn geïdentificeerd, welke betrokken zijn bij zowel de abnormale hart- als lymfeontwikkeling in muizen embryo s. Veranderingen in 14 van de 15 geïdentificeerde kandidaat genen veroorzaakte nekoedeem. Een gezamenlijke noemer in de meerderheid van de kandidaat genen was de expressie in endotheelcellen. Embryonale endotheel signalering is betrokken bij de ontwikkeling van verschillende systemen, zoals de vorming van het hart, de bloedvaten en de lymfevaten. Veranderingen in deze kandidaat genen beïnvloeden daarmee het hart- en lymfesysteem, wat mogelijk resulteert in de vorming van nekoedeem. Wij concluderen dat veranderingen in deze kandidaat genen, welke coderen voor endotheel, een genetisch origine weergeven voor de sterke relatie tussen de verdikte nekplooi en hartafwijkingen. De jugulaire lymfezak heeft een nauwe anatomische relatie met de craniale zenuwen. Aneuploïde muizen embryo s met nekoedeem laten abnormaal ontwikkelde craniale zenuwen zien, welke naast de afwijkend vergrootte jugulaire lymfezakken zijn gelegen. Zenuwcellen en endotheelcellen delen meerdere genen in hun ontwikkeling. In hoofdstuk 3 wordt de betrokkenheid van neurale lijstcellen, de voorlopers van craniale zenuwen, onderzocht in de ontwikkeling van lymfe-endotheel in euploïde muizen embryo s. Neurale lijstcellen waren aanwezig in de jugulaire lymfezakken. Wij onderzochten ook de ontwikkeling van de jugulaire lymfezak waarbij de migratie en differentiatie van de neurale lijstcellen werden geblokkeerd door veranderde retinolzuur synthese. Retinolzuur is essentieel voor de differentiatie en migratie van neurale lijstcellen en induceert differentiatie van lymfe-endotheel. Het verstoren van de ontwikkeling van de neurale lijstcellen resulteerde in abnormale jugulaire lymfezakken en nekoedeem. Wij concluderen dat neurale lijstcel verstoringen en lymfeafwijkingen betrokken zijn in de pathofysiologie van de verdikte nekplooi. Dit zou een deel van de foetale afwijkingen die geassocieerd zijn met een verdikte nekplooi kunnen verklaren, omdat hartafwijkingen, craniofaciale abnormaliteiten en skeletafwijkingen gerelateerd zijn aan zowel een verdikte nekplooi als aan een verstoorde ontwikkeling van neurale lijstcellen. In hoofdstuk 4 wordt de betrokkenheid van hartfalen, veroorzaakt door een hartafwijking, en abnormale lymfeontwikkeling onderzocht in de verdikte nekplooi. De nekregio, jugulaire lymfeontwikkeling en de anatomie van het hart zijn onderzocht in verschillende euploïde muismodellen met hart- en lymfeafwijkingen met en zonder nekoedeem. De aanwezigheid van nekoedeem was consistent met afwijkingen van de jugulaire lymfezakken, onafhankelijk van de anatomie van het hart. Alle muismodellen met een normale nekplooi lieten een normale grootte van de jugulaire lymfezakken zien, onafhankelijk van de aanwezigheid van een hartafwijking. Dit demonstreert dat abnormale jugulaire lymfeontwikkeling betrokken is bij de vorming van nekoedeem in euploïde embryo s. Het feit dat nekoedeem onafhankelijk van de aanwezigheid van een hartafwijking ontwikkelde, impliceert dat nekoedeem niet alleen verklaard kan worden door hartfalen, secundair aan een hartafwijking.

