De invloed van azijnzuur op de groei van en ROCproductie door Penicillium roqueforti s.l.

Transcriptie

1 Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar De invloed van azijnzuur op de groei van en ROCproductie door Penicillium roqueforti s.l. Cedric Lefebvre Promotor: Prof. dr. ir. Geert Haesaert Tutor: Ir. Eva Wambacq Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de biowetenschappen: land- en tuinbouwkunde

2

3 Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar De invloed van azijnzuur op de groei van en ROCproductie door Penicillium roqueforti s.l. Cedric Lefebvre Promotor: Prof. dr. ir. Geert Haesaert Tutor: Ir. Eva Wambacq Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de biowetenschappen: land- en tuinbouwkunde

4 "De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie." "The author and the promotor give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis." Gent, juni 2014 De promotor De tutor De auteur Prof. Dr. Ir. Geert Haesaert Ir. Eva Wambacq Cedric Lefebvre

5 Woord vooraf Dit werk is het eindresultaat van mijn vierjarige opleiding voor het behalen van het diploma "Master of science in de bio-wetenschappen". Dankzij de in deze opleiding verworven kennis en de harde inspanningen van het laatste jaar kon ik deze thesis tot een goed einde brengen. Uiteraard was dit niet mogelijk zonder de hulp van heel wat mensen. Daarom had ik hierbij graag een woord van dank geplaatst. Allereerst wil ik mijn co-promoter Ir. Eva Wambacq van harte bedanken voor de uitstekende begeleiding bij het voltooien van deze thesis. Bij vragen of problemen was zij steeds bereid een oplossing aan te reiken. Ook een woord van dank aan mijn promotor Prof. Dr. Ir. Geert Haesaert die ondanks zijn drukke agenda toch de tijd kon vinden om mij bij te staan met raad en daad. Daarnaast wil ik alle docenten van de Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen aan Universiteit Gent bedanken voor de verkregen kennis tijdens deze opleiding. In het bijzonder Dr. Ir. Kris Audenaert voor het bijstaan in de statistische dataverwerking die nodig was voor dit eindwerk en de heer Tony Ruyssen voor het ter beschikking stellen van de nodige apparatuur voor flow cytometrie. Vervolgens had ik ook nog graag alle mensen die tewerkgesteld zijn op de Proefhoeve te Bottelare bedankt voor de aangename werkomgeving en hun hulp in het wegwijs maken van het labo. Ook de leden van de leescommissie zou ik graag bedanken voor hun interesse in dit onderwerp. Tot slot wil ik nog mijn familie en vrienden bedanken voor de steun tijdens het schrijven van deze thesis. Hierbij gaat een speciaal woord van dank uit naar mijn vriendin Sanne die me geholpen heeft met de grammaticale verbetering van de tekst. Ook mijn ouders wil ik bedanken om mij de mogelijkheid te bieden aan deze studies te kunnen deelnemen. Allen van harte bedankt! Cedric Lefebvre Juni, 2014

6 Samenvatting Sinds de jaren 1960 is het gebruik van het inkuilproces als een bewaarmethode voor groenvoeders sterk toegenomen in NW-Europa. Kuilvoeders vormen tot op heden een belangrijk onderdeel van het dierlijk productiesysteem. Het inkuilproces omvat een fermentatieproces waarbij melkzuurbacteriën een voorname rol spelen. Onder matige tot slechte bewaaromstandigheden kan er echter een contaminatie van het kuilvoeder optreden. Hierbij ontstaat een proliferatie van schimmels waarbij in bepaalde gevallen zelfs mycotoxinen kunnen geproduceerd worden. Vaak voorkomende schimmels in kuilvoeders zijn Penicillium roqueforti s.s. en Penicillium paneum, samen aangeduid als Penicillium roqueforti s.l.. Eén van de voornaamste mycotoxinen die deze schimmels kunnen produceren is roquefortine C, dat beschouwd wordt als een indicator voor mycotoxineproductie door P. roqueforti s.l. in kuilvoeders. Recent onderzoek gaf aanleiding tot het vermoeden dat P. roqueforti s.l. in staat is om azijnzuur te gebruiken als koolstofbron. In deze thesis werd dan ook verder onderzoek uitgevoerd naar de invloed van azijnzuur op de groei van en roquefortine C-productie door P. roqueforti s.l.. Hiervoor werd bij zeven verschillende media op drie verschillende tijdstippen de groei opgemeten van twaalf P. roqueforti s.l.-isolaten bij acht verschillende azijnzuurconcentraties en dit op zeven verschillende media. De azijnzuurconcentraties die bij elk medium getest werden, waren 0, 1, 3, 5, 7, 9, 12 en 15 ml azijnzuur per liter medium. De verschillende media die in dit onderzoek werden opgenomen omvatten een mineraal medium, PDB, CDYE-broth, een ingekuild en vers maïsmedium en een ingekuild en vers luzernemedium. Voor het PDB- en mineraal medium werd de test uitgevoerd bij twee temperaturen, namelijk 22 en 27 C; voor de overige media werd enkel een incubatie bij 22 C beschouwd. Daarnaast werd bij vier isolaten een kwalitatieve roquefortine C-bepaling uitgevoerd bij vier verschillende azijnzuurconcentraties op vier groeimedia. De vier geteste azijnzuurconcentraties waren 0, 1, 3 en 5 ml azijnzuur per liter en dit bij het CDYE- en mineraal medium en het ingekuilde maïs- en luzernemedium. Er werd geïncubeerd bij 22 C; bij het mineraal medium werd ook bij 27 C geïncubeerd. Uit de onderzoeksresultaten kan afgeleid worden dat P. roqueforti s.l. in staat is om te groeien bij azijnzuurconcentraties tot 5 ml per liter medium. Er werd geen significant hogere groeisnelheid geregistreerd van de schimmel op een medium met 1, 3 of 5 ml azijnzuur per liter medium in vergelijking met hetzelfde medium waaraan geen azijnzuur werd toegevoegd. Een azijnzuurconcentratie van 7 ml/l veroorzaakte in alle gevallen een significante afname van de groeisnelheid. Bij azijnzuurconcentraties hoger dan 7 ml/l werd slechts in beperkte mate nog groei waargenomen. Bovendien werden onder de geteste condities geen belangrijke

7 verschillen waargenomen in groeisnelheid tussen de twee onderzochte schimmelspecies. Tot slot kon bij het nagaan van de invloed van azijnzuur op de productie van roquefortine C enkel productie worden vastgesteld indien azijnzuur werd toegevoegd en indien een sterke groei mogelijk was. Kernwoorden: Penicillium paneum, Penicillium roqueforti s.s., kuilvoeder, roquefortine C

8 Abstract Since the 1960s, the use of ensiling as a method to preserve forage has increased considerably. Today, silages represent an important constituent of the animal production system. The ensiling process comprises a fermentation process in which lactic acid bacteria play a predominant role. However under poor storage conditions, contamination of the silage can occur. This leads to a proliferation of moulds, which can produce mycotoxins under certain conditions. Two very common fungal species in silage are Penicillium roqueforti s.s. and Penicillium paneum, together referred to as Penicillium roqueforti s.l.. One of the main mycotoxins which these fungi are capable of producing is roquefortine C, which is considered to be an indicator of mycotoxin production by P. roqueforti s.l. in silages. Recent research has indicated that P. roqueforti s.l. is able to use acetic acid as a carbon source. Therefore, additional research into the effect of acetic acid on the growth of and roquefortine C production by P. roqueforti s.l. was carried out. For this purpose the growth of twelve P. roqueforti s.l.-isolates on seven growth media at eight concentrations of acetic acid was measured at three different points in time on seven growth media. The acetic acid concentrations tested on each medium were 0, 1, 3, 5, 7, 9, 12 and 15 ml of acetic acid per liter. The various media that were included in this study were a mineral medium, PDB and CDYE medium, a fresh and ensiled maize medium and a fresh and ensiled alfalfa medium. The incubation temperature was 22 C, but for the PDB and mineral medium the test was also conducted at 27 C. In addition, a qualitative roquefortine C determination was conducted on four isolates at four acetic acid concentrations on four growth media. The four acetic acid concentrations tested were 0, 1, 3 and 5 ml of acetic acid per liter; the media used were the CDYE and mineral medium and the ensiled maize and alfalfa medium. Incubation temperature was again 22 C, but the mineral medium was also incubated at 27 C. The experimental results showed that P. roqueforti s.l. is able to grow at an acetic acid concentration up to 5 ml per liter medium. The growth rate of the moulds on medium without acetic acid added was not significantly higher compared to media with 1, 3 or 5 ml acetic acid added per liter. An acetic acid concentration of 7 ml/l caused in all cases a significant decrease of the growth rate. Acetic acid concentrations higher than 7 ml/l caused only in limited cases growth. In addition, no important differences were observed in growth rate between the two species examined. Finally, when examining the effect of acetic acid on the roquefortine C production, this mycotoxin could only be detected on those media to which acetic acid was added and which allowed strong growth. Keywords: Penicillium paneum, Penicillium roqueforti s.s., silage, roquefortine C

9 Inhoudsopgave 1 Literatuurstudie Kuilvoeder Het belang van kuilvoeder Het inkuilproces Oogsten Inkuilen Fermentatie Invloedsfactoren bij het inkuilproces Droge stof gehalte Wateroplosbare koolhydraten Buffercapaciteit Zuurstof Microflora betrokken bij het inkuilproces Melkzuurbacteriën Azijnzuurbacteriën Bacillen Clostridium spp Listeria Enterobacteriën Gisten Schimmels Kuiladditieven Bacterieculturen als inoculant Substraten Zuren Enzymen Nutriënten en secundaire groenvoeders als absorbentia Schimmels Veld- en bewaarschimmels Mycotoxinen in kuilvoeders Pre-harvestfactoren Pagina 1

10 Post-harvestfactoren Effect van het inkuilproces op de aanwezigheid van mycotoxinen De invloed van mycotoxinen op melkvee en hun productie Penicillium roqueforti s.l. als meest voorkomende schimmel in kuilvoeders Invloedsfactoren op de groei en ontwikkeling van P. roqueforti s.l P. roqueforti s.l. en zijn mycotoxines Mycofenolzuur PR-toxine Patuline Roquefortine C Factoren met een invloed op de productie en stabiliteit van roquefortine C Materiaal en methoden Gebruikte media en oplossingen Media Potato Dextrose Broth Mineraal medium Vers luzerne- en maïsmedium Ingekuild luzerne- en maïsmedium Czapex Dox Yeast Extract Broth Oplossingen Azijnzuuroplossingen Ehrlich reagens Gebruikte apparatuur Spectrofotometer (Oasys UVM340) Flow-cytometer (Cyflow Partec) ph-meter (Consort C831) Sporenoplossingen Bereiden van de sporenoplossingen Sporenconcentraties bepalen Proefopzet van de experimenten Chemische analyse van het uitgangsmateriaal Nagaan van de invloed van azijnzuur op de groei van Penicillium roqueforti s.l Nagaan van de invloed van azijnzuur op de productie van Roquefortine C Pagina 2

11 3 Resultaten ph-bepaling van de mediumoplossingen Vergelijking van de groeisnelheid per isolaat bij de verschillende azijnzuurconcentraties en op de verschillende media Penicillium roqueforti s.s Penicillium paneum Vergelijking van de groeisnelheden van P. roqueforti s.l. na incubatie bij 22 C of 27 C Vergelijking van de relatieve groeisnelheid per isolaat bij verschillende azijnzuurconcentraties op verschillende media De verschillen in groeisnelheid tussen de media bij éénzelfde azijnzuurconcentratie voor beide schimmelspecies De verschillen in groeisnelheid tussen de azijnzuurconcentraties binnen éénzelfde medium voor beide schimmelspecies De verschillen in groeisnelheid tussen de species binnen éénzelfde medium en bij éénzelfde azijnzuurconcentratie De invloed van de temperatuur op de groeisnelheid van P. paneum en P. roqueforti s.s Opvolging van de ROC-productie bij verschillende azijnzuurconcentraties en op verschillende media Discussie De invloed van azijnzuur op de groeisnelheid van P. roqueforti s.l De invloed van de temperatuur op de groeisnelheid van P. roqueforti s.l De opvolging van de ROC-productie onder invloed van verschillende azijnzuurconcentraties Algemeen besluit Referentielijst Pagina 3

12 Lijst met afkortingen AD: ATP: a w : AZ: CCM: CDYE: cfu: CYA: DON: DS: HeMZB: HoMZB: KH: LD50: LG: MEA m.o.: MPA MZB: PAT: PDA: RA: RAPD: RE: rico: ROC: RC: VEM: VOS: VS: VVZ: WOK: YES: ZEA: ZET: aqua destillata adenosinetrifosfaat wateractiviteit azijnzuur corn cob mix czapex dox yeast extract colony forming units czapek yeast autolysaat deoxynivalenol droge stof heterofermentatieve melkzuurbacteriën homofermentatieve melkzuurbacteriën koolhydraten lethale dosis waarbij 50% van de proefobjecten sterft lichaamsgewicht malt extract agar micro-organismen mycofenolzuur melkzuurbacteriën patuline potato dextrose agar ruw as random amplified polymorphic DNA ruw eiwit richtingscoëfficiënt roquefortine C ruwe celstof voedereenheid melk verteerbare organische stof verse stof vluchtige vetzuren wateroplosbare koolhydraten yeast extract sucrose zearalenone zetmeel Pagina 4

13 Lijst met figuren Figuur 1: Ingekuilde grasbalen Figuur 2: Maïsrijkuil Figuur 3: Fases van het inkuilproces (Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid ID- Lelystad, 2000) Figuur 4: Effect van inoculatie met homofermentatieve MZB op het ph-verloop (Kung et al., 2007) Figuur 5: Maïskuil aangetast door P. roqueforti s.l Figuur 6: Koloniemorfologie van twee P. roqueforti s.s. stammen (KE28G (boven) en LS04A (onder)) geënt op CYA (Bewerkt uit O'Brien et al., 2008b) Figuur 7: Koloniemorfologie van twee P. paneum stammen (OY127E (boven) en LD104I2 (onder)) geënt op CYA (Bewerkt uit O'Brien et al., 2008b) Figuur 8: Chemische structuur van ROC (Bewerkt uit Richard et al., 2004) Figuur 9: ROC productie bij 25 C, 20 % CO 2 in balans met N 2 en <0,5 % O 2 ; op CYA- en - - PDA-medium (Taniwaki et al., 2009) Figuur 10: Spectrofometer Figuur 11: Flowcytometer (Cyflow Partec, z.j.) Figuur 12: ph-meter Figuur 13: Schematische voorstelling van de Bürkertelkamer Figuur 14: Schematische voorstelling van de indeling van de 96-well plaat Figuur 15: Het aanbrengen van stukjes mycelium voor de Ehrlich kleurreactie Figuur 16: Postieve objecten bij de kwalitatieve ROC-bepaling Pagina 5

14 Lijst met tabellen Tabel 1: De concentraties van mycotoxinen in het rantsoen en de dagelijkse inname door melkvee van DON, ZEA, ROC en mycofenolzuur (Driehuis et al., 2008) Tabel 2: De verschillende P. roqueforti s.l.-soorten en hun mycotoxinen (Bewerkt uit Storm et al., 2008) Tabel 3: Samenstelling van het mineraal medium Tabel 4: Samenstelling sporenelementenoplossing Tabel 5: Chemische analyse van het uitgangsmateriaal Tabel 6: Samenstelling CDYE Tabel 7: Bereiding van de azijnzuuroplossingen Tabel 8: De 12 schimmelisolaten die werden gebruikt in het experiment Tabel 9: Initiële ph-waarden per medium bij de verschillende azijnzuurconcentraties Tabel 10: De groeisnelheden per isolaat op de verschillende media bij de azijnzuurconcentraties 0, 1, 3 en 5 ml/l; met aanduiding van de positieve ROC-objecten (grijze achtergrond) Tabel 11: De relatieve groeisnelheid per isolaat, uitgedrukt t.o.v. 0 ml AZ/l, op de verschillende groeimedia bij de azijnzuurconcentraties 0, 1, 3 en 5 ml/l; met voor 0 ml AZ/l de absolute groeicijfers Tabel 12: Significante verschillen in groeisnelheid per species tussen de media bij éénzelfde azijnzuurconcentratie (PP = P. paneum; PR = P. roqueforti s.s.) Tabel 13: Significante verschillen in groeisnelheid per species tussen de azijnzuurconcentraties binnen éénzelfde medium (PP = P. paneum; PR = P. roqueforti s.s.) Tabel 14: Significante verschillen in groeisnelheid tussen de species bij éénzelfde medium en éénzelfde azijnzuurconcentratie (PP = P. paneum; PR = P. roqueforti s.s.) Tabel 15: Significante verschillen in groeisnelheid tussen de twee geteste temperaturen op PDB en mineraal medium (22 C en 27 C) voor beide species (PP = P. paneum; PR = P. roqueforti s.s.) Pagina 6

15 Inleiding In deze thesis wordt de invloed van azijnzuur nagegaan op de groei van en roquefortine C- productie (ROC) door de schimmel Penicillium roqueforti sensu lato (s.l.). Uit heel wat experimenten, eerder uitgevoerd in het kader van het doctoraatsonderzoek van ir. Eva Wambacq, werd namelijk het vermoeden opgewekt dat P. roqueforti s.l. azijnzuur kan gebruiken als koolstofbron en groei zou vertonen bij hogere concentraties aan azijnzuur. Onder andere werd in een onderzoek met homofermentatieve (HoMZB) en heterofermentatieve melkzuurbacteriën (HeMZB) een betere groei gerapporteerd bij inoculatie met HeMZB (Vanluchene, 2012). Bovendien rapporteerden O'Brien et al. (2008b) het gebruik van een PDA-medium met 5 ml azijnzuur per liter als een selectief medium voor P. roqueforti s.l.. Het inkuilen van groenvoedergewassen wordt wereldwijd toegepast als een bewaarmethode die het mogelijk maakt dieren ook in de winter van ruwvoeders te voorzien. Het algemeen doel van het inkuilen is het voorzien van de dieren van kwalitatief voeder, in die perioden waar geen oogst van verse groenvoeders mogelijk is. Kuilvoeders omvatten dan ook vaak een belangrijk deel van het rundveerantsoen. Het inkuilproces is een anaeroob proces waarbij voornamelijk melkzuurbacteriën een natuurlijke fermentatie veroorzaken. Het voornaamste eindproduct van deze bacteriën is melkzuur. Hierdoor wordt een ph-daling van het kuilvoeder bekomen die ongunstige groeiomstandigheden creëert voor de meeste ongewenste microorganismen. Toch worden heel wat schimmelsoorten aangetroffen in het kuilvoeder, namelijk Fusarium spp., Aspergillus spp. en Penicillium spp. (Storm et al., 2008). Hierbij is Penicillium roqueforti s.l. één van de meest voorkomende bewaarschimmels in maïs- en graskuilen (Auerbach et al., 1998; Mansfield & Kuldau, 2007; Nielsen et al., 2006; O Brien, 2007; Skaar, 1996). Schimmels veroorzaken bederf met verlies van nutriënten als gevolg. Daarnaast zijn sommige schimmelspecies in staat om mycotoxines te produceren die kunnen leiden tot verminderde dierprestaties, ziekteverschijnselen of in sommige gevallen zelf de dood (Auerbach et al., 1998; Vesely et al., 1981). Goede inkuilpraktijken zijn een onderwerp waar vaak weinig aandacht aan wordt geschonken. Een goed inkuilproces is echter cruciaal om een kwalitatief goed kuilvoeder (zowel nutritioneel als microbiologisch) te bekomen, met een maximaal rendement voor mens en dier als gevolg. Het is echter zo dat de landbouwer enkel het inkuilproces kan beïnvloeden bij het aanbrengen van het vers plantenmateriaal in de kuil. Wanneer vervolgens het kuilvoeder luchtdicht wordt afgesloten en het fermentatieproces van start gaat is het vaak nog moeilijk om het proces te manipuleren (Merry et al., 1997). Pagina 7

16 P. roquefortis sensu stricto (s.s.) en P. paneum, samen aangeduid als P. roqueforti s.l., zijn typische bewaarschimmels die goed aangepast zijn aan de in kuilvoeder heersende omstandigheden. Zo komen deze frequent voor op substraten met een hoog gehalte aan organische zuren, hoge CO 2 -concentraties en lage O 2 -gehaltes (Samson et al., 2002). De problematiek met betrekking tot deze schimmels bestaat vooral uit de productie van mycotoxinen in het kuilvoeder. Enerzijds zijn beiden in staat om het roquefortine C te produceren waardoor dit toxine dan ook wordt beschouwd als indicator voor de aanwezigheid van andere P. roqueforti s.l.-toxines (Auerbach et al., 1998). Anderzijds beschikken zowel P. roqueforti s.s. en P. paneum over een verschillend mycotoxinepatroon, wat een onderscheid tussen beide species toelaat. Voor dit eindwerk werden proeven opgezet die de invloed van azijnzuur nagaan op de groei van en mycotoxineproductie door verschillende P. roqueforti s.l.-isolaten en dit op verschillende voedingsmedia. In het eerste deelexperiment werd de invloed van azijnzuur nagegaan op de groei van de schimmel. Hiervoor werd gebruik gemaakt van twaalf schimmelisolaten, zeven groeimedia en acht azijnzuurconcentraties. Uiteindelijk werd aan de hand van een spectrofotometer de groei bepaald door op drie tijdstippen de absorbantie te meten van de geïncubeerde objecten. Het tweede deelexperiment bestond uit het nagaan van de invloed van azijnzuur op de ROC-productie. Hiervoor werd een kwalitatieve bepaling uitgevoerd aan de hand van de Ehrlich test, waarbij vier isolaten, vier azijnzuurconcentraties en vier media werden getest. In deze masterproef komt vooreerst een uitgebreide literatuurstudie aan bod. Hierbij wordt stapsgewijs naar de essentie van het onderzoek toe gewerkt, gaande van het inkuilproces in het algemeen tot het voorkomen van P. roqueforti s.l. en zijn mycotoxines. Vervolgens worden in het onderdeel "Materiaal en methoden" de gebruikte producten voorgesteld, waarna er een verdere verduidelijking wordt weergegeven van de proefopzet. Daarna worden de resultaten van de verschillende deelexperimenten weergegeven en uitgebreid besproken in het onderdeel "Resultaten". In het onderdeel "Discussie" worden de waargenomen feiten gelinkt met de gegevens uit de literatuur. Tot slot wordt een algemeen besluit met betrekking tot het onderzoek geformuleerd worden. Pagina 8

17 1 Literatuurstudie 1.1 Kuilvoeder Het belang van kuilvoeder Het inkuilen van groenvoeders gebeurt wereldwijd en heeft vooral sterk aan populariteit gewonnen in NW-Europa sinds de jaren 1960 (Wilkins, 2005). Zo bestond in Europa in het jaar 1994, 55 % van de totale hoeveelheid geconserveerde groenvoeders uit kuilvoeders, terwijl dit in Nederland zelfs 90 % bedroeg. Dit kwam neer op 550 miljoen ton verse stof aan ingekuilde groenvoeders (Driehuis & Oude Elferink, 2000). Voor het behoud van gezonde dieren, goede rantsoencontrole en een betere benutting van dierlijke mest worden de runderen op de moderne rundveebedrijven in het najaar op stal gebracht. Hierdoor groeide de vraag naar een bewaarmethode die er kan voor zorgen dat ook in de wintermaanden de dieren kunnen worden voorzien van ruwvoeders zonder dat hierbij moet ingeboet worden aan kwaliteit van het voeder. Het inkuilproces biedt hier een goede oplossing. Zo kan het voeder in de gesloten kuil na fermentatie gedurende meer dan 14 maanden bewaard worden zonder dat hierbij bederf optreedt (Wilkinson et al., 2003). Daarnaast biedt het inkuilen van groenvoeders de mogelijkheid om de runderen ook niet graasbare producten te laten opnemen (Driehuis & Oude Elferink, 2000). Vandaag de dag omvatten kuilvoeders een belangrijk deel van het rantsoen. Zo mag voor melkkoeien het rantsoen voor 50 tot 75 % uit maïskuil bestaan (Driehuis et al., 2008). Hierbij kunnen koeien tot 40 kg vers kuilvoeder opnemen per dag en dit het gehele jaar door. Bovendien zal het belang van kuilvoeders nog verder toenemen. Zo wees een enquête van Schellekens et al. (2008) uit dat in op 4 % van de Vlaamse melkveebedrijven de koeien jaarrond op stal werden gehouden. Deze wijziging van het traditionele systeem vindt vooral zijn oorzaak in de groeiende veestapel (meer koeien per bedrijf) en het gebruik van melkrobots. Andere voordelen van het gebruik van ruwvoeders zijn dat ze relatief goedkoop zijn in vergelijking met krachtvoeder, de veehouder een arbeidsvergoeding krijgt voor de teelt van deze ruwvoeders en dat ze noodzakelijk zijn als bron van structuur in het rantsoen (De Brabander, 2013). Dat kuilvoeders van groot belang zijn in West-Europa wordt aangetoond met het totaal areaal aan in te kuilen groenvoedergewassen dat geschat wordt op 15 miljoen hectare. Dit bleef sinds 1990 relatief constant. Op wereldschaal wordt de laatste twee decennia echter een stijging vastgesteld (Wilkinson et al., 2003). Deze stijging voor maïs, die minder uitgesproken is in Europa, kan vooral toegeschreven worden aan de toegenomen beschikbaarheid van korteseizoensvariëteiten. Deze zijn meer geschikt om in gematigde klimaatzones geteeld te worden. Verder is er ook nog de selectie naar hoogproductievere dieren. Deze dieren hebben Pagina 9

18 een hoge energiebehoefte waardoor meer landbouwers gaan kiezen voor het bijvoederen van maïskuil gedurende het weideseizoen (Wilkinson et al., 2003). De twee meest belangrijkste groenvoeders die ingekuild worden in NW-Europa zijn maïs en gras. Er zijn echter nog heel wat andere voedergrondstoffen die kunnen worden ingekuild, zoals bietenpulp, bietenloof, Corn Cob Mix (CCM), granen, klaver, luzerne, aardappelpersvezel, aardappelen, bierborstel, enz. (Handboek Snijmaïs, z.j.) Het inkuilproces Oogsten Belangrijk bij het oogstproces is het droge stof-gehalte (DS) van de plant. Voor elk groenvoedergewas kan een optimale DS-range aangegeven worden. Voor maïs ligt dit optimum tussen 30 en 35 % DS van de totale plant, terwijl dit voor gras % bedraagt (Auerbach et al., 1998). Bij het oogsten kunnen verschillende technieken aangewend worden, afhankelijk van de gewenste inkuilmethode. Zo kan gras na maaien onmiddellijk worden ingekuild, of kan het gras enkele dagen gedroogd worden om zo een voordroogkuil te maken. Gras kan al dan niet gehakseld worden voor inkuilen. Er kan voor gekozen worden om het gras in balen te persen en deze luchtdicht af te sluiten met wikkelfolie (Figuur 1). Zowel gras als maïs kunnen aangebracht worden in een rijkuil of sleufsilo (Figuur 2) (Driehuis & Oude Elferink, 2000). Een nieuwere techniek om maïs in te kuilen is het persen in ronde balen of silobags. Dit is vooral gebruiksvriendelijker voor kleinere bedrijven (Cheli et al., 2013). Maïs wordt, onafhankelijk van de inkuilmethode, steeds gehakseld met behulp van een hakselaar. Naast verfijning van het plantenmateriaal, wordt ook een lyse van de plantencellen bekomen. Hierdoor komen de plantensappen vrij die een gunstig effect hebben op de ontwikkeling van melkzuurbacteriën (Seale et al., 1982). Indien de plant hierbij een te laag DS-gehalte heeft zullen perssapverliezen en dus nutriëntenverliezen optreden, wat uiteraard niet gewenst is. Bij maïs die geoogst wordt bij 28 % DS kunnen de sapverliezen oplopen van 14 tot 25 liter per ton vers plantenmateriaal voor respectievelijk dry down en stay-green types (Handboek Snijmaïs, z.j.). Pagina 10

19 Figuur 1: Ingekuilde grasbalen Figuur 2: Maïsrijkuil Inkuilen Bij het inkuilen wordt er bij voorkeur voor geopteerd om de trekker met de silowagen de gehakselde plantendelen gelijkmatig over de rijkuil of sleufsilo te laten verdelen. Op die manier wordt er een aanvoer verkregen in lagen die vervolgens goed kunnen worden aangereden door een aandruktrekker. Een andere manier om in te kuilen, is het plantenmateriaal voor de kuil aanbrengen en met een shovel over de kuil te verdelen. Ook wordt bij voorkeur ingekuild in een sleufsilo. Hierbij zijn, in tegenstelling tot bij een rijkuil, opstaande betonwanden aanwezig die zorgen voor een betere verdichting bij het aanrijden. Er moet bovendien een goed evenwicht gezocht worden tussen aandrukken en inkuilsnelheid. Te weinig aandrukken zal leiden tot de aanwezigheid van veel zuurstof wat later aanleiding geeft tot broei. Daarnaast moet de kuil in een zo kort mogelijke periode gemaakt worden. Op die manier worden de verliezen door respiratie van de plantendelen beperkt (Handboek Snijmaïs, z.j.). Ook de luchtdichte afdekking van het kuilvoeder vraagt de nodige aandacht. Hierbij wordt veelal gebruik gemaakt van twee lagen plastiek, afgedekt met een gronddek of banden en daarboven een beschermzeil om beschadiging van de afdekking door vogels te voorkomen Fermentatie Bij het inkuilen van voedergewassen wordt een anaeroob milieu gecreëerd. Zo kan de spontane anaerobe fermentatie op gang komen, waarbij epifytische melkzuurbacteriën de wateroplosbare koolhydraten zullen omzetten tot voornamelijk melkzuur en in mindere mate tot azijnzuur en andere. De productie van organische zuren zorgt voor een ph-daling (McDonald et al., 1991). Deze zure ph heeft een remmend effect op de groei en ontwikkeling van verschillende bederforganismen. In het inkuilproces kunnen vier fasen onderscheiden worden (Merry et al.,1997; Weinberg & Muck, 1996): Pagina 11

20 1. aerobe fase 2. verzuringsfase 3. stabiele fase 4. uitkuilfase Het inkuilproces van maïs wordt schematisch voorgesteld in Figuur 3, waarbij het ideale phverloop weergegeven wordt, alsook mogelijke verstoring van dit ideale verloop door ongewenste micro-organismen. Figuur 3: Fases van het inkuilproces (Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid ID- Lelystad, 2000). De eerste fase na het afdichten van de kuil is de aerobe fase, met een ph die varieert tussen 6,0 en 6,5. Deze fase duurt enkele uren tot dagen. In het vers plantenweefsel zijn nog steeds intacte cellen aanwezig waarvan de ademhaling verder doorgaat. Er vindt dus een respiratiereactie plaats waarbij zuurstof en voedingsbestanddelen uit het plantenmateriaal verbruikt worden en waarbij er koolstofdioxide en warmte geproduceerd worden (Driehuis & Oude Elferink, 2000). Naast de respiratie van de plantendelen is er ook nog de respiratie van de aanwezige aerobe en facultatief aerobe micro-organismen (o.a. gisten en enterobacteriën). Deze zorgen op hun beurt ook voor een verbruik van zuurstof en nutriënten. Tot slot is er nog de activiteit van verschillende plantenenzymen, zoals proteasen en carbohydrasen, die kunnen zorgen voor de afbraak van verschillende plantenbestanddelen. Het is dus van belang om deze aerobe fase zo kort mogelijk te houden zodat de voederwaarde van het kuilvoeder niet te sterk daalt. Dit kan verwezenlijkt worden door het goed aandrukken en snel afdekken van het kuilvoeder. Pagina 12

21 De tweede fase wordt de verzuringsfase of de fermentatiefase genoemd. Dit is een anaerobe fase die ingaat op het moment dat er nagenoeg geen zuurstof meer aanwezig is in de kuil. Deze situatie is gunstig voor de aanwezige anaerobe micro-organismen, met als belangrijkste de melkzuurbacteriën. Het is een fase die enkele dagen tot weken in beslag neemt, afhankelijk van het ingekuilde gewas en de inkuilcondities. Door de sterke concurrentiepositie van de melkzuurbacteriën zullen deze zich optimaal ontwikkelen (Driehuis & Oude Elferink, 2000). Hierbij zullen de aanwezige suikers (wateroplosbare koolhydraten) uit het plantenmateriaal omgezet worden, met als reactieproduct voornamelijk melkzuur en in kleinere hoeveelheden ook azijnzuur en ethanol. Deze zuurproductie brengt een ph-daling met zich mee die, tot op een bepaalde waarde, nog meer in het voordeel werkt van de melkzuurbacteriën. Zo blijft de concentratie aan melkzuurbacteriën toenemen tot circa 14 dagen na inkuilen. Vervolgens neemt de populatie af door de hoge zuurconcentraties (Seale, 1986). De mate van ph-daling is uiteraard sterk afhankelijk van de samenstelling en de buffercapaciteit van het groenvoeder. Hoe lager deze buffercapaciteit, hoe sneller de ph zal dalen. Ook de aantallen en soorten van de op het gewas aanwezige melkzuurbacteriën hebben een invloed op de mate en snelheid van ph-daling. Na de verzuringsfase zal er een ph-stabilisatie optreden. Dit is de zogenaamde stabiele fase. Deze stabiele ph-waarde kan sterk variëren en is onder andere afhankelijk van het DS-gehalte van het ingekuilde gewasmateriaal. In deze stabiele fase zal er aan het kuilvoeder zelf niet veel veranderen zolang er geen blootstelling is aan zuurstof. Er dient opgemerkt te worden dat ondanks dat de groei van micro-organismen geremd is, deze toch onder inactieve vorm kunnen aanwezig blijven. Het gaat hier vaak om zuurtolerante bacteriën (zoals Clostridia en andere bacillen) en schimmels die als sporen overleven (Driehuis & Oude Elferink, 2000). Daarnaast zijn er ook nog zuurtolerante proteasen en carbohydrasen die actief kunnen blijven. Ook aangepaste micro-organismen zoals Lactobacillus buchneri kunnen actief blijven op een laag niveau (Weinberg et al., 2001). Uiteindelijk wordt het inkuilproces beëindigd met de uitkuilfase. Dit is de fase waarbij de landbouwer begint met het vervoederen van het kuilvoeder aan het vee. Door het openen van de kuil komt het kuilvoeder terug in contact met de lucht en dus met zuurstof. De aerobe bederforganismen worden opnieuw actief, hetgeen aeroob bederf wordt genoemd (Driehuis & Oude Elferink, 2000). Deze bederforganismen, voornamelijk gisten en azijnzuurbacteriën, maken voor hun groei en ontwikkeling gebruik van de aanwezige koolhydraten en organische zuren (Moon & Ely, 1979). Dit afbraakproces leidt tot een ph- en temperatuurstijging, hetgeen broei wordt genoemd. Broei kan aanleiding geven tot aanzienlijke verliezen. Zo kunnen de dagelijkse DS-verliezen van de kuilsnede variëren van 8 tot 24 % wanneer de temperatuur 5 tot 15 C hoger ligt dan de omgevingstemperatuur (Latré & Wambacq, 2009). Dit komt overeen met voederwaardeverliezen van 2 tot 3 % (20-30 VEM) (Handboek Pagina 13

22 SnijmaÏs, z.j.). Een belangrijke parameter hierbij is de aerobe stabiliteit van het kuilvoeder. Het is een parameter die aangeeft hoelang het duurt vooraleer de temperatuur van het uitgekuilde voeder bij blootstelling aan lucht 3 C boven de omgevingstemperatuur stijgt. Een hoge waarde geeft een hoge aerobe stabiliteit aan, waardoor dus het aeroob bederf bij uitkuilen lager zal liggen. Finaal is broei echter onvermijdelijk en komt dit fenomeen na verloop van tijd bij alle kuilvoeders voor. Daarom is het van belang om het deel van het kuilvoeder dat aan de lucht wordt blootgesteld (en aan broei onderhevig zal zijn) tijdig te vervoederen. Belangrijk hierbij is de keuze van de kuildimensie, zodat een voldoende hoge uitkuilsnelheid kan aangehouden worden. Hoge, brede kuilen in combinatie met een beperkte veestapel of een beperkt aandeel kuilvoeder in het rantsoen zullen broei sterk in de hand werken door een lage afnamesnelheid. Een goede vuistregel hierbij is dat van een kuil met gronddek wekelijks 1,5 m moet vervoederd worden, terwijl dit 2 m bedraagt voor een kuil zonder gronddek. Voor een zomerkuil zal de voedersnelheid hoger moeten zijn en bijgevolg zal deze ook smaller aangelegd worden. Een andere preventieve maatregel om het negatieve effect van broei te minimaliseren is gebruik maken van goede uitkuilpraktijken. Zo wordt er bij voorkeur voor gezorgd dat de kuilsnede steeds glad is afgewerkt en dat eventueel beschimmeld kuilvoeder onmiddellijk verwijderd wordt (Latré & Wambacq, 2009). Het is belangrijk om te weten dat naast het aeroob bederf tijdens het uitkuilen, er ook al sprake kan zijn van aeroob bederf tijdens de stabiele fase. Zo kunnen bijvoorbeeld vogels of knaagdieren gaten maken in de kuilafdekking waardoor er zuurstofintrede plaatsvindt. Een regelmatige controle van de kuilafdekking en een snelle reparatie van de eventuele beschadigingen is dus aangewezen. Ook dient bij voorkeur preventief te werk worden gegaan door het gebruik van vogelafwerende netten Invloedsfactoren bij het inkuilproces Er zijn heel wat factoren die in meer of mindere mate hun invloed hebben op het inkuilproces. Hierna worden de voornaamste invloedsfactoren behandeld, namelijk: het droge stof gehalte, de concentratie aan wateroplosbare koolhydraten, de buffercapaciteit en de zuurstofconcentratie Droge stof gehalte Het droge stof gehalte is duidelijk één van de belangrijkste parameters bij het inkuilproces. De oogstdatum is dan ook onlosmakelijk verbonden met het DS-gehalte. Zo zal een te vroeg geoogste maïs bij inkuilen aanleiding geven tot onder andere gasvorming. Hierbij ontstaat er extra koolzuur- en waterstofgas. Bovendien wordt het aanwezige nitraat uit de vele groene plantendelen omgezet naar nitriet en andere stikstofverbindingen. Het gas is zeer toxisch, maar indien dit herhaaldelijk vrijgelaten wordt van onder de afdekking is er geen gevaar voor Pagina 14

23 het vee bij het vervoederen (Handboek Snijmaïs, z.j.). Daarnaast zullen bij een te laag DSgehalte de sapverliezen hoger liggen. Bij kuilvoeders met een hoger DS-percentage zal het voederwaardeverlies door de omzettingsreacties bij het inkuilen kleiner zijn doordat er minder melkzuur nodig is om de kritische ph te bereiken. Het is namelijk zo dat bij een lager vochtgehalte de hoeveelheid zuur nodig om de ph met één eenheid te laten dalen, geringer zal zijn. Daarnaast vonden O Brien et al. (2007) dat er een negatieve correlatie bestaat tussen het DS-gehalte en de concentratie aan azijn- en boterzuur. Ook McNamara et al. (2004) bevestigden dit. Hierbij gaf het onderzoek aan dat een lager DS-gehalte leidt tot een meer intense fermentatie (hogere fermentatieverliezen), met een hogere productie aan vluchtige vetzuren (VVZ) als gevolg. Deze VVZ staan erom bekend antimycotische eigenschappen te bezitten (Pitt, 1986). Ook is er bij een intense fermentatie, naast een laag restsuikergehalte en een hoog gehalte etherextract, vaak sprake van een verhoogde eiwitafbraak die zich weerspiegelt in een hogere NH 3 -fractie met een bufferend effect voor melkzuur. Op het vlak van aeroob bederf en broei zijn het vooral de kuilvoeders met een hoog DS-percentage die gevoeliger zijn (Adler, 1993; Honig, 1991; Pitt et al., 1991). Dit kan verklaard worden door de lagere kuildichtheid die hierbij bekomen wordt. Er is dus nog een hoge porositeit na het aandrukken, wat aanleiding geeft tot een hogere zuurstofconcentratie en gasuitwisseling (Honig, 1991; Pitt, 1986; Pitt & Muck, 1993). Tot slot vonden Boudra & Morgavi (2008) dat een lager DS-gehalte leidt tot een verhoogde verwijdering van verschillende wateroplosbare mycotoxines met het fermentatie-effluent. Zo werden in maïskuilenvoeders met een DSpercentage van 24 en 28 % beduidend minder Fusarium-toxinen aangetroffen dan in kuilvoeders met een DS-gehalte van respectievelijk 37 en 42 % Wateroplosbare koolhydraten Het gehalte aan wateroplosbare koolhydraten in kuilvoeders is een andere belangrijke factor die een invloed heeft op het inkuilproces. Deze wateroplosbare koolhydraten worden door de melkzuurbacteriën aangewend als C-bron voor het produceren van organische zuren. Zoals eerder aangehaald is een voldoende hoge concentratie aan melkzuur essentieel voor het bekomen van een stabiele kuil. Zo is er in een graskuil met een DS-gehalte van 40 tot 45 %, g/kg DS melkzuur nodig om een voldoende stabiele kuil te bekomen (van der Knaap, 2013). Enkele belangrijke wateroplosbare koolhydraten zijn glucose, fructose, sucrose en fructosanen. Daarnaast zijn er ook nog andere niet-structurele koolhydraten zoals zetmeel, die echter eerst enzymatisch dienen afgebroken te worden vooraleer deze beschikbaar zijn voor de melkzuurbacteriën. Deze afbraak kan gebeuren door enzymen afkomstig van de plant of van andere micro-organismen. Bovendien kunnen in sommige gevallen ook structurele koolhydraten zoals cellulose en hemicellulose (na hydrolyse) aangewend worden voor de productie van melkzuur. Pagina 15

24 Een belangrijk aspect bij dit onderwerp is het voordrogen van gras. Hierbij wordt in gepaste omstandigheden een DS-gehalte beoogd van %. Het voordrogen van gras is een techniek die toegepast wordt om een verhoging te krijgen van de concentratie aan wateroplosbare koolhydraten. Daarnaast kunnen er ook grasrassen aangewend worden die een hoger gehalte aan wateroplosbare suikers bevatten. Een nadeel hierbij is dat rassen met een hogere concentratie aan wateroplosbare suikers gevoeliger kunnen zijn aan aeroob bederf na inkuilen, wat ook het geval is voor voordroogkuilvoeder (McDonald et al., 1991). Het is duidelijk dat de benodigde concentratie aan wateroplosbare koolhydraten in sterke mate bepaald wordt door het DS-gehalte en de buffercapaciteit van het in te kuilen plantenmateriaal Buffercapaciteit De buffercapaciteit is een parameter die vooral zijn invloed heeft bij de verzuringsfase van het inkuilproces. Hoe hoger de bufferende werking, hoe meer melkzuur er zal moeten geproduceerd worden voor eenzelfde ph-daling. De buffercapaciteit zelf wordt vooral beïnvloed door de samenstelling van het plantenmateriaal. Een belangrijke determinant voor de buffercapaciteit is het eiwitgehalte. Eiwitten worden door enterobacteriën afgebroken tot amines en ammoniak. Hierbij is het vooral ammoniak dat een sterk bufferende werking bezit. Hoe hoger dus het eiwitgehalte is, hoe hoger de buffercapaciteit van het plantenmateriaal zal zijn. Het bufferend vermogen hangt aldus sterk samen met het soort gewas dat wordt ingekuild. Zo zal maïs een lagere buffercapaciteit hebben dan gras (eiwitrijk) Zuurstof Doordat de melkzuurbacteriën anaeroob van aard zijn, is de aanwezigheid van zuurstof in de kuil niet gewenst. Zuurstof geeft aerobe bederforganismen de kans om te groeien en zich te ontwikkelen in het kuilvoeder. Belangrijke factoren met betrekking tot de zuurstofconcentratie zijn de kuildichtheid en porositeit. Dit zijn fysische parameters die in verband staan met de luchtdoorlaatbaarheid van kuilvoeders en die beïnvloed worden door o.a. het DS-gehalte en de hakselfijnheid (Rooke & Hartfield, 2003; Williams, 1994). Een te grove haksellengte leidt vanzelfsprekend tot een moeilijk aandrukbare kuil die als gevolg ook een hogere porositeit zal bezitten. Er zijn twee methoden bekend waarop zuurstof de kuilvoeders kan penetreren. Enerzijds is er de door concentratieverschillen veroorzaakte diffusie van zuurstof (Pitt, 1986) en anderzijds is er de permeatie die tot stand komt door een drukverschil (Parsons, 1991). Parsons (1991) toonde aan dat permeatie het belangrijkste probleem is bij zuurstofpenetratie in sleufsilo s. Een ander aspect van belang bij het zuurstofgehalte is het uitkuilproces en de hierbij gebruikte uitkuilmethode. Tijdens het uitkuilen komt het voeder terug in aanraking met zuurstof wat opnieuw aanleiding geeft tot Pagina 16

25 bederf (broei). Het uitkuilen met een glad snijvlak is aan te raden om zo minimale broei te behouden (Barry et al., 1980) Microflora betrokken bij het inkuilproces Bepaalde microflora zijn essentieel voor het goed verloop van het inkuilproces. Zonder de aanwezigheid van bepaalde micro-organismen kan het inkuilproces niet correct doorgaan. In het volgende hoofdstuk worden de belangrijkste micro-organismen besproken met betrekking tot hun functie in het inkuilproces. Hierbij kan een onderscheid gemaakt worden tussen gewenste en ongewenste micro-organismen (m.o.) (Oude Elferink et al., 2006). De gewenste m.o. hebben een gunstig effect op het inkuilproces. De ongewenste m.o. daarentegen zijn ongunstig en veroorzaken bederf en verlies aan nutriënten. Uitgedrukt in voederwaarde zullen deze verliezen nog groter zijn aangezien de bederforganismen eerst de best verteerbare componenten afbreken. Daarnaast kunnen ongewenste m.o. ook een negatief effect hebben op de diergezondheid, met verminderde prestaties als gevolg. Het bederf kan naar gelang de zuurstofcondities onderverdeeld worden in aeroob bederf (door enterobacteriën, schimmels, bacillen, ) en anaeroob bederf (door Clostridium spp.) Melkzuurbacteriën Melkzuurbacteriën (MZB) zijn veruit de belangrijkste m.o. in het inkuilproces. Melkzuurbacteriën zijn Gram-positieve, meestal mesofiele bacteriën met een optimale groeitemperatuur van C (Driehuis & Oude Elferink, 2000). Ze kunnen echter groeien binnen een ruim temperatuurbereik van 5 tot 50 C waardoor kuilvoeder een ideale habitat vormt voor deze micro-organismen. Bovendien zijn alle melkzuurbacteriën aerotolerant, maar ze hebben doorgaans een voorkeur voor anaerobe omstandigheden (Devriese et al., 1992; Hammes et al., 1992; Oude Elferink et al., 2006; Weiss, 1992). Zij hebben de eigenschap om vooral wateroplosbare koolhydraten aan te wenden voor hun groei en ontwikkeling, waarbij het gewenste product melkzuur ontstaat. Dit melkzuur is essentieel om een ph-verlaging te verkrijgen die zorgt voor ongunstige groeiomstandigheden voor de ongewenste m.o. (Richard et al., 2007). Melkzuurbacteriën zijn van nature uit massaal aanwezig op het in te kuilen plantenmateriaal, waardoor ze behoren tot de epifytische micro-organismen (Driehuis & Oude Elferink, 2000). Exponentiële groei vindt echter pas plaats bij de anaerobe fase van het inkuilproces. Hierbij treden de melkzuurbacteriën in competitie met de andere microflora voor de aanwezige nutriënten. Er zijn heel wat gewaseigenschappen (de suikerinhoud, -samenstelling en het DSgehalte) die de concurrentiepositie van de MZB bepalen. Daarnaast zijn er ook factoren met betrekking tot de melkzuurbacteriën zelf die hun competitiviteit bepalen, bijv. osmo- en Pagina 17

26 zuurtolerantie (McDonald et al., 1991). Al deze parameters samen bepalen of MZB de dominante m.o. zullen zijn en of het kuilvoeder goed zal worden gefermenteerd. De MZB kunnen aan de hand van hun suikermetabolisme onderverdeeld worden in twee groepen, namelijk de homofermentatieve (HoMZB) en de heterofermentatieve MZB (HeMZB) (Wilkinson, 2005). Beide groepen maken gebruik van verschillende pathways voor de metabolisatie van suikers. Hierbij zijn het de HoMZB die het meest efficiënt glucose of fructose kunnen omzetten in (alleen) melkzuur. Zij zijn dan ook zeer gunstig voor een snelle fermentatie. Soorten behorende tot de HoMZB zijn Lactobacillus rumines, L. plantarum, L. pentosus, Pediococcus damnosus, P. acidilactici, P. pentosaceus en Enterococcus faecium. De HeMZB produceren naast melkzuur ook azijnzuur, ethanol en mannitol. De omzetting van suikers gebeurt hier dus minder efficiënt dan bij de HoMZB, maar azijnzuur heeft positieve antimycotische eigenschappen in het kuilvoeder. Soorten behorende tot de HeMZB zijn Lactobacillus buchneri, L. brevis en enkele Leuconostoc spp. (Hammes et al., 1992; Oude Elferink et al., 2006; Devriese et al., 1992; Weiss, 1992). De omzettingsprocessen van de aangewende suikers verlopen als volgt: HoMZB: 1 mol glucose of fructose 1 mol melkzuur HeMZB: 1 mol glucose 1 mol melkzuur + 1 mol ethanol + 1 mol CO 2 3 mol fructose 1 mol melkzuur + 1 mol azijnzuur + 1 mol CO mol mannitol 1 mol pentose 1 mol melkzuur + 1 mol azijnzuur In sommige situaties is de concentratie aan MZB op het in te kuilen gewas ontoereikend om een voldoende vlotte fermentatie te verkrijgen. Hierdoor zijn er heel wat kuiladditieven ontwikkeld die de bewaring positief moeten beïnvloeden (zie 1.2) Azijnzuurbacteriën De uit kuilvoeders geïsoleerde azijnzuurbacteriën behoren allemaal tot het geslacht Acetobacter (Spoelstra et al., 1988). Het gaat hierbij om obligaat aerobe, zuur-tolerante micro-organismen die in staat zijn om azijnzuur te produceren. Of de aanwezigheid van azijnzuurbacteriën positief is, hangt af van de fase van het kuilproces. Zo zijn de azijnzuurbacteriën in het begin van het inkuilproces niet echt Pagina 18

27 ongewenst, op voorwaarde dat de aerobe fase kort is. In de aanwezigheid van zuurstof zullen de azijnzuurbacteriën namelijk zorgen voor de omzetting van ethanol tot azijnzuur, gepaard gaande met het verbruik van zuurstof. Daarentegen kunnen ze tijdens de uitkuilfase wel een duidelijk ongewenste rol spelen. Hierbij vindt een aerobe afbraak plaats waarbij melk- en azijnzuur geoxideerd worden tot water en CO 2. Dit is een exotherm proces waardoor broei nog verder in de hand wordt gewerkt (Spoelstra et al., 1988) Bacillen De groep van de Bacilli omvat zowel aerobe als facultatief aerobe soorten. Het zijn endospore-vormende, staafvormige bacteriën. Soorten die sterk geassocieerd worden met het inkuilproces zijn Bacillus cereus, B. lentus, B. firmus, B. sphaericus, B. licheniformis en B. polymyxa (Woolford et al., 1978). Moran et al. (1993) ontdekten dat bepaalde Bacillus species in staat zijn om antifungale stoffen te produceren, waardoor deze species als bruikbaar werden geacht om het aeroob bederf in kuilvoeders te reduceren. Praktijkervaring hieromtrent is echter tot op heden nog niet aanwezig. De aanwezigheid van bacillen in kuilvoeders wordt algemeen als ongewenst beschouwd daar de facultatief aerobe soorten koolhydraten omzetten tot organische zuren (azijnzuur, boterzuur, melkzuur, ), ethanol, 2,3-butadieen en glycerol (Claus & Berkely, 1986). Deze omzettingen van koolhydraten naar melkzuur gebeuren bovendien op een minder efficiënte wijze dan bij de MZB (McDonald et al., 1991). Daarnaast zijn ook heel wat Bacillus spp. in staat om broei tijdens het uitkuilen te versterken (Lindgren et al., 1985). Een belangrijke maatregel die kan genomen worden om de groei door bacillen te reduceren of voorkomen, is het reinigen van de banden van de aandruktrekker. Op die manier wordt de contaminatie van het in te kuilen plantenmateriaal met mest en/of aarde voorkomen (McDonald et al., 1991; Oude Elferink et al., 2006). De bacillen kunnen er namelijk ook voor zorgen dat de melk gecontamineerd wordt met de geproduceerde sporen. Vooral B. cereus is een belangrijk bederforganisme in gepasteuriseerde melk, welke bovendien voedselvergiftiging kan veroorzaken (Johnson, 1984) Clostridium spp. Tot het geslacht Clostridium behoren de echte boterzuurbacteriën. Het zijn net als de Bacilli endospore-vormende micro-organismen, doch ze zijn anaeroob van aard. Het zijn epifytische organismen, waarbij het vooral de sporen zijn die van nature aanwezig zijn op planten. Deze sporen vormen de overlevingsstructuren in geval van ongunstige groeiomstandigheden. Een belangrijke soort met betrekking tot de kuilomstandigheden is de zuurtolerante Clostridium tyrobutyricum, maar ook C. butyricum, C. sporogenes en C. bifermentans worden regelmatig aangetroffen in het kuilvoeder (McDonald et al., 1991). Pagina 19

28 De Clostridia hebben de specifieke eigenschap om boterzuur te produceren als restproduct van de ATP-synthese en dit met als uitgangsproducten melkzuur, koolhydraten en eiwitten (Kung, 2001). Dit boterzuur zorgt onder andere voor een onaangename geur en smaak, wat een verminderde voederopname teweeg brengt. Ook de biogene aminen, ontstaan door de eiwitafbraak, kunnen een lagere voederopname als gevolg hebben (Driehuis & Oude Elferink, 2000; Van Os et al., 1997). Bij de omzetting van melkzuur wordt naast boterzuur ook waterstofgas en CO 2 gevormd: 2 mol melkzuur 2 mol boterzuur + 2 mol H mol CO 2 Doordat melkzuur een sterker zuur is dan boterzuur zorgt de omzetting van melkzuur er bovendien voor dat de kritische ph voor een goede bewaring niet kan bereikt worden. Kuilen die ernstig besmet zijn door Clostridia ( boterzuurkuilen ) identificeren zich als kuilen met een hoge ph (> 5 voor maïskuilen met een DS-gehalte lager dan 30 % en voor voordroogkuilen met een DS-gehalte lager dan 35 %), hoge concentraties aan ammoniak en biogene aminen (geproduceerd door Clostridium spp.) en een onaangename geur (Schooten et al., 2005). Het zijn dus vooral de vochtige kuilvoeders (bijv. natte graskuil) die een verhoogd risico vormen voor Clostridium-besmetting. Zo vertonen Clostridia een hogere gevoeligheid voor een lage a w -waarde dan melkzuurbacteriën. Het voordrogen van gras kan hierbij dus als preventieve maatregel aangewend worden (Weiringa, 1958; Wilkinson, 2005). De kans op Clostridium-besmetting wordt onder andere verhoogd door het in de kuil brengen van aarde, mest en karkassen (dode vogels, muizen,...) (Oude Elferink et al., 2006). Naast verminderde voederopname kan de opname van besmet kuilvoeder in bepaalde gevallen ook leiden tot het sterven van de dieren. Dit met name door de aanwezigheid van Clostridium botulinum, producent van het uiterst neurotoxische botuline-toxine. Sporen van deze bacterie kunnen gedurende lange tijd vitaal aanwezig blijven in een zuurstofarme bodem of sterk vervuild oppervlaktewater (zonder opgeloste zuurstof), doch komen enkel voor in slecht gefermenteerde, niet-zure kuilen. Acties die een snelle en voldoende daling van de ph bewerkstelligen kunnen bijgevolg Clostridium-besmetting voorkomen. Tot slot is er nog de persistentie van de sporen die de passage van het spijsverteringsstelsel overleven en bijgevolg in de melk kunnen terecht komen via de met faeces besmette uier. Hierbij treden vooral problemen (het 'late blowing' effect) op bij het bereiden van harde en halfharde kazen zoals Gouda, Grana en Parmezaan (Goudkov & Sharpe, 1965). Dit heeft uiteraard gezondheidsrisico's voor de mens als gevolg. Pagina 20

29 Listeria Het geslacht Listeria omvat zowel aerobe als facultatief anaerobe bacteriën. Het gaat hierbij om vrij zuurtolerante bacteriën die zelfs bij ph-waarden van 3,8-4,2 kunnen overleven op voorwaarde dat er O 2 aanwezig is (McDonald et al., 1991). Hun aanwezigheid is sterk geassocieerd met aeroob bederf (Driehuis & Oude Elferink, 2000). De belangrijkste soort is de veroorzaker van listeriose, nl. Listeria monocytogenes. De symptomen van een Listeriainfectie kunnen zijn: meningitis, sepsis, pneumonie, endometritis, enz. (Wiedmann et al., 1994; Wilesmith & Gitter, 1986). Sanaa et al. (1993) constateerden bovendien dat een slechte kuilvoederkwaliteit één van de primaire oorzaken kan zijn van een L. monocytogenesbesmetting van de melk. Een goede kuilfermentatie zal de groei en aanwezigheid van Listeria spp. inhiberen (Oude Elferink et al., 2006) Enterobacteriën De enterobacteriën zijn allen facultatief anaeroob en van nature aanwezig op de groenvoedergewassen. Ze zijn niet zuurtolerant waardoor een snelle en sterke ph-daling tot 4,5-5,0 de ontwikkeling in kuilvoeder zal remmen (Heron et al., 1993). De aanwezigheid van zuurstof verlengt echter de overleving van deze bacteriën (Donald et al., 1995). Zo komen soorten als Erwinia herbicola en Rahnella aquitilis vaak voor op de gewassen op het veld, terwijl na het inkuilen deze vervangen worden door soorten als Hafnia alvei, Escherichia coli en Serratia fonticola (Heron et al., 1993). De meeste enterobacterie-soorten worden als nietpathogeen beschouwd, maar toch hebben ze hoofdzakelijk een ongewenst effect bij het inkuilproces. Zo gaan zij gebruik maken van de aanwezige suikers voor hun eigen groei, waarbij zij dan in competitie treden met de gunstige melkzuurbacteriën. Zij zijn ook in staat melkzuur te produceren, maar dit gebeurt minder efficiënt dan bij de melkzuurbacteriën. Bovendien worden tal van andere nevenproducten gevormd. Daarnaast zijn de enterobacteriën ook in staat om eiwitten af te breken door deaminatie en decarboxylatie, wat op zijn beurt een daling in voederwaarde teweeg brengt (Driehuis & Oude Elferink, 2000). Belangrijk hierbij is dat de afbraakproducten van deze eiwitten toxisch kunnen zijn, bijv. biogene aminen. Daarnaast wordt door proteolyse ook ammoniak gevormd. Specifiek voor de enterobacteriën is hun vermogen om nitraat (NO - 3 ) te reduceren tot nitriet (NO - 2 ). Vervolgens kan dit nitriet in het kuilvoeder worden afgebroken door andere enterobacteriën tot ammonium en N 2 O, of chemisch tot NO (Spoelstra, 1985, 1987). Wanneer NO op zijn beurt reageert met O 2 kunnen hierbij giftige, bruin-gele gasmengsels ontstaan, bestaande uit nitrogene oxiden. Bij inademing van deze gassen ontstaat een irritatie van het longweefsel met pneumonie-achtige symptomen ( silo filler s disease ) (Woolford, 1984). Contact van mensen en dieren met deze gassen moet dan ook vermeden worden. Dit kan door de gassen, indien mogelijk, op regelmatige tijdstippen te laten ontsnappen. Pagina 21

30 Naast deze ongunstige effecten van de enterobacteriën op het inkuilproces dient ook vermeld te worden dat NO 2 - en NO in kleine hoeveelheden een positief effect kunnen hebben, daar zij de groei en ontwikkeling van Clostridia spp. verhinderen (Spoelstra, 1985) Gisten Gisten zijn van nature aanwezig op het plantenmateriaal. Gisten zijn ééncellige, eukaryote micro-organismen. Bovendien zijn ze allen facultatief anaeroob en heterotroof. Omwille van hun specifiek metabolisme zijn de gisten niet gewenst bij het inkuilproces, waardoor hun groei en ontwikkeling bij voorkeur wordt geremd. Dit kan onder andere door gebruik te maken van additieven zoals azijnzuur (o.v.v. HeMZB) of mierenzuur (Kung Jr. et al., 2007; Oude Elferink et al., 2006). De gisten worden vaak beschouwd als de belangrijkste groep van micro-organismen die verantwoordelijk zijn voor de initiatie van het aeroob bederf (McDonald et al., 1991; Woolford, 1990). Het metabolisme van de gisten is sterk afhankelijk van de zuurstofconcentratie. Zo zullen in aerobe omstandigheden de gistcellen suikers en melkzuur aanwenden als energiebron waarbij water en koolzuurgas wordt geproduceerd. Dit heeft als gevolg dat de ph van de kuil stijgt waardoor andere bederfschimmels terug de kans krijgen te groeien (Woolford, 1990). Onder anaerobe omstandigheden zullen de gisten suikers omzetten tot ethanol en koolzuurgas (McDonald et al., 1991). Bij deze omzettingsprocessen wordt warmte geproduceerd waardoor broei kan worden geïnduceerd. Hierdoor zal ook door de gisten een competitie ontstaan met de melkzuurbacteriën voor de aanwezige suikers (Randby et al., 1999). De geproduceerde ethanol kan een smaakafwijking geven aan het voeder waardoor dit minder wordt opgenomen door de dieren (Whitlock et al., 2000). Ethanol kan ook een negatief smaakeffect hebben op de geproduceerde melk (Randby et al., 1999). Veel voorkomende gisten in kuilvoeders zijn soorten behorend tot de geslachten Candida, Endomycopsis, Hansenula, Pichia (Woolford, 1990), Saccharomyces en Torulopsis (Jonsson & Pahlow, 1984; Middelhoven & Baalen, 1988). Het gaat hierbij om zuurtolerante soorten. In sommige gevallen kunnen de gistpopulaties gedurende de eerste week van de inkuilperiode oplopen tot 10 7 cfu/g VS. Naar mate de bewaarduur vordert wordt er meestal een graduele afname in het aantal voorkomende gisten waargenomen (Driehuis & Van Wikselaar, 1996; Jonsson & Pahlow, 1984; Middelhoven & Baalen, 1988) Schimmels Schimmels zijn heterotrofe, obligaat aerobe en eukaryote micro-organismen. Er zijn heel wat schimmelsoorten die frequent voorkomen in kuilvoeders. Ze worden hierbij vaak terug gevonden in de bovenste lagen van de kuil (tijdens de stabiele fase) of tijdens de uitkuilfase tot ongeveer één meter achter het snijvlak. De aanwezigheid van schimmels is te herkennen Pagina 22

31 aan het voorkomen van mycelium. Dit zijn draadvormige structuren die gekleurde sporen bevatten en voorkomen op plaatsen waar zuurstof aanwezig is (Cheli et al., 2013). Schimmels zorgen voor een afbraak van organisch materiaal, waardoor dus een verlies in nutriënten optreedt (Lindgren et al., 1985). Anderzijds zal het rottend materiaal ook aanleiding geven tot een verminderde voederopname door de afwijkende smaak. Naast het veroorzaken van ademhalingsproblemen, zoals astma-allergieën, door de rondzwevende sporen, is ook de opname van met schimmels besmet voeder te vermijden (Adhikari et al., 2004; May, 1993). Dit voeder kan immers tal van door schimmels geproduceerde mycotoxinen bevatten, doch hun aanwezigheid is sterk variabel (zie hoofdstuk 1.3.2) (Frisvad et al., 2006). De opname van deze mycotoxinen kan aanleiding geven tot een verscheidenheid aan gezondheidsproblemen zoals zenuw- en leveraandoeningenen, een verminderde vruchtbaarheid en een suboptimale immuniteit (D'Mello et al., 1999; Fink- Gremmels, 2008b; Scudamore & Livesey, 1998; Wilkinson, 1999). Veel voorkomende schimmelgeslachten in kuilvoeders zijn Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Mucor, Alternaria, Byssochlamys, Geotrichum, Monascus en Scopulariopsis (Storm et al., 2008). Welke soorten deel uitmaken van de schimmelpopulatie hangt sterk af van verschillende omgevingsfactoren en kuilkarakteristieken (Ominski et al., 1994). Hierbij worden Fusarium, Aspergillus en Penicillium als de meest frequent koloniserende schimmels en producenten van mycotoxines beschouwd (Fink-Gremmels, 2005; Scudamore & Livesey, 1998; Storm et al., 2008). Het is dus van groot belang schimmelgroei en eventuele mycotoxineproductie in kuilvoeders te vermijden. Dit kan in belangrijke mate door het zuurstofniveau in het kuilvoeder tot een minimum ter herleiden. Het goed aandrukken en afdekken van het kuilvoeder zijn dus van essentieel belang. Ook het aanhouden van een voldoende hoge voedersnelheid en het gebruik van effectieve kuiladditieven (zie hoofdstuk 1.2) kan de schimmelgroei beperken. Pagina 23

32 1.2 Kuiladditieven Op heel wat melkveebedrijven worden kuilvoeders teruggevonden met een slechte aerobe stabiliteit. Oorzaken hiervan zijn terug te vinden in een te hoge inkuilsnelheid, het onvoldoende aanrijden van de kuil, een onvoldoende afname van de kuil bij het vervoederen of een slecht uitkuilmanagment (Kung et al, 2005). Op bedrijven waar broei vaak een probleem is, kan het toedienen van broeiremmers (additieven) aan het kuilvoeder verantwoord zijn. Dit is zeker het geval bij zomerkuilen die over het algemeen aan hogere omgevingstemperaturen zijn blootgesteld (De Brabander, 2013). Kuiladditieven kunnen ook worden aangewend wanneer, door het zich voordoen van bepaalde omstandigheden, het groenvoeder niet onder optimale omstandigheden kan worden geoogst (vb. een te laag DSgehalte bij gras) (Wilkinson & Stark, 1992). Op die manier kan toch een behoorlijke kwaliteit van het kuilvoeder bekomen worden. Het is echter niet mogelijk om van een slechte kuil een goede kuil te maken door enkel gebruik te maken van additieven. De kuiladditieven bestaan er dus vooral in de fermentatie- en bederfprocessen te controleren (UK Forage Additive Approval Scheme, 1995). Een ideaal kuiladditief dient de droge stof verliezen te beperken, de aerobe stabiliteit te verbeteren, veilig te zijn in gebruik, de nutritionele waarde van het voeder te verhogen en een economisch voordeel te bieden (Nkosi et al., 2009). Om een goede verzuring te verkrijgen kan gebruik gemaakt worden van bacterieculturen, voedingstoffen voor de melkzuurbacteriën (suikers) of organische zuren als dusdanig. Daarnaast kunnen ook enzymen aangewend worden om zo meer fermenteerbare voedingstoffen vrij te maken uit het plantenmateriaal (Kung, 2001). Tot slot dient ook het toevoegen van landbouwzout vermeld te worden. Dit zout heeft, door het creëren van een hogere osmotische druk, een conserverende werking (De Brabander, 2013). Het is echter zo dat goed conserveerbare producten, zoals kuilmaïs en voordroogkuil, vaak geen additieven behoeven. Onder goed conserveerbare producten worden groenvoeders verstaan die onder andere een voldoende hoog DS-gehalte bezitten, voldoende wateroplosbare koolhydraten bevatten en over een niet al te hoge concentratie eiwit beschikken. Een belangrijk aspect hierbij is de algemene trend om gras op het veld te gaan voordrogen (tot een DS-percentage tussen 35 en 45 %) alvorens in te kuilen. Dit maakt, in tegenstelling tot bij een natte graskuil, het gebruik van additieven overbodig (Spoelstra, 1990; Zimmer & Wilkins, 1984) Bacterieculturen als inoculant Inoculanten zijn biologische additieven op basis van micro-organismen. Hierbij komt de combinatie van voor het inkuilproces nuttige bacteriën met enzymen vaak voor (Kung, 2001). De meest gebruikte inoculanten wereldwijd zijn deze gebaseerd op MZB. Deze additieven zijn in staat de fermentatiekwaliteit te verbeteren en de DS-verliezen te beperken. Belangrijk Pagina 24

33 hierbij is uiteraard dat er voldoende fermenteerbare koolhydraten aanwezig zijn in het groenvoeder en dat de concentratie aan toegevoegd inoculant voldoende hoog is zodat de geïnoculeerde bacteriën de van nature aanwezige bacteriën domineren (Lindgren & Petterson, 1990; Spoelstra, 1991). Naast het onder controle houden van de microbiële ontwikkelingen tijdens het fermentatieproces (Weinberg & Muck, 1996) hebben de inoculanten ook het voordeel dat ze eenvoudig en veilig in gebruik zijn. Bovendien zijn ze niet-corrosief en hebben ze geen schadelijke gevolgen voor het milieu (Keles & Yazgan, 2011). Het effect van een inoculant kan echter sterk afhangen van jaar tot jaar doordat de kwaliteit van het geoogste groenvoeder, alsook het inkuilproces, in sterke mate kan bepaald worden door de weersinvloeden (Muck, 2004). Inoculanten kunnen zowel heterofermentatieve als homofermentatieve melkzuurbacteriën bevatten. Ook combinaties van beide groepen zijn mogelijk. Tot slot zijn er ook onderzoeken naar het gebruik van propionzuur producerende bacteriën als een mogelijks broeiremmend inoculant te vermelden. Dit omdat propionzuur een sterke schimmel- en gistwerende werking heeft (Moon, 1983; Woolford, 1975). Propionzuurbacteriën zoals Propionibacterium shermanii hebben de eigenschap suikers en melkzuur om te zetten tot azijn- en propionzuur (Higginbotham et al., 1998). Flores-Glarza et al. (1985) inoculeerden vochtig maïsgraan (73 % DS) met P. shermanii, al dan niet in combinatie met Lactobacillus plantarum. Het plantenmateriaal werd opgeslagen in kuilen op laboschaal. Uit het onderzoek bleek dat het kuilvoeder dat behandeld was met P. shermanii een beduidend lagere concentratie aan gisten vertoonde. Bovendien werden hogere aantallen MZB teruggevonden. Ook uit andere onderzoeken bleek dat het toevoegen van propionzuur aan een hoeveelheid van 2,5 % op DS-basis leidde tot een remming van de aerobe afbraak (Woolford, 1975) en broei (Hara & Ohyama, 1979; Huber & Soejono, 1976). Bolsen et al. (1996) konden besluiten dat maïskuilen, behandeld met 10 5 tot 10 6 cfu van Propionibacterium acidipropionici per gram VS, 24 tot 72 u langer aeroob stabiel waren dan onbehandelde maïskuilen of maïskuilen behandeld met MZB. Higginbotham et al. (1996) konden daarentegen geen positief effect van propionzuurbacteriën op de aerobe stabiliteit vaststellen. De homofermentatieve MZB, gekenmerkt door een sterke melkzuurproductie, zullen enerzijds zorgen voor een snelle ph-daling in de kuil en een verhoging van de verhouding melkzuur/azijnzuur (Kleinschmit et al., 2005). Anderzijds geven zij ook aanleiding tot een hogere aerobe afbraak door de relatief grotere hoeveelheden aan melkzuur en residuele wateroplosbare koolhydraten welke kunnen worden aangewend door gisten en schimmels als voedingsbron (Weinberg & Muck, 1996). Bovendien heeft melkzuur geen schimmelwerende werking. Door een gebrek aan deze antimycotische zuren zoals azijn- en propionzuur krijgen gisten en schimmels de kans om te ontwikkelen (Muck & Kung, 1997; Weinberg et al., 1993). Pagina 25

34 In tegenstelling tot de homofermentatieve MZB zorgen inoculanten op basis van heterofermentatieve MZB, zoals Lactobacillus buchneri, voor een verbetering van de aerobe stabiliteit (Muck, 1996; Weinberg et al., 2002). Dit is te wijten aan de productie van het schimmelwerende azijnzuur (Driehuis et al., 1999), waarvan de concentratie sterk positief gecorreleerd is met het aantal cfu aan Lactobaicllus buchneri per gram VS (Kleinschmit et al., 2005). Daarentegen worden kuilvoeders geïnoculeerd met dergelijke bacteriën gekenmerkt door een hoger DS-verlies en een hogere ph (Driehuis et al., 2001; Kleinschmit & Kung, 2006). Inoculanten die de combinatie bevatten van homo- en heterofermentatieve MZB hebben ook de voordelen van beide groepen. Adesogan et al. (2004) ondervonden dat deze zogenaamde dubbeldoel inoculanten de eigenschap hebben zowel de fermentatie als de aerobe stabiliteit te verbeteren. Ook onderzoek van Driehuis et al. (2001) bevestigde dit. Driehuis et al. (1997) onderzochten de invloed van inoculatie met Lactobacillus plantarum (HoMZB) en Enterococcus faecium (Pioneer Brand 1188, Pioneer Hi-Bred International) op graskuilen met een hoog DS-gehalte (40-60 %) en dit zowel op laboschaal als in de praktijk. Bij het behandelde kuilvoeder werd onder andere een snellere en sterkere ph-daling vastgesteld, wat overeenstemt met de studies van Honig & Pahlow (1986) en Potthast & Kleinmans (1991). Na drie weken bedroeg de ph reeds 4,1-4,2, terwijl bij de onbehandelde kuilvoeders na drie weken een ph-waarde werd vastgesteld van 5,5-6,0. Dit effect is ook zictbaar in Figuur 4, waarbij aangetoond wordt dat door toevoeging van HoMZB reeds een ph-waarde van 4,0 wordt bereikt binnen de drie dagen (Kung et al., 2007). De ph-waarde van de onbehandelde kuil bereikt pas later een scherpe daling, waarbij deze bovendien minder groot is. Het is zo dat bij een hogere DS-inhoud van het plantenmateriaal de wateractiviteit laag is. Dit inhibeert de groei van de MZB, wat op zijn beurt een trage fermentatiesnelheid tot gevolg heeft (Greenhill, 1964; Lanigan, 1963). Het toevoegen van de bacterieculturen heeft er dus toe geleid dat, ondanks het hoge DS-percentage van de kuilen, er toch een hoge fermentatiesnelheid werd bereikt. De kuilvoeders (gemeten na 90 en 180 dagen) vertoonden geen significante verschillen in chemische samenstelling (RA, WOK, ammoniak-n, etanol, azijn- en melkzuur). Wel werd in de behandelde kuilvoeders, naast een significant hogere concentratie aan melkzuur (en dus een lagere ph), ook een lagere concentratie aan ammonium-n terug gevonden. Ook de concentratie aan azijnzuur was beduidend lager in de behandelde kuilvoeders. Pagina 26

35 Figuur 4: Effect van inoculatie met homofermentatieve MZB op het ph-verloop (Kung et al., 2007). Lactobacillus buchneri is in dit opzicht een vrij bijzondere bacterie. Heel wat bacteriële inoculanten zijn gebaseerd op het toevoegen van L. buchneri aan het kuilvoeder, dit voornamelijk om zijn bijzondere eigenschap die de bacterie in staat stelt azijnzuur te produceren. Voor de productie van dit azijnzuur maakt L. buchneri gebruik van melkzuur als uitgangsproduct waarbij glycerol als een elektronenacceptor optreedt. Andere reactieproducten zijn CO 2 en 1,3-propanediol (Veiga da Cunha & Foster 1992). Een andere pathway waarop L. buchneri en verwanten melkzuur kunnen degraderen met de productie van azijnzuur als gevolg werd beschreven door Oude Elferink et al. (2000). Hierbij wordt onder anoxische omstandigheden melkzuur afgebroken tot azijnzuur met als nevenproducten 1,2- propanediol en ethanol. Bij deze pathway wordt er echter geen gebruik gemaakt van een externe elektronenacceptor. Tot slot zou het optreden van de melkzuurdegradatie, alsook de mate ervan, vooral afhankelijk zijn van de ph en de temperatuur van et kuilvoeder. Pagina 27

36 1.2.2 Substraten Het is mogelijk om nutriënten voor de zuurproducerende bacteriën toe te voegen aan het kuilvoeder. Dit gebeurt meestal onder de vorm van suikers. Hierbij is het belangrijk dat er voldoende melkzuurbacteriën aanwezig zijn om de aanwezige suikers om te zetten. Om die reden worden vaak combinaties gebruikt van MZB en suikers als onmiddellijk beschikbaar substraat. In de praktijk wordt meestal gebruik gemaakt van melasse. Melasse is een bijproduct van de suikerwinning uit suikerbieten en bevat ongeveer 50 % sucrose. Het probleem dat zich hierbij stelt is dat grote dosissen nodig zijn om een goed effect te bekomen. Zo zouden concentraties nodig zijn van 3 tot 4 % op DS-basis (Huisden et al., 2009). Dit betekent dat bij een natte graskuil met 16 % DS ongeveer 750 kg melasse nodig is per hectare en per snede (De Brabander, 2013). Uit het onderzoek van Huisden et al. (2009) werd teruggevonden dat kuilvoeders waaraan melasse werd toegevoegd hogere gehaltes aan as en zetmeel hadden dan de onbehandelde controle. Dit hoger zetmeelgehalte kan te wijten zijn aan de verminderde nood aan hydrolyse van het aanwezige zetmeel door de aanwezigheid van de gemakkelijk fermenteerbare sucrose uit melasse. Door toevoeging van melasse wordt ook de concentratie aan ethanol en melkzuur in de kuil verhoogd (Adesogan et al., 2004; Huisden et al., 2009; McDonald et al., 1991). Ethanol wordt geproduceerd door de HeMZB uit de aanwezige suikers en is qua kuilverzuring eerder ongewenst daar het de melkzuurproductie remt (Rooke & Hatfield, 2003). Belangrijk is dat melasse geen enkele invloed blijkt te hebben op het aantal voorkomende gisten en schimmels die bederf kunnen veroorzaken, waardoor het dus niet kan aangewend te worden als een echte broeiremmer (Huisden et al., 2009) Zuren Andere kuiladditieven kunnen bestaan uit het toevoegen van zuren of hun zouten. Deze producten met een schimmelwerende werking zijn vaak op basis van propionzuur, azijnzuur, mierenzuur, ammoniumpropionaat of natriumbenzoaat (Latré & Wambacq, 2009). Ze kunnen gebruikt worden als een oppervlakkige behandeling van de kuil waarbij enkel de buitenste lagen worden bespoten. Propionzuur is vrij populair in gebruik, daar het een korteketenvetzuur is met een hoge antimycotische activiteit. Te hoge concentraties aan propionzuur toevoegen heeft echter nadelige effecten op de natuurlijke melkzuurfermentatie. Propionzuur is bovendien sterk corrosief en dus niet eenvoudig in gebruik. Een oplossing voor deze problemen bestaat er in gebruik te maken van afgeleide zouten zoals ammonium-, calcium- en natriumpropionaat. De werkingsefficiëntie van deze zouten is sterk gerelateerd met de oplosbaarheid ervan. Slecht oplosbare zouten, zoals calciumpropionaat, zijn dan ook minder efficiënt in het remmen van schimmelgroei. Kung et al. (1998) vonden een verhoging van de aerobe stabiliteit in maïskuilen wanneer deze behandeld werden met een op propionzuur gebaseerd additief met een dosis van 0,2-0,3 % op Pagina 28

37 het vers geoogst gewicht. Ook de voedingsadditieven natriumbenzoaat en kaliumsorbaat hebben bewezen een inhiberend effect te bezitten op de groei en ontwikkeling van gisten en schimmels (Woolford, 1975). Dit effect is te wijten aan de ongedissocieerde vorm van het zout die de mogelijkheid heeft de celmembranen van de micro-organismen te doordringen. Vervolgens worden in de cel protonen vrijgesteld waardoor er een verzuring plaatsvindt die de dood van de cel als gevolg heeft (Buxton et al., 2003). Over het gebruik van natriummetabisulfiet als additief zijn de resultaten niet eensluidend. In een studie van Kleinschmit et al. (2005) werd geen verbetering van de aerobe stabiliteit van de maïskuilen vastgesteld, in overeenstemming met het onderzoek van Soderlund et al. (1983). Alli & Baker (1982) daarentegen rapporteerden dat een concentratie van 0,5 % natriummetabisulfiet de microbiële activiteit inhibeerde en de concentratie aan wateroplosbare koolhydraten verhoogde. Tijdens het inkuilproces wordt natriummetabisulfiet afgebroken tot onder andere zwaveldioxide, wat een sterke antimycotische werking heeft. Het is bovendien een sterk reducerende verbinding die gebruik maakt van zuurstof. Hierdoor wordt de tijdsduur van de aerobe fase sterk verkort (McDonald et al., 1991) Enzymen Enzymen worden toegevoegd aan het groenvoeders om de structuurcomponenten van het plantenmateriaal af te breken. Een belangrijke structuurcomponent in dit opzicht is cellulose, welke een polymeer van glucose-eenheden is. Ook lignine en hemicellulose behoren tot de groep van de plantenvezels. Cellulose als dusdanig is weinig fermenteerbaar door de aanwezige MZB. Wanneer echter door enzymen, zoals cellulase, deze cellulosemoleculen afgebroken worden tot hun afzonderlijke wateroplosbare bouwstenen kunnen deze aangewend worden als substraat voor de fermentatie (Kung, 2001). Uit het onderzoek van Chamberlain & Robertson (1992) bleek dat na toevoeging van enzymen aan een graskuil het gehalte aan NDF en ADF significant lager lag dan bij de controlebehandeling. Dit was echt niet het geval bij maïskuilen (Chen et al., 1994). De toevoeging van enzymen in gevallen waar er een gebrek bestaat aan gemakkelijk fermenteerbaar substraat zal leiden tot verbeterde fermentatieeigenschappen, zoals een lagere ph (Chen et al., 1994; Fredeen & McQueen, 1993), minder azijnzuur (Narasimhalu et al., 1992) en meer melkzuur (Stokes, 1992). Chamberlain & Robertson (1992) rapporteerden deze verbeteringen ook in gevallen waarbij er voldoende substraten aanwezig waren; dit is in overeenstemming met de bevindingen van Chen et al. (1994) en Sheperd & Kung (1996b). Bovendien kan deze voorvertering door toegevoegde enzymen ook de dierlijke prestaties positief beïnvloeden, daar de pensvertering wordt bevorderd (Sheperd & Kung, 1996a). Toch zijn de resultaten uit de literatuur hieromtrent vrij tegenstrijdig. Zo vond Stokes (1992) dat de in vitro DS-verteerbaarheid van luzerne toenam wanneer deze werd ingekuild met een enzymenmix van cellulase, xylanase, cellobiase en glucose oxidase als additief. Ook Pagina 29

38 Chamberlain & Robertson (1992) konden een verhoging in de organische stof verteerbaarheid waarnemen van een met cellulase/hemicellulase behandelde graskuil. Dit in tegenstelling tot Chen et al. (1994) waar door toevoeging van cellulase, xylanase, amylase en pectinase aan maïskuilen geen toename in de DS-verteerbaarheid werd waargenomen. Bij het onderzoek van Sheperd & Kung (1996a), waarbij een maïskuil behandeld werd met cellulase en hemicellulase, werd geen significant verschil in DS-opname waargenomen ten opzichte van het onbehandeld kuilvoeder. Ook de melkproductie en -samenstelling verschilden niet significant. Young et al. (2012) konden de zetmeelverteerbaarheid van maïskuilen verhogen door middel van gebruik te maken van exogene protease enzymen. Het toevoegen van dergelijke exogene enzymen resulteerde ook in een hogere concentratie wateroplosbare eiwitten en ammoniakstikstof. De aanleiding voor dit onderzoek bestond er in dat de zetmeelverteerbaarheid van maïs toenam naarmate deze langer werd ingekuild (Benton et al., 2005; Newbold et al., 2006). De van nature aanwezige proteolytische activiteit (chemisch, plantaardig en microbieel) zou aan de basis liggen van dit fenomeen (Hoffman et al., 2011). Door proteolyse worden namelijk de proteïnen afgebroken waardoor het zetmeel vrijkomt uit de proteïne-zetmeel complexen die aanwezig zijn in maïs Nutriënten en secundaire groenvoeders als absorbentia In sommige situaties kan het aangewezen zijn bepaalde voedingscomponenten toe te voegen aan het kuilvoeder om zo de nutritionele waarde ervan te verhogen. Daar hoogproductief melkvee nood heeft aan een behoorlijke eiwitopname kan het toevoegen van stikstof onder de vorm van ureum of ammonium aan te raden zijn. Dit kan bijvoorbeeld gebeuren bij het inkuilen van gras met een lage eiwitwaarde. Belangrijk hierbij is dat het ureum zodanig over de kuil wordt verspreid dat er een geleidelijke adaptatie mogelijk is van het melkvee (De Brabander, 2013). Andere componenten die kunnen worden toegevoegd zijn kalksteen, magnesiumsulfaat en landbouwzout. Zij kunnen zorgen voor een verhoging van resp. het calcium-, magnesium- en natriumgehalte van het rantsoen. Landbouwzout wordt vaak aangereikt met jodium, wat een essentieel element is voor een goede schildklierwerking. In tegenstelling tot kalksteen en magnesiumsulfaat hebben landbouwzout, ureum en ammonium wel een positieve invloed op het inkuilproces. Zo zouden ureum en ammonium de aerobe stabiliteit bevorderen (McDonald et al., 1991). Toevoeging van landbouwzout aan het kuilvoeder (1,5-2 % op verse stof) zou zorgen voor een hogere osmotische waarde, waardoor een betere bewaring wordt verkregen. Op die manier kan voor een natte graskuil behandeld met landbouwzout een gelijkaardige voederwaarde bekomen worden als voor een voordroogkuil (De Brabander, 2013). Bovendien zorgt de zouttoevoeging, door zijn verhoogde smakelijkheid, voor een toename in DS-opname door het vee (Hengeveld, 1980). Pagina 30

39 Absorbentia zijn in principe ruwvoeders met een hoog DS-gehalte die samen ingekuild worden met vochtige producten. Mochten deze vochtige producten afzonderlijk ingekuild worden, zou dit leiden tot aanzienlijke sapverliezen met een lage voederwaarde als gevolg. Voorbeelden van absorbentia zijn droge pulp van bieten of citrusvruchten en stro. Hierbij heeft de bieten- of citruspulp nog een behoorlijke nutritionele waarde, dit in tegenstelling tot stro (McDonald et al., 1991). Daarnaast kan ook gebruik gemaakt worden van mengkuilen. De combinatie van bieten of aardappelen met maïs geeft vaak goede resultaten. Op die manier worden de perssapverliezen van de gemalen bieten en aardappelen beperkt en ligt de arbeidsintensiteit lager. Belangrijk is dat de maïs in dit geval bij voorkeur iets rijper geoogst wordt zodat deze een hoger DSpercentage heeft. Een goede verdeling van de bieten- of aardappelstukken over de maïskuil beperkt bovendien de selectie door het vee. Tot slot kan een grote grondverontreiniging van de aardappelen of bieten echter zorgen voor een lagere voederwaarde (De Brabander, 2013). Pagina 31

40 1.3 Schimmels Goede inkuilomstandigheden en -praktijken zijn er op gericht een goede conservering te krijgen van het groenvoeder. Een voldoende snelle en sterke ph-daling en korte aerobe fase zijn hierbij van belang opdat de groei en ontwikkeling van ongewenste, nutriëntverbruikende micro-organismen zou geremd worden. Vaak kunnen de bovenste lagen van het kuilvoeder onvoldoende worden aangedrukt, waardoor bepaalde ongewenste micro-organismen (waaronder schimmels) de kans krijgen zich te ontwikkelen. Zij zorgen voor een afbraak zorgen van het plantenmateriaal, met een verlies aan voederwaarde als gevolg. Daarnaast zijn ze ook in staat om mycotoxinen te produceren die schadelijk kunnen zijn voor zowel mens en dier (Korosteleva et al., 2009; Scudamore & Livesey, 1998) Veld- en bewaarschimmels Schimmels kunnen met betrekking tot hun aanwezigheid op groenvoedergewassen ingedeeld worden als veld- en bewaarschimmels, waarbij de infectie respectievelijk pre- en post-harvest gebeurt (Coulombe, 1993; Scudamore & Livesey, 1998; Storm et al., 2008). De veldschimmels zijn deze schimmels die zich ontwikkelen op gewassen op het veld. Belangrijke invloedsfactoren die de aanwezigheid en ontwikkeling van deze schimmels bepalen zijn vooral weersomstandigheden (vochtigheid en temperatuur), maar ook teelttechnische maatregelen zoals bodembewerking, bemesting en teeltrotatie. De belangrijkste veldschimmels zijn Fusarium spp. en Alternaria spp.. Daarnaast zijn er de bewaarschimmels die vooral groeien tijdens de bewaring van de groenvoedergewassen. Soorten van de geslachten Penicillium en Aspergillus worden beschouwd als de belangrijkste bewaarschimmels. De indeling van schimmels in bewaar- of veldschimmels is echter niet absoluut. Zo worden ook bepaalde Aspergillus spp. en Penicillium spp. pre-harvest aangetroffen en kunnen Fusarium spp. ook post-harvest gedetecteerd worden (Mansfield & Kuldau, 2007). Anderzijds zijn er wel specifieke groei-eigenschappen toe te schrijven aan beide groepen. Zo hebben Penicillium- en Aspergillussoorten de eigenschap te groeien bij lagere a w -waarden en hogere temperaturen dan Fusarium spp. (Magan et al., 2003; Reyneri, 2006). Uit onderzoek van Mansfield & Kuldau (2007) bleek dat kuilvoeder mycotoxinen kan bevatten afkomstig van zowel veld- als bewaarschimmels. Zo werden in de onderzochte stalen maïskuilvoeder Fusarium-mycotoxinen aangetroffen, terwijl er geen levende Fusariumspecies konden worden geïsoleerd. Ook onderzoek van Baath et al. (1990) en Garon et al. (2006) bevestigde dit. Pagina 32

41 Het onderzoek van Keller et al. (2013) bestond erin een risico-analyse uit te voeren met betrekking tot de aanwezigheid van schimmels en mycotoxinen. Hiervoor werden 464 maïskuilvoederstalen in Brazilië voor en na de fermentatie geanalyseerd. Uit het onderzoek bleek dat het totaal aantal geregistreerde schimmels hoger lag in de post-harvest- dan in de pre-harveststalen. Bovendien lag het totaal aantal schimmels in 70 % van de postharveststalen hoger dan de aanbevolen kwaliteitsstandaard voor veevoeders (1 x 10 4 cfu/g) (GMP, 2008). Dit in tegenstelling tot 25 % van de pre-harveststalen. Tot slot was er ook een verschil in soortensamenstelling in beide types stalen. Keller et al. vonden namelijk dat soorten als Aspergillus flavus en A. fumigatus in hogere aantallen aanwezig waren in postharveststalen. Anderzijds waren de soorten Penicillium griseofulvum, P. funiculosum en Fusarium graminearum enkel terug te vinden in de pre-harveststalen Mycotoxinen in kuilvoeders Zoals reeds eerder vermeld kan schimmelmassa secundaire metabolieten produceren die al dan niet toxische effecten kunnen hebben: "mycotoxinen". Omtrent de condities waaronder mycotoxinen geproduceerd worden is nog veel onduidelijkheid. Algemeen kan gezegd worden dat de mycotoxineproductie afhankelijk is van de schimmelsoort (Frisvad et al., 2008), het betreffende isolaat (Andersen et al., 2008; Frisvad et al., 2009; O'Brien et al., 2006), het groeimedium en de omgevingsfactoren (Frank, 1998; Furtado et al., 2002). De meeste schimmels zijn in staat een reeks van specifieke mycotoxinen te produceren. Het is echter niet zo dat het voorkomen van een bepaalde schimmelsoort ook aanleiding geeft tot de aanwezigheid van al zijn toxinen (Auerbach, 1996; Nout et al., 1993). Scudamore et al. (1998) toonden aan dat wanneer een bepaald mycotoxine kon worden geïdentificeerd in het kuilvoeder, er vaak ook verscheidene andere mycotoxinen voorkwamen en het dus zelden om één enkel mycotoxine ging. Bovendien is een hoge concentratie aan toxigene schimmels niet onlosmakelijk verbonden met een hoge concentratie aan mycotoxinen (Cheli et al., 2013). Anderzijds is er geen garantie dat visueel niet-beschimmeld voeder ook geen mycotoxinen bevat. Omtrent onderzoek naar het voorkomen van mycotoxinen op verschillende plaatsen in het kuilvoeder zijn de resultaten vrij inconsistent. Zo vonden Richard et al. (2007) in een onderzoek naar Fusarium-toxinen significant hogere deoxynivalenol-concentraties (DON) in de bovenste lagen van de maïskuil, terwijl in een andere studie juist hogere DONconcentraties onderaan de kuil gevonden werden (Richard et al., 2009). Een onderzoek van Driehuis et al. (2008a) gaf dan weer geen significante verschillen in DON-concentraties in de bovenste of onderste lagen weer. Daarnaast konden Pereyra et al. (2008) aantonen dat ook Aspergillus fumigatus het meest voorkomt in het middelste en bovenste gedeelte van een maïskuil. Dit in tegenstelling tot het onderzoek van Richard et al. (2007) dat uitwees dat de aanwezigheid van A. fumigatus gecorreleerd is met de aanwezigheid van het toxine gliotoxin Pagina 33

42 en dit onderaan in de kuil. De verschillen in microaërofiele omstandigheden, vochtigheid en ph kunnen een verklaring vormen voor deze inconsistente resultaten. Zo vonden Pereyra et al. (2008) in maïskuilen a w -waarden die varieerden van 0,93 tot 0,98 en ph-waarden tussen 3,9 en 5,8. Bovendien dient er op gewezen te worden dat het inkuilproces voornamelijk gecontroleerd wordt door de landbouwer, wat kan aanleiding geven tot verschillende kuilomstandigheden en -kwaliteit (Cheli et al., 2013) Pre-harvestfactoren Heel wat omgevingsinvloeden kunnen aanleiding geven tot een verhoogde infectie van het gewas tijdens de veldperiode, bijv.: temperatuurvariaties, vochtigheid, droogte, insectenschade,... Deze factoren veroorzaken een verhoogde stresstoestand van de plant, waardoor de ziektegevoeligheid sterk toeneemt. Bijgevolg zal ook de ernst van de mycotoxinecontaminatie in belangrijke mate door deze factoren bepaald worden (Mansfield et al., 2005; Reyneri, 2006). Ook teelttechnische maatregelen kunnen uiteraard hun invloed hebben (Cotty & Jaime-Garcia, 2007; Coulombe, 1993; Hussein & Brasel, 2001). Dit alles geeft aan dat de aanwezigheid van mycotoxinen in groenvoeders sterk afhankelijk zal zijn van de jaarsituatie. Dit wordt gestaafd met de resultaten van het onderzoek van Mansfield et al. (2005, 2008), waarbij de invloeden van de weersomstandigheden en de teeltmaatregelen op de aanwezigheid van mycotoxinen werden nagegaan. Hierbij werden significant verschillende concentraties aan DON terug gevonden in stalen van twee opeenvolgende jaren. Bovendien kon onder andere een goede correlatie gevonden worden tussen DON-concentraties en de gemiddelde dagtemperatuur. Ook fysische schade aan het te oogsten gewas door hagel, vogels of insecten leiden tot hogere mycotoxineconcentraties, afhankelijk van het tijdstip van de beschadiging voor de oogst (Teller et al., 2012). Dit is vooral te wijten aan de gunstige situatie voor schimmels die via de wonden het plantenweefsel kunnen penetreren. Computermodellen op basis van de factoren temperatuur, regen en insectendruk zouden een goede voorspelling geven van de te verwachten mycotoxineconcentraties in maïs voor de oogst (Dowd, 2004). Wanneer echter meer factoren in rekening worden gebracht, kan de voorspelling nauwkeuriger gebeuren. Munkvold (2003) voegde onder andere ook de factoren maïscultivar en plantdatum toe aan het predictiemodel. Hieruit kon besloten worden dat de meeste modellen de mogelijkheid geven om risicosituaties met betrekking tot hoge mycotoxineniveaus vroegtijdig aan te duiden. Pagina 34

43 Post-harvestfactoren De belangrijkste na-oogstfactoren die het mycotoxinegehalte in het kuilvoeder kunnen drukken zijn een goede fermentatie, lage zuurstofconcentratie en goede inkuilomstandigheden (Johansson et al., 2005; Mansfield & Kuldau, 2007; McDonald et al., 1991; Tapia et al., 2005). Deze factoren zorgen voor een aangepast microklimaat waarbij de groei van ongewenste micro-organismen wordt geremd. Er zijn echter verscheidene schimmels die zich hebben aangepast aan deze condities en die er zich dan ook kunnen ontwikkelen (Mansfield & Kuldau, 2007); voorbeelden hiervan zijn Aspergillus fumigatus, Byssochlamys nivea, Monascus spp. en Penicillium roqueforti s.l. (Boysen et al., 2000; El-Shanawany et al., 2005; Pereyra et al., 2008). Veldschimmels zoals Fusarium sporotrichioides, F. avenaceum en F. graminaerum zijn slechts weinig bestand tegen de lage zuurstofconcentratie en de lage ph van het kuilvoeder, waardoor deze dan ook slechts in geringe mate terug te vinden zijn. Zo werd in een studie van Damoglou et al. (1984) 15 dagen na inkuilen slechts 1 % van de geïnoculeerde concentratie aan F. roseum en F. tricinctum terug gevonden. Mansfield en Kuldau (2007) onderzochten in Pennsylvania zowel verse als ingekuilde maïsstalen en vonden geen levensvatbare Fusaria terug in de ingekuilde stalen. Daarentegen konden Richard et al. (2007) en Gonzales Pereyra et al. (2008) wel Fusarium spp. terug vinden in maïskuilen. Ook het fermentatiepatroon is van belang bij het voorkomen van schimmels en hun mycotoxinen. Zo hebben propion- en boterzuur een groter remmend effect op scimmelgroei dan azijn- of melkzuur. Dit is onder andere de reden waarom kuilvoeders met een hogere concentratie boterzuur ook een hogere aerobe stabiliteit bezitten (Cheli et al., 2013). Belangrijk in dit opzicht is de aanwezigheid van organische zuren onder hun ongedissocieerde vorm, wat uiteraard afhankelijk is van de omgevings-ph en van de pka-waarde van het zuur. Deze ongedissocieerde vorm is in staat om de celwand van de schimmel beter te penetreren, waarna intracellulair een dissociatie plaatsgrijpt. Dit kan uiteindelijk leiden tot het afsterven van de schimmel (Müller & Schwardorf, 1990) Effect van het inkuilproces op de aanwezigheid van mycotoxinen Over het algemeen worden mycotoxinen niet afgebroken tijdens het inkuilproces. Toch zijn er waarnemingen die het tegendeel bewijzen. Het gaat hier dan vooral om de veldtoxines. Zo kunnen sommige toxinen (zie verder) afgebroken worden onder invloed van de anaerobe verzuring. Deze afbraak is bovendien positief gecorreleerd met de bewaartijd en afhankelijk van de zuurgevoeligheid van de verschillende mycotoxinen (Fink-Gremmels, 2005). Boudra & Morgavi (2008) vonden enerzijds een significante vermindering van de Fusariumtoxinen DON, fumonisinen B1 en B2 en zearalenone (ZEA). De stabiliteit van deze toxinen werd onder andere negatief beïnvloed door een langere bewaartijd en een lager DS-gehalte (24 en 28 % t.o.v. 37 en 42 %) van het in te kuilen groenvoeder. Anderzijds werd er geen Pagina 35

44 invloed van de temperatuur waargenomen. In tegenstelling tot deze waarnemingen vonden Lepom et al. (1988) dat de concentratie ZEA onveranderd bleef gedurende het inkuilproces. Pereyra et al. (2008) vonden dan weer hogere concentraties DON terug in de ingekuilde stalen. Een mogelijke verklaring hiervoor kan terug te vinden zijn in het feit dat Fusariumschimmels wel in staat zijn te groeien aan het buitenoppervlakte van het ingekuilde groenvoeder, alsook in zuurstofbevattende holten (Lepom et al., 1990). Ook voor Aspergillus-toxinen (gliotoxine, fumagilline, en verruculogen) werd een geleidelijke degradatie waargenomen gedurende de inkuilperiode (Kalac & Woodford, 1982). Uit het onderzoek van Boudra & Morgavi (2005) met geïnoculeerde graskuil werd een vrij goede stabiliteit van de toxinen waargenomen met uitzondering van het fumagilline, dat na acht weken een afname van 90 % kende. Hier werd echter geen invloed van het DS-gehalte terug gevonden. Voor verschillende Penicillium-toxines, zoals roquefortine C, patuline, mycofenolzuur, P. roqueforti-toxine (PR-toxine) en penicillinezuur (Ohmomo & Kitamoto, 1994; Schneweis et al., 2000), werden door Mansfield et al. (2008) en Garon et al. (2006), in tegenstelling tot de verse maïsstalen, hogere concentraties teruggevonden in de ingekuilde stalen. Dit wijst erop dat de Penicillium-toxines zowel op het veld als tijdens het inkuilproces kunnen worden geproduceerd De invloed van mycotoxinen op melkvee en hun productie In de gangbare landbouw bestaat het belangrijkste deel van het melkveerantsoen uit ruwvoeders, waarbij vooral maïs- en graskuil worden aangewend. De dieren nemen dus dagelijks aanzienlijke hoeveelheden kuilvoeder op. Deze kuilvoeders kunnen bovendien besmet zijn met schimmels en hun mycotoxinen, wat een invloed zal hebben op de gezondheid van de koe (Bennett & Klich, 2003; Kalac & Woolford, 1982). Het is algemeen geweten dat veel van deze mycotoxinen carcinogene, mutagene, neurotoxische, hepatotoxische, oestrogene, immunosupressieve, antimicrobiële (Scudamore & Livesey, 1998) of acuut toxische effecten kunnen hebben (Chen et al., 1982). De symptomen bij inname van hoge dosissen mycotoxines kunnen variëren van voederweigering, geboorteafwijkingen, abortus, nier-, lever- en longbeschadiging tot in ernstige gevallen zelfs de dood (Scudamore & Livesey, 1998). Algemeen wordt een intoxicatie met mycotoxines aangeduid met de term mycotoxicose. Acute intoxicaties die de dood als gevolg hebben zijn eerder zeldzaam van aard (Yiannikouris & Jouany, 2002). Daarentegen zijn chronische intoxicaties waarbij de dieren gedurende een bepaalde periode kleinere hoeveelheden van verschillende mycotoxines opnemen vaker voorkomend. Hierbij ontstaan niet-specifieke symptomen, zoals een verzwakt immuunsysteem met als gevolg meer infecties of verstoringen van het metabolisme en de hormoonbalans (Fink-Gremmels, 2008a; Morgavi & Riley, 2007). Zoals eerder aangehaald bevat het voeder vaak een combinatie van verschillende mycotoxines. Een Pagina 36

45 synergistisch effect bij een gelijktijdige blootstelling is dan ook niet uitgesloten (Bouslimi et al., 2008). Uiteraard zullen deze effecten ook een negatieve invloed hebben op het economisch resultaat van de bedrijfsvoering. De landbouwer heeft er dus alle baat bij de concentratie aan mycotoxinen in het kuilvoeder te drukken. Bovendien kunnen bepaalde mycotoxinen via de veevoeding in de melk overgaan en aldus in de menselijke voedselketen terecht komen (Fink-Gremmels, 2008b; Miller, 2008). Het belangrijkste voorbeeld hierbij is het aflatoxine B 1 dat als het kankerverwekkend metaboliet aflatoxine M 1 in de melk terecht komt (Corbett et al., 1988). Andere toxines zoals trichotecenen (o.a. DON) en ZEA hebben eerder een effect op het immuunsysteem van het vee (Black et al., 1992). Vergeleken met monogastrische dieren zijn herkauwers vrij tolerant ten opzichte van de mycotoxinen (EFSA, 2004a, 2004c, 2005). De oorzaak hiervan is voornamelijk terug te vinden in de penswerking en de aanwezigheid van een grote hoeveelheid micro-organismen in de pens die instaan voor een biotransformatie van de toxines (He et al., 1992). Echter niet alle mycotoxinen worden op dezelfde manier afgebroken of getransformeerd tot minder toxische componenten. Sommige worden juist omgezet naar meer toxische bestanddelen. Zo wordt het ochratoxine A in grote mate afgebroken tot het minder schadelijke ochratoxine α (EFSA, 2004b), wordt het fumonisine B 1 totaal niet aangetast door de pensmicroben (EFSA, 2005) en wordt ZEA gemetaboliseerd tot het meer toxische α-zearalenol wat een sterk oestrogeenverstorend effect heeft (EFSA, 2004c). De penswerking kan dus ook een negatief effect hebben op de invloed van mycotoxinen op de diergezondheid. Bovendien zijn er heel wat mycotoxines die zich gedragen als antimicrobiële metabolieten en die aldus de penswerking zullen verstoren. Voorbeelden van dergelijke toxines zijn patuline (Tapia et al., 2002), mycofenolzuur (Bentley, 2000), citrinine (Wang et al., 2004) en roquefortine C (Kopp & Rehm, 1979). Een verstoorde penswerking zal uiteraard een sterk negatief effect hebben op de melkproductie van de koe, waardoor terug economische verliezen worden geleden. De negatieve effecten zijn bovendien meer uitgesproken bij hoogproductieve dieren, mede dankzij de hogere productiestress (Jouany & Diaz, 2005). Driehuis et al. (2008) maakten in Nederland een uitgebreide studie om een schatting te maken van de totale dagelijkse opname van mycotoxines door melkvee via het rantsoen. Hierbij werden 169 voederstalen van 24 melkveebedrijven gespreid over Nederland onderzocht op de aanwezigheid van 20 verschillende mycotoxinen. De vier belangrijkste mycotoxinen waren in dalende mate van voorkomen deoxynivalenol (DON), zearalenone (ZEA), roquefortine C (ROC) en mycofenolzuur (MPA). De gemiddelde concentraties van de verschillende toxines die werden aangetroffen in complete rantsoenen bedroegen respectievelijk 273, 28, 114 en 54 µg/kg DS. Maximum waarden bedroegen respectievelijk 969, 203, 2211 en 1840 µg/kg (Tabel 1). Hierbij werden DON en ZEA het meest frequent aangetroffen in kuilstalen en mengvoeders en dit vaak als een combinatie van beide. ROC en MPA werden uitsluitend teruggevonden in ingekuilde voeders. Geen van de toxinen overschreed echter de Pagina 37

46 concentratienorm voor kuilvoeders bestemd voor melkvee die opgesteld is door de Europese Commissie (2006) (Voor ZEA = 500 µg/kg en voor DON = 5000 µg/kg). Wel waren de concentraties aan ROC en MPA aanzienlijk hoger in stalen van zichtbaar beschimmeld kuilvoeder. Bovendien werden de hoogste concentraties aan mycotoxinen aangetroffen in maïskuilen. Graskuilen waren een eerder beperkte bron van ZEA, ROC en MPA, terwijl DON helemaal niet kon worden teruggevonden. Tabel 1: De concentraties van mycotoxinen in het rantsoen en de dagelijkse inname door melkvee van DON, ZEA, ROC en mycofenolzuur (Driehuis et al., 2008). Pagina 38

47 1.4 Penicillium roqueforti s.l. als meest voorkomende schimmel in kuilvoeders Systematiek Rijk: Stam: Klasse: Onderklasse: Orde: Familie: Geslacht: Soort: Penicillium roqueforti s.l. wordt vaak aangetroffen als de meest voorkomende schimmel in kuilvoeders en dit vooral in streken met een gematigd klimaat (Boysen et al., 2000; Nout et al., 1993; O'Brien et al., 2005; Ohmomo & Kitamoto, 1994; Pelhate, 1975; Skaar, 1996). Het is een schimmel die zich heeft aangepast aan de kuilcondities. Eenmaal de schimmel start met zijn groei op plaatsen met gunstige omgevingsvoorwaarden ( hot-spots ), kan een snelle verspreiding over de volledige kuil plaatsvinden (Lacey & Magan, 1991). De schimmel P. roqueforti s.l. is te herkennen aan zijn specifieke stroma- en koloniemorfologie. Raper et al. (1968) beschreven P. roqueforti s.l. kolonies op Czapek's medium. Specifieke eigenschappen zijn het wit, sterk spreidend en filamenteus mycelium met aan de bovenzijde groene conidia. Deze groen tot blauwe sporen zijn vaak ook het herkenningspunt voor een aantasting in praktijkkuilen, de zogenaamd blauwe bollen (Figuur 5). De koloniemorfologie kan echter beïnvloed worden door het medium waarop het isolaat wordt uitgezet, wat een goede beschrijving van de groeicondities noodzakelijk maakt (Samson & Gams, 1984). Het stroma zelf is te determineren aan de hand van de typisch fibrillaire condidioforen die instaan voor de productie van de aseksuele sporen (Samson & Gams, 1984). Fungi Ascomycota Eurotiomycetes Eurotiomycetidae Eurotiales Trichocomaceae Penicillium P. roqueforti s.s. P. paneum Figuur 5: Maïskuil aangetast door P. roqueforti s.l. De soort Penicillium roqueforti s.l. werd aanvankelijk geacht een gedefinieerde soort te zijn. Recentelijk wordt echter een onderscheid gemaakt tussen drie subspecies, namelijk P. roqueforti s.s., P. paneum en P. carneum. Aanleiding tot deze opsplitsing was de vergelijking van de ribosomale en β-tubuline DNA-sequenties en RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) en secundaire metabolieten profielen (Boysen et al., 1996; Nielsen et al., 2006; Samson et al., 2004). De frequentie van voorkomen is sterk verschillend tussen de drie Pagina 39

48 soorten. Zo werden bij een analyse van ingekuilde grasbalen in Ierland door O'Brien et al. (2005, 2007, 2008a) P. roqueforti s.s.en P. paneum aangetroffen in frequenties van respectievelijk % en 4-5 %. Sumarah et al. (2005) rapporteerden dan weer dat P. paneum vaker wordt aangetroffen in graskuilen en dat P. roqueforti s.s. de bovenhand heeft in maïskuilen. Dit terwijl P. carneum veeleer geassocieerd wordt met vlees-, kaas- en broodproducten en nauwelijks met kuilvoeders (Frisvad & Samson, 2004). Omtrent P. paneum zijn er voorlopig slechts enkele rapporten die de aanwezigheid van deze schimmel in kuilvoeder vermelden (Boysen et al., 2000; Mansfield & Kuldau, 2007; Sumarah et al., 2005). Een mogelijke oorzaak hiervoor kan terug te vinden zijn in het feit dat P. paneum vaak incorrect wordt geclassificeerd als P. roqueforti s.s. (O'Brien et al., 2008b). Micromorfologisch zijn P. paneum en P. roqueforti s.s. nagenoeg niet te onderscheiden (Frisvad & Samson, 2004). Daarentegen is er macromorfologisch wel een onderscheid mogelijk. Zo vertoont de onderkant van een P. roqueforti s.s.-kolonie, geënt op een Czapek Yeast Autolysaat agar (CYA) (gedurende 7 dagen bij 25 C), een zwart tot groene kleur (Figuur 6). Een kolonie van P. paneum is dan weer eerder te herkennen aan zijn beige tot bruin gekleurde onderkant en de aanwezigheid van exudaatdruppels (na 7 dagen bij 25 C) (Figuur 7) (Frisvad & Samson, 2004). Bovendien vond O'Brien et al. (2008b) dat P. paneum wordt gekenmerkt door een snellere groei op de media CYA, Yeast Extract Sucrose agar (YES) en Malt Extract Agar (MEA) dan P. roqueforti s.s. op dezelfde media. De meest betrouwbare identificatie is uiteraard deze steunend op de moleculaire karakteristieken (Skouboe et al., 1999). Een laatste determinatiemethode bestaat uit een analyse van de verschillende geproduceerde mycotoxinen (Sumarah et al., 2005). Dit wordt verder besproken in Figuur 6: Koloniemorfologie van twee P. roqueforti s.s. stammen (KE28G (boven) en LS04A (onder)) geënt op CYA (Bewerkt uit O'Brien et al., 2008b). Figuur 7: Koloniemorfologie van twee P. paneum stammen (OY127E (boven) en LD104I2 (onder)) geënt op CYA (Bewerkt uit O'Brien et al., 2008b). Pagina 40

49 1.4.1 Invloedsfactoren op de groei en ontwikkeling van P. roqueforti s.l. Zoals eerder werd vermeld behoort Penicillium roqueforti s.l. tot de saprofytische schimmels, die zich sterk hebben aangepast aan de in kuilvoeder heersende condities. P. roqueforti s.l. heeft de eigenschap te kunnen groeien in omgevingen met lage zuurstof- en hoge koolstofdioxideconcentraties (Samson et al., 2004b). Dit is ook de reden waarom de schimmel vaak terug wordt gevonden aan de bovenzijde en zijkanten van de kuil (Pahlow et al., 2003). In een onderzoek van Taniwaki et al. (2009) werd de invloed van de CO 2 -concentatie op de groei van P. roqueforti FRR 2162 nagegaan. Hierbij werden objecten aangelegd van 20, 40 en 60 % CO 2 in evenwicht met N 2 en met een concentratie aan zuurstof kleiner dan 0,5 %. Uit de resultaten kon besloten worden dat P. roqueforti FRR 2162 geen groei meer vertoonde wanneer de concentratie aan CO 2 hoger was dan 20 %. Zuurstof zou hier de limiterende parameter zijn (Guynot et al., 2003; Smith et al., 1986; Zardetto, 2005). Zo toonde Auerbach (2006) aan dat wanneer de zuurstofconcentratie verhoogt wordt naar 4,7 %, P. roqueforti s.l. in staat is te groeien bij CO 2 -concentraties tot 80 %. P. roqueforti s.l. kan in tegenstelling tot de meeste andere schimmels overleven bij vrij lage ph- en a w -waarden. Samson et al. (2004b) geven een minimale a w -waarde aan van 0,83 om nog groei vast te stellen. Vivier et al. (1992) rapporteerden dat P. roqueforti s.l. een optimale groei vertoont bij ph-waarden tussen 4,0 en 5,0, maar dat ook bij een ph-waarde van 3,0 nog een normale groei zichtbaar was. Bovendien wordt de schimmel meer aangetroffen in gematigde klimaten (Cheli et al., 2013). Dit is ook de reden waarom de schimmel een optimale groei vertoont bij 25 C. De schimmel vertoont echter ook groei bij temperaturen van 5 tot 10 C (Frisvad & Samson, 2004; Li et al., 2009; Moreau, 1980). Dit verklaart de mogelijkheid van de schimmel om gedurende het gehele jaar te groeien. Daarnaast is P. roqueforti s.l. in staat hogere concentraties aan vluchtige vrije vetzuren (VVZ) te verdragen (Auerbach et al., 1998; Müller et al., 1990; Poisson & Cahagnier, 1973; Samson et al., 2004b). Zo worden de conidia van P. roqueforti s.l. minder aangetast door propionzuur dan deze van andere Penicillium spp. (Muller & Schwardof, 1990). Engel & Teuber (1978) gebruikten een Malt Extract medium met een concentratie van 5 ml azijnzuur per liter als identificiatiemethode voor P. roqueforti s.l.. Zij vonden namelijk dat P. roqueforti s.l. de enige Penicillium-soort is die in staat is te groeien op dergelijk medium P. roqueforti s.l. en zijn mycotoxines Penicillium roqueforti s.l. is in staat verschillende mycotoxinen te produceren. De mycotoxineproductie in een met schimmel besmette kuil is tijdsafhankelijk. Zo werd door Müller & Amend (1997) penicillinezuur als eerste meetbare metaboliet waargenomen, 13 dagen na de inoculatie van kuilvoeder met P. roqueforti s.l.. Vervolgens konden ook patuline, mycofenolzuur en PR-toxine worden waargenomen na respectievelijk 22-27, 36 en 49 dagen. Pagina 41

50 Dat P. roqueforti s.l. één van de meest voorkomende schimmels in kuilen is, weerspiegelt zich ook in de aanwezigheid van zijn toxines. Schneweis et al. (2000) konden bij een onderzoek in Duitsland in 28 % van de maïskuilen en in 37 % van de graskuilen de aanwezigheid aantonen van mycofenolzuur. Auerbach et al. (1998) vonden in 42 % van de onderzochte graskuilen roquefortine C terug. Mansfield et al. (2008) onderzochten maïskuilen van 30 verschillende bedrijven in Pennsylvania op de aanwezigheid van Penicilliummycotoxinen. In 75 % van de stalen werd minstens één toxine aangetroffen, terwijl 10 % van de stalen de aanwezigheid van vier verschillende toxinen vertoonde, namelijk patuline, mycofenolzuur, cyclopiazonzuur en roquefortine C. Ook de plaats in de kuil waar de schimmel het meest frequent voorkomt is gekoppeld aan het voorkomen van de mycotoxinen. Zo rapporteerden Driehuis et al. (2008) een hogere concentratie aan roquefortine C en mycofenolzuur in de bovenste lagen van de kuil. Zoals in Tabel 2 te zien is, zijn P. paneum en P. roqueforti s.s. niet in staat alle mycotoxinen te produceren. Zowel P. paneum als P. roqueforti s.s. hebben de capaciteit om roquefortine C te produceren (Sumarah et al., 2005). De aanwezigheid van roquefortine C vormt dan ook een indicator voor de aanwezigheid van andere P. roqueforti s.l.-toxinen (Auerbach et al., 1998). P. paneum is daarnaast ook gekenmerkt door de productie van patuline, marcfortine A en marcfortine B, terwijl mycofenolzuur en PR-toxine specifiek zijn voor P. roqueforti s.s. (Boysen et al., 2002; Nielsen et al., 2006; Sumarah et al., 2005). Tabel 2: De verschillende P. roqueforti s.l.-soorten en hun mycotoxinen (Bewerkt uit Storm et al., 2008) Mycofenolzuur Mycofenolzuur (6-(4-hydroxy-6-methoxy-7-methyl-3-oxo-5-phthalanyl)-4-methyl-4- hexenoiczuur) (MPA) is een secundair metaboliet geproduceerd door P. roqueforti s.s.. Het is een organisch zuur met antibacteriële en antifungale werking. Daarnaast heeft MPA ook antivirale eigenschappen, daar het interfereert met de virale vermenigvuldiging (Abrams & Bentley, 1959; Cline et al., 1969; Planterose, 1969). Om die reden wordt MPA gebruikt als geneesmiddel bij humane medische toepassingen. Het wordt onder andere aangewend ter Pagina 42

51 behandeling van psoriasis (Marinari et al., 1977) en door zijn immunosupressieve werking ook als anti-afstotingsbehandeling bij orgaantransplantaties (Mansfield et al., 2008). De acute toxiciteit voor zoogdieren blijkt vrij laag te zijn. Wilson (1971) vond bij ratten en muizen een LD50-waarde terug van respectievelijk 2500 en 700 mg/kg lichaamsgewicht (LG). Chronische toxiciteitstesten, waarbij konijnen gedurende één jaar dagelijkse orale dosissen kregen van 80 en 320 mg/kg LG, vertoonden geen duidelijke symptomen van toxicose (Adams et al., 1975). Echter in het onderzoek van Marinari et al. (1977), waarbij mensen gedurende 52 weken een dagelijkse dosis ontvingen van 2,4 tot 7,2 g MPA, werden enkele ziektebeelden waargenomen zoals krampen, misselijkheid en diarree. MPA is een veelvoorkomend mycotoxine in kuilvoeders (Auerbach, 2006). Het onderzoek van Schneweis et al. (2000) in Duitsland betrof 135 maïskuilstalen en 98 graskuilstalen die zichtbaar gecontamineerd waren met P. roqueforti s.s.. MPA werd terug gevonden in 32 % van de stalen, met concentraties variërend van 20 tot µg/kg vers groenvoeder. Er werd echter geen correlatie gevonden tussen de concentratie MPA en het aantal P. roqueforti s.s.. Dit kan gedeeltelijk verklaard worden door het feit dat niet alle schimmelstammen in staat zijn MPA te produceren (Boysen et al., 1996). Daarnaast vertonen de MPA-positieve stammen verschillende productiehoeveelheden onder gestandaardiseerde condities (Engel et al., 1982) PR-toxine PR-toxine (7-acetoxy-5,6-epoxy-3,5,6,7,8,8-ahexahydro-3',8,8-atrimethyl-3- oxaspiro(naftaleen-2)3'-carboxaldehyde) is een van de meest acuut toxische metabolieten van P. roqueforti s.s.(arnold et al., 1987). Wei et al. (1973) constateerden een orale LD50 bij ratten van 115 mg/kg LG. Dieren die een orale dosis kregen van 160 mg/kg LG vertoonden reeds na tien minuten ademhalingsproblemen met de dood als gevolg. Ook Chen et al. (1982) rapporteerden acuut toxische effecten zoals een toename van de capillaire permeabiliteit en een directe beschadiging van long-, hart-, lever- en nierweefsels. Dit is te wijten aan de neurotoxische en carcinogene werking van het PR-toxine (Adesogan, 2006). Het PR-toxine is bovendien in staat de RNA-polymerase systemen te inhiberen die instaan voor de ribosomale en nucleaire RNA-synthese (Moulé et al., 1976). In tegenstelling tot de andere P. roqueforti s.l.-toxinen wordt het PR toxine net als patuline slechts occasioneel aangetroffen in kuilvoeders. Dit zou te wijten zijn aan hun onstabiel karakter onder kuilomstandigheden (Müller & Amend, 1997; Skaar, 1996) Patuline Patuline (PAT) of 4-hydroxy-4,H-furo-(3,2-c)pyraan-2(6H)-on heeft een LD50 bij orale toediening van 15 mg/kg LG en bij subcutane injectie van 25 mg/kg LG. PAT wordt niet Pagina 43

52 enkel en alleen geproduceerd door P. paneum. Ook Byssochlamys nivea en Aspergillus clavatus zijn producenten van PAT (Sabater-Vilar et al., 2004). Patuline is een belangrijk toxine in de verstoring van de veegezondheid. In het onderzoek van Sabater-Vilar et al. (2004) werden bij opname van maïskuilvoeder met hoge PAT-concentraties symptomen waargenomen zoals rillingen, verlamming en uiteindelijk sterfte. Dit laatste is te wijten aan de mogelijkheid van het toxine om te interfereren met de citroenzuurcyclus (Adams & Motarjemi, 1999; Adesogan, 2006; Auerbach, 2006). Daarnaast staat PAT ook bekend als een veroorzaker van oedeem, coördinatieproblemen en pensverstoringen. Het is tevens een carcinogene en mutagene substantie (Vesely et al., 1981) Roquefortine C Roquefortine C (ROC) heeft de volgende chemische benaming: 10b(1,1-dimethyl-2- propenyl)-3-imidazol-4-methyleen-5a,10b,11,11-atetrahydro-2h-pyrazino-(1',2':1,5)-pyrrol- (2,3,b)-indol-1,4,(3H,6H)-dione (Scott & Kennedy, 1976). De structuur wordt weergegeven in Figuur 8. Het is een alkaloïd met een diketo-peperazine structuur. Ueno & Ueno (1978) constateerden een LD50 bij ratten van 1520 mg/kg LG wanneer de dosis intraperitoneaal werd toegediend. ROC is een neurotoxine dat kramp- en (Arnold et al., 1987) verlammingsverschijnselen (Wagener et al., 1980) teweeg brengt bij muizen. ROC heeft echter niet de neiging mutagene of carcinogene effecten te vertonen (Frank et al., 1977; Schoch et al., 1984). ROC wordt er echter wel van verdacht verlamming, abortus en het ophouden van de nageboorte bij vee te veroorzaken (Auerbach et al., 1998; Ohmomo & Kitamoto, 1994). Toch dient de nodige aandacht besteed te worden aan het mogelijke optreden van synergistische effecten tussen de verschillende aanwezige toxines, waardoor het niet eenvoudig is de symptomen toe te schrijven als enkel ROC-geïnduceerd (Arnold et al., 1978). Het is een toxine dat voornamelijk terug te vinden is in het mycelium en dus niet wordt uitgescheiden in de omgeving (Ohmomo et al., 1975). Het werd voor het eerst geïsoleerd door onafhankelijke onderzoekers in Japan (Ohmomo et al., 1975) en Frankrijk (Scott et al., 1976) uit de Penicillium roqueforti Thom stam. Waarschijnlijk zou de dihydro-component roquefortine D de biosynthetische precursor vormen voor het ROC. Ook roquefortine D werd reeds geïsoleerd uit bepaalde P. roqueforti s.l.-culturen (Ohmomo et al., 1978). Mansfield et al. (2008) vonden in een onderzoek naar de verschillende P. roqueforti s.l.- toxinen in 120 maïsstalen een gemiddelde concentratie ROC terug van 0,38 µg/g ingekuilde maïs met een maximumconcentratie van 5,71 µg/g. De ROC-concentratie voor vers geoogste maïs lag met een gemiddelde van 0,20 µg/g, lager dan deze van de ingekuilde stalen. Bovendien was ROC het meest voorkomende toxine dat werd gedetecteerd. Pagina 44

53 Zoals reeds eerder werd aangehaald vormt de detectie van het ROC een indicator voor de aanwezigheid van andere, meer toxische, P. roqueforti s.l.-toxinen (Auerbach et al., 1998). Dit door het feit dat verschillende mycotoxines gelijktijdig kunnen worden geproduceerd (Scott et al., 1977) en omwille van het stabiel karakter van het toxine. Zo is het ROC vrij stabiel bij lage ph-waarden en zijn er nog geen bewijzen geleverd van mogelijke interacties van het toxine met de andere kuilvoedercomponenten (Auerbach et al., 1998). Patuline en het PR-toxine hebben daarentegen de neiging te gaan binden met aminozuren, amines en ammoniak, waardoor deze moeilijker detecteerbaar zijn. Doch deze zijn echter wel van groter toxicologisch belang (Lieu & Bullerman, 1978; Wei et al., 1973). Anderzijds wordt het ROC geproduceerd door zowel P. roqueforti s.s. als P. paneum, wat niet het geval is voor de meeste andere toxines (Frisvad & Filtenborg, 1989). Figuur 8: Chemische structuur van ROC (Bewerkt uit Richard et al., 2004) Factoren met een invloed op de productie en stabiliteit van roquefortine C Studies omtrent het voorkomen van roquefortine C hebben, wanneer er een duidelijke aanwezigheid was van P. roqueforti s.l., reeds hoge frequenties aan gecontamineerde kuilvoeders gerapporteerd (Auerbach et al., 1998). Häggblom (1990) en Wagener et al. (1980) verklaarden het veelvuldig voorkomen van dit toxine als een gevolg van de relatief lage temperaturen en de verlaagde zuurstofconcentraties. Olivigni & Bullerman (1977) vonden dan weer dat maïskuilen vaak hogere concentraties aan mycotoxinen, waaronder ook ROC, bevatten dan voordroogkuilen. Een mogelijke verklaring hiervoor kan terug te vinden zijn in het verschil in type en gebruik van de koolstofbronnen die beschikbaar zijn voor de groei en mycotoxineproductie van de schimmel. Zo bevatten maïskuilvoeders vaak hogere concentraties aan suikers en hebben schimmels de eigenschap om veel sneller te groeien met suikers als substraat in plaats van fermentatieproducten (Muck & Bolsen, 1991; Pitt et al., 1991). Daarenboven zou de hogere concentratie aan ROC in maïskuilen ook te wijten zijn aan de hogere graad van accumulatie van mycelium in deze kuilvoeders (Häggblom, 1990). Mansfield et al. (2008) rapporteerden dat roquefortine C het mycotoxine was dat het meest voorkwam in combinatie met andere toxines. In 83 % van de stalen (N = 120) kwam ROC Pagina 45

54 voor met twee of meer andere toxinen. Bovendien was de aanwezigheid van ROC sterk positief gecorreleerd met de aanwezigheid van mycofenolzuur. Zo was 77 % mycofenolzuurpositieve stalen ook positief voor ROC. ROC en andere P. roqueforti s.l.-toxines bleken uit het onderzoek van Sumarah et al. (2005) fotolabiel te zijn. Zo kon bij een blootstelling van de culturen aan het licht slechts minder dan 50 % van de oorspronkelijke concentratie aan toxinen teruggevonden worden. Dit in tegenstelling tot de in het donker geïncubeerde stalen waarbij tot 85 % konden worden gedetecteerd. Wanneer ROC in contact komt met UV vindt er namelijk een reorganisatie plaats van de 3,17 dubbele binding, zodat er een foto-isomeer van het toxine ontstaat (Noroozian et al., 1999; Scott et al., 1979). Ook bleek uit het onderzoek van Sumarah et al. (2005), in tegenstelling tot voorgaande stellingen, ROC niet zuurtolerant te zijn. In zuur milieu vindt er namelijk een degradatie plaats van het toxine tot een verbinding met een moleculair gewicht van 321 g/mol. Dit wijst op het verloren gaan van de isoprenyl-eenheid en het openen van de N5/C6 binding. Sumarah et al. (2005) konden bovendien besluiten dat de vorm waaronder N (anorganisch of organisch o.v.v. gistextract) wordt aangeleverd geen significant effect heeft op de ROC-productie. ROC werd gedetecteerd tot op het moment dat er geen anorganische N meer beschikbaar was. Ook op het vlak van de osmotische druk aanwezig in het groeimedium van P. roqueforti s.l. werd geen invloed vastgesteld op de ROCproductie tot een concentratie aan glycerol van 30 %. Concentraties hoger dan 30 % vertoonden daarentegen wel een significante daling in de productie van ROC. Hieruit kon besloten worden dat een verandering in de a w -waarde een groter effect heeft op de radiale groeisnelheid, dan op de ROC-productie (Gock et al. 2003). Een verhoging van de sucroseconcentratie van 30 naar 60 g/l had een negatief effect op de ROC-concentratie. De oorzaak hiervan is eerder terug te vinden in het veroorzaken van een voedseloveraanbod, dan in het verhogen van de osmotische waarde van het medium. Het is namelijk zo dat de schimmelgroei blijft toenemen tot één of meerdere nutriënten deficitair worden, waarna vervolgens het secundaire metabolisme actief wordt. Ook de ROC-productie wordt net als de schimmelgroei beïnvloed door de concentratie CO 2 en O 2 (Taniwaki et al., 2009). Aangezien er geen schimmelgroei is door P. roqueforti s.l. bij CO 2 -concentraties van 40 en 60 %, kan er bij deze omstandigheden ook geen toxineproductie plaatsvinden. Bij een CO 2 -concentratie van 20 % is er wel groei mogelijk en aldus ook mycotoxineproductie. Figuur 9 geeft het verloop weer van de ROC-concentratie (in µg/petriplaat) van P. roqueforti s.l. (groeicondities zie onderaan figuur) in functie van de tijd. Op het CYA-medium wordt de hoogste productie bereikt op dag acht (0,15 µg/petriplaat), terwijl bij het PDA-medium een maximum van 0,30 µg/petriplaat wordt bereikt op dag veertien. Pagina 46

55 Figuur 9: ROC productie bij 25 C, 20 % CO 2 in balans met N 2 en <0,5 % O 2 ; op - - PDA-medium (Taniwaki et al., 2009) CYA- en Pagina 47

56 2 Materiaal en methoden 2.1 Gebruikte media en oplossingen Media Alle media werden geautoclaveerd voor gebruik Potato Dextrose Broth Voor de bereiding van Potato Dextrose Broth (PDB) (Oxoid) werd 24 gram poeder opgelost per liter gedestilleerd water Mineraal medium Dit medium werd bereid volgens Gardiner et al. (2009), waarbij NaNO 3 vervangen werd door NH 4 NO 3 (Lawrence & Hawke, 1968). De samenstelling van het mineraal medium wordt weergegeven in Tabel 3. Ook werd 200 µl/l vooraf bereide sporenelementen-oplossing toegevoegd aan het medium, waarvan de samenstelling is weergegeven in Tabel 4. Tabel 3: Samenstelling van het mineraal medium Bestanddeel Sucrose NH 4 NO 3 KH 2 PO 4 MgSO 4.7H 2 O KCl FeSO 4.7H 2 O Aandeel/l 30 g 2 g 1 g 0,5 g 0,5 g 10 mg Pagina 48

57 Tabel 4: Samenstelling sporenelementenoplossing Bestanddeel Citroenzuur ZnSO 4.7H 2 O CuSO 4.5H 2 O MnSO 4.H 2 O H 3 BO 3 Na 2 MoO 4.2H 2 O Aandeel/l 10 mg 10 mg 0,5 mg 0,1 mg 0,1 mg 0,1 mg Vers luzerne- en maïsmedium Het groenvoedermedium werd verkregen door een hoeveelheid gedroogd (bij 65 C) en gemalen (op 1 mm) niet-ingekuild ("vers") plantenmateriaal, equivalent aan 50 g VS/l, gedurende één uur te infuseren. Hierbij werd de oplossing voortdurend gehomogeniseerd. Vervolgens werd de suspensie gefilterd over een miracloth- en standaardfilter en tot het initiële volume aangevuld met AD. De chemische samenstellingen van de verse luzerne en maïs worden weergegeven in Tabel Ingekuild luzerne- en maïsmedium De werkwijze voor het bereiden van dit ingekuild medium is gelijkaardig aan dit van het vers luzerne- en maïsmedium. Voor het ingekuilde groenvoedermedium werd gebruik gemaakt van plantenmateriaal dat gedurende vier weken werd ingekuild. De resultaten van de chemische analyse van dit ingekuilde maïs en luzernevoeder worden weergegeven in Tabel 5. Pagina 49

58 Tabel 5: Chemische analyse van het uitgangsmateriaal. MATERIAAL EENHEID Maïs vers Maïs ingekuild Luzerne vers Luzerne ingekuild Melkzuur g/kg DS 8,33 55,78 14,80 44,52 C g/kg DS 462,12 460,23 456,14 464,21 RA g/kg DS RC g/kg DS RE g/kg DS VOS % Overige KH g/kg DS ZET g/kg DS Oplosbare N (NH 4 -N en NO 3 - g/kg DS 1,51 1,78 1,63 2,13 N) Suikers g/kg DS 55,70 7,70 65,73 19,19 Op het vlak van voedertechnische eigenschappen gaat het hier om een uitstekende maïskuil. Wanneer de resultaten vergeleken worden met de gemiddelde waarden (AVEVE, ILVO) lagen alle waarden binnen de normaalvork. Het RC van de ingekuilde maïs lag met de waarde van 210 g/kg DS iets hoger dan het gemiddelde van 190 g/kg DS. Ook het RE-gehalte lag met 70 g/kg DS vijf eenheden lager dan het gemiddelde (De Brabander, 2013). Rekening houdend met de mogelijke schattingsfout die berust op de NIRS-techniek, zijn deze afwijkingen ten opzichte van het gemiddelde echter verwaarloosbaar. Tot slot lag in vergelijking met de verse maïs het suikergehalte van de ingekuilde maïs veel lager. Dit wijst op de plaatsgevonden fermentatie van deze suikers, wat ook kan afgeleid worden uit het hogere melkzuurgehalte in het ingekuilde staal. Wanneer de waarden voor RC en RE voor luzerne worden vergeleken met de gemiddelde waarden van het proefbedrijf Cranendonck ( ) (van der Schans et al., 1998), scoorde het luzernekuilvoeder beduidend minder goed. Zo bedroegen de gemiddelden voor het RC- en RE-gehalte op het proefbedrijf respectievelijk 241 en 189 g/kg DS. In het gebruikte luzernevoeder lag het RC-gehalte met 257 g/kg DS dus hoger en het RE-gehalte met 148 g/kg DS lager dan de referentie. Daarentegen scoorde het kuilvoeder op het RA-gehalte met een waarde van slechts 96 g/kg DS bijzonder goed. Uit de referentieresultaten varieerden de gemiddelden namelijk tussen de 100 en 200 g/kg DS. Ook hier lag net als bij de maïsstalen het suikergehalte van de ingekuilde luzerne beduidend lager dan deze van het verse staal, terwijl het melkzuurgehalte in het ingekuilde materiaal beduidend hoger was in vergelijking met de verse luzerne. Pagina 50

59 Wanneer de twee groenvoeders met elkaar vergeleken worden valt er een duidelijk verschil in RE-gehalten op. Zowel bij het verse als het ingekuilde luzernestaal lag het RE-gehalte dubbel zo hoog als deze bij respectievelijk het verse en ingekuilde maïsstaal. Bovendien weerspiegelde dit zich ook in het gehalte oplosbare N, toch de verschillen tussen de twee groenvoeders waren minder groot. Daarnaast bevatte het ingekuilde luzernestaal minder melkzuur dan de ingekuilde maïs en dit terwijl het melkzuurgehalte in de verse maïs lager lag dan deze in de verse luzerne. De waarden voor het koolstofgehalte en de VOS lagen in dezelfde grootteorde voor beide groenvoeders. Daarentegen lagen de waarden voor RA en RC beduidend hoger bij de luzernestalen, terwijl het gehalte overige KH hoger was bij de maïsstalen Czapex Dox Yeast Extract Broth De samenstelling van Czapex Dox Yeast Extract broth (CDYE) wordt weergegeven in Tabel 6 (Sumarah et al., 2005). Tabel 6: Samenstelling CDYE. Bestanddeel Sucrose K 2 HPO 4 Yeast extract MgSO 4 NaNO 3 FeSO 4 KCl Aandeel/l 30 g 1 g 5 g 0,5 g 3 g 0,01 g 0,5 g Oplossingen Azijnzuuroplossingen Voor elk getest medium werden oplossingen gemaakt met acht verschillende azijnzuurconcentraties (99,5 % azijnzuur), nl.: 0, 1, 3, 5, 7, 9, 12 en 15 ml azijnzuur per liter medium. Hierbij werd voor een 25 ml azijnzuur-oplossing steeds vertrokken vanuit een volume medium van 24,625 ml medium. Vervolgens werd dit aangevuld met het juiste volume steriel gedestilleerd water en/of steriel azijnzuur zodat een totaalvolume van 25 ml werd bekomen met de juiste concentratie azijnzuur (Tabel 7). Pagina 51

60 Tabel 7: Bereiding van de azijnzuuroplossingen. ml ml gesteriliseerd ml gesteriliseerd azijnzuur/l azijnzuur AD 0 0,000 0, ,025 0, ,075 0, ,125 0, ,175 0, ,225 0, ,300 0, ,375 0, Ehrlich reagens Voor de kwalitatieve ROC-bepaling wordt gebruik gemaakt van het Ehrlich reagens. Hiervoor wordt een oplossing gemaakt van 0,2 g 4-dimethylaminobenzaldehyde, 8,5 ml 96 % ethanol en 1,5 ml 10 M HCl. Er wordt geschud tot een homogene oplossing wordt bekomen. 2.2 Gebruikte apparatuur Spectrofotometer (Oasys UVM340) Deze spectrofotometer laat toe de schimmelgroei op te volgen via bepaling van de absorbantie van oplossingen in 96-well platen bij 620 nm (Figuur 10). Aan de hand van het computerprogramma Plate-DigiRead worden resultaten verzameld en digitaal verwerkt. Figuur 10: Spectrofometer Pagina 52

61 2.2.2 Flow-cytometer (Cyflow Partec) De flow-cytometer wordt gebruikt voor het bepalen van de sporenconcentraties (Figuur 11). De lichtbron in het toestel is een 20 mw 488 nm blauwe vaste stoflaser. Figuur 11: Flowcytometer (Cyflow Partec, z.j.) ph-meter (Consort C831) Het bepalen van de ph gebeurt met de ph-meter Consort C831 (Figuur 12). 2.3 Sporenoplossingen Figuur 12: ph-meter Bij de uitgevoerde experimenten werd gebruik gemaakt van 12 P. roqueforti s.l. isolaten. Deze isolaten werden geselecteerd op basis van eerdere experimenten uitgevoerd in het kader van het doctoraatsonderzoek van ir. Wambacq Eva. De identificatie van de isolaten gebeurde macromorfologisch op een Czapek Yeast Extract Agar volgens O'Brien et al. (2008b). Pagina 53

62 De gebruikte isolaten zijn weergegeven in Tabel 8. In het onderzoek werden acht P. roqueforti s.s.- en vier P. paneum-isolaten betrokken. Tabel 8: De 12 schimmelisolaten die werden gebruikt in het experiment. Stam Species Oorsprong Origine 1 CBS P. roqueforti s.s. Denemarken Mozarella kaas 2 CBS P. roqueforti s.s. Nederland Beschimmelde graskuil 3 CBS P. paneum Zweden Graskuil (ph = 4,4) 4 MUCL46746 P. roqueforti s.s. België Beschimmeld kuilvoer P. paneum België Beschimmeld kuilvoer S1-L3 P. roqueforti s.s. Sint-Martens-Lennik Lucht S1-L10 P. roqueforti s.s. Sint-Martens-Lennik Lucht S1-G1 P. roqueforti s.s. Sint-Martens-Lennik Gras bij inkuilen S1-G8 P. roqueforti s.s. Sint-Martens-Lennik Gras bij inkuilen S4-B7 P. paneum Zele Bodem (perceel gras) S4-G8 P. paneum Zele Gras bij inkuilen S9-G11 P. roqueforti s.s. Zele Maïs bij inkuilen Bereiden van de sporenoplossingen De schimmelisolaten werden aeroob opgegroeid op PDA gedurende 14 dagen in het donker bij 25 C. Op de begroeide petriplaten werden de sporen losgewassen met steriel fysiologisch water waaraan Tween20 toegevoegd was. De sporenoplossingen werden per isolaat verzameld in een steriele 50 ml falcon, waarna de falcons gecentrifugeerd werden gedurende 15 minuten bij 9000 rpm. Na het verwijderen van het supernatans werd de pellet heropgelost in 20 ml steriel fysiologisch water met Tween20. De falcons werden opnieuw gecentrifugeerd gedurende 15 minuten bij 9000 rpm, waarna het supernatans werd verwijderd. De pellet werd vervolgens opgelost in 20 ml steriel fysiologisch water. De verkregen sporenoplossingen werden gefiltreerd door een steriele dubbele miracloth filter, waarbij het monospore filtraat werd opgevangen in een nieuwe steriele 50 ml falcon Sporenconcentraties bepalen De concentratiebepalingen gebeurden met een flow cytometer. Hierbij werd met behulp van twee scatters het aantal partikels (sporen) bepaald in een bepaald volume (0,2 ml). Bij drie van de 12 gemaakte sporenoplossingen werd ook nog een controle uitgevoerd met behulp van een Bürkertelkamer. Hierbij werden steeds de sporen geteld in drie diagonaal t.o.v. elkaar gelegen vierkanten die diagonaal ten opzichte van elkaar liggen, zoals weergegeven in Figuur Pagina 54

63 13. Bij de isolaten , , 46746, en S1-G1 werd de meting met de flow cytometer in tweevoud uitgevoerd. Hier werden echter geen grote verschillen opgemerkt waarna de tweede meting achterwege werd gelaten voor de overige isolaten. Voor de isolaten S1-L10, S4-G8 en S9-G11 werd ter controle ook de sporenconcentratie bepaald aan de hand van een Bürker-telkamer. Hierbij werden concentraties bekomen die steeds in min of meer dezelfde grootte-orde lagen als wat bekomen werd met de flow cytometer. Finaal werden dan ook de (gemiddelde) sporenconcentraties, bepaald via flow cytometrie, gebruikt voor de berekening van verdere verdunningen. Figuur 13: Schematische voorstelling van de Bürkertelkamer Na de bepaling van de sporenconcentraties werden alle sporenoplossingen verdund met behulp van steriel fysiologisch water tot een concentratie van 1,10 6 sporen/ml. Vervolgens werden de oplossingen nogmaals 50 % verdund door het toevoegen van steriele glycerol, tot een finaleconcentratie van 0, sporen/ml. Deze finale sporenoplossingen werden verdeeld over epjes en gedurende 1 u bij 4 C bewaard, nadien 23 u bij -20 C en tenslotte langdurig gestockeerd bij -80 C. Pagina 55

64 2.4 Proefopzet van de experimenten Chemische analyse van het uitgangsmateriaal Voor het bereiden van de media werd via een infusie onder andere gebruik gemaakt van maïs en luzerne, vers en na inkuilen. Om de groei en mycotoxineproductie van P. roqueforti s.l. te kunnen linken aan de samenstelling van deze media, werd van het gedroogd materiaal de chemische samenstelling bepaald. De resultaten zijn weergegeven in Tabel 5. De resultaten voor het melkzuur- en C-gehalte werden bekomen met respectievelijk de HPLC- en de droge verbrandingsmethode. Voor de bepaling van het gehalte oplosbare N werd MgO en Devarda-reagens toegevoegd aan een waterig extract, gevolgd door een stoomdestillatie en een titratie met HCl. Voor de analyse van het suikergehalte werd gebruik gemaakt van Luff-Schoorl-methode. De overige voedertechnische eigenschappen werden bekomen met de NIRS-techniek Nagaan van de invloed van azijnzuur op de groei van Penicillium roqueforti s.l. Uit resultaten van voorgaande onderzoeken, uitgevoerd door ir. Wambacq Eva, groeide het vermoeden dat P. roqueforti s.l. azijnzuur als koolstofbron kan gebruiken en ook groei zou vertonen bij hogere azijnzuurconcentraties. Om deze stelling verder uit te diepen werd een proef opgezet waarbij de groei van de schimmel wordt nagegaan bij verschillende azijnzuurconcentraties toegevoegd aan verschillende media. Voor de bepaling van de invloed van azijnzuur op de groei van Penicillium roqueforti s.l. werd gebruik gemaakt van 96 well-platen, ingedeeld zoals weergegeven in Figuur 14. Voor het uitvoeren van de proeven werd steeds op een steriele manier gewerkt in de laminaire flow. Er werden in totaal 12 schimmelisolaten, geïsoleerd van verschillende locaties, getest. Deze worden weergegeven onder punt Per 96-well plaat konden twee media getest worden. In totaal werden zeven verschillende media opgenomen in het experiment: CDYE, PDB, mineraal medium, vers en ingekuild maïsmedium en een vers en ingekuild luzernemedium. Pagina 56

65 Figuur 14: Schematische voorstelling van de indeling van de 96-well plaat. Er werd object gewerkt in zes herhalingen en dit steeds met vijf herhalingen met sporenoplossing (kolom 1 t.e.m. 5 en kolom 8 t.e.m. 12) en één negatieve controle (kolom 6 en 7). In plaats van uit een sporenoplossing bestond deze negatieve controle uit een steriele oplossing van 50 % fysiologisch water en 50 % glycerol. Per well werd 180 µl medium- en 20 µl sporenoplossing of negatieve controle aangebracht. Hierbij werd met acht verschillende azijnzuurconcentraties per medium gewerkt 0, 1, 3, 5, 7, 9, 12 en 15 ml AZ/l. De mediumoplossingen werden zodanig aangebracht dat elke rij in de 96-well plaat een andere azijnzuurconcentratie had. Nadat alle 96-well platen waren gevuld, werden deze afgedekt met een folie en aeroob geïncubeerd in het donker bij 22 C. Voor de het PDB- en mineraal medium werd het experiment herhaald bij 27 C. Na drie, zes en negen dagen werd de groei opgevolgd via spectrofotometrie. Hierbij werd de absorbantie gemeten van elke well en dit bij een golflengte van 620 nm. Ten einde de schimmelgroei te kunnen linken aan de begin-ph, werd bij alle mediumoplossingen een phbepaling uitgevoerd. Bij de verkregen data werden, na het in mindering brengen van de absorbantie van de negatieve controle, aan de hand van boxplots de outliers bepaald uit de vijf herhalingen met sporenoplossing. Deze outliers werden verwijderd. Na het omvormen van de gemiddelde groeigegevens per object tot een dataset waarbij de absorbantiewaarden in chronologische volgorde werden geplaatst, werd additioneel een manuele controle uitgevoerd op het logisch verloop van de groei. Aan de hand van het gemiddelde voor de drie waarnemingen (op dag drie, zes en negen) werd per object een spreidingsgrafiek opgesteld, aangevuld met een lineaire trendlijn. Vervolgens werd, indien de determinatiecoëfficiënt groter was dan 0,8, de richtingscoëfficiënt van deze trendlijn genoteerd als maat voor de groeisnelheid. Na het controleren van de normaliteits- en homoscedasticiteitvoorwaarden werd met behulp van SAS Learning Edition 5 een one-way Anova met Tukey als post-hoc test uitgevoerd om eventuele significante verschillen in de gemiddelde groeisnelheid na te gaan. Dit gebeurde op drie niveaus (species, medium en azijnzuurconcentratie) waarbij telkens twee factoren constant werden gehouden en het effect van de derde factor op de groeisnelheid onderzocht werd. Tot slot werden voor de groeigegevens op het PDB- en mineraal medium ook eventuele Pagina 57

66 significante verschillen in groeisnelheid nagegaan tussen de twee incubatietemperaturen. De significantie werd vastgelegd op p < 0, Nagaan van de invloed van azijnzuur op de productie van Roquefortine C Om na te gaan of er verschillen waren qua ROC-productie tussen de geselecteerde isolaten bij een aantal media en AZ-concentraties werd een experiment opgezet in falcons: per falcon werd 5,7 ml mediumoplossing en 0,3 ml sporenoplossing aangebracht. Volgende isolaten, media en azijnzuurconcentraties werden opgenomen in deze proef: Vier isolaten: MUCL (P. roqueforti s.s. - sterke ROC-productie), CBS (P. roqueforti s.s. - meestal ROC-productie), CBS (P. paneum - geen ROC-productie), 2011-S4-G8 (P. paneum - variabele ROC-productie). Vier media: CDYE-broth, mineraal medium (1 x bij 27 C en 1 x bij