5 170 Chapter Summary & Samenvatting 171 Eerdere studies lieten een sterke associatie zien tussen een verdikte nekplooi, hartafwijkingen en afwijkende doorstromingen in de ductus venosus in het eerste trimester. Het is onbekend of afwijkende doorstromingen in de ductus venosus een reflectie zijn van veranderde hartfunctie of veroorzaakt wordt door lokale morfologische veranderingen in de ductus venosus. Het bestaan van een sfincter in de ductus venosus, die actief de doorbloeding naar het foetale hart reguleert, wordt nog betwist. Hoofdstuk 5 beschrijft het voorstel voor het gebruik van een uniforme anatomische definitie van de ductus venosus. In hoofdstuk 6 richten we ons op het systematische onderzoek van de morfologische ontwikkeling van de ductus venosus in wild-type muizen en humane embryo s. We demonstreren de afwezigheid van een sfincter in de ductus venosus. Dit indiceert dat ductus venosus doorstromingen meest waarschijnlijk een reflectie van intracardiale druk zijn. In hoofdstuk 7 onderzoeken we de morfologie van de ductus venosus in afwijkende ontwikkeling, namelijk in meerdere mutante muismodellen met verschillende hart- en lymfeafwijkingen, met en zonder nekoedeem. De morfologie van de ductus venosus was vergelijkbaar in alle geanalyseerde mutante en controle muismodellen. Een sfincter in de ductus venosus werd niet gevonden, gelijk aan de wild-type muizen embryo s die beschreven zijn in hoofdstuk 6. De morfologie van de ductus venosus is derhalve niet veranderd door hart- en lymfeafwijkingen of de aanwezigheid van nekoedeem. We concluderen dat doorstromingen in de ductus venosus meest waarschijnlijk intracardiale druk reflecteren in embryo s met afwijkende lymfe- en hartontwikkeling, onafhankelijk van de aanwezigheid van nekoedeem. In hoofdstuk 8 worden afwijkende doorstromingen in de ductus venosus en de relatie met hart- en lymfeafwijkingen en de verdikte nekplooi verder onderzocht in eerste trimester humane foetussen (n=5). Postmortem onderzoek van de ductus venosus, hart en jugulaire lymfezak werd verricht in euploïde en aneuploïde humane foetussen met normale en afwijkende doorstromingen in de ductus venosus en met een normale en verdikte nekplooi. Alle euploïde en aneuploïde foetussen toonden een vergelijkbare morfologie van de ductus venosus, onafhankelijk van de aanwezigheid van aneuploïdie, hartafwijkingen of een verdikte nekplooi. Alle foetussen met een verdikte nekplooi lieten een afwijkende ontwikkeling van de jugulaire lymfezak zien. We concluderen dat er geen anatomisch origine is voor afwijkende doorstromingen in de ductus venosus in eerste trimester humane foetussen. We bevestigen de bevinding dat doorstromingen in de ductus venosus meest waarschijnlijk een reflectie zijn van intracardiale druk in humane foetussen. We bevestigen ook de betrokkenheid van afwijkende jugulaire lymfeontwikkeling in de pathofysiologie van de verdikte nekplooi in euploïde en aneuploïde humane foetussen. Dit proefschrift eindigt met een algemene discussie van de gepresenteerde resultaten van dit proefschrift en toekomstperspectieven in hoofdstuk 9. Dit proefschrift onderschrijft dat afwijkende lymfeontwikkeling een prominente factor is in de etiologie van de verdikte nekplooi. Verstoringen in neurale lijstcellen en endotheelcellen zijn belangrijke noemers in de origine van de verdikte nekplooi. Hartfalen, secundair aan hartafwijkingen, kan als solitaire oorzaak geen verdikte nekplooi veroorzaken. Een tweede conclusie van dit proefschrift is de afwezigheid van een sfincter in de ductus venosus. Doorstromingen in de ductus venosus zijn meest waarschijnlijk een reflectie van intracardiale druk en worden niet veroorzaakt door lokale morfologische veranderingen. Toekomstig onderzoek dient zich te richten op postmortem onderzoek van grote aantallen humane foetussen met en zonder verdikte nekplooi met verschillende chromosomale abnormaliteiten, hartafwijkingen, andere structurele malformaties en genetische anomalieën, na het verrichten van echoscopisch onderzoek van de nekregio, hart en ductus venosus. Verder onderzoek naar neurale lijstcel verstoringen in humane foetussen met een verdikte nekplooi dient verricht te worden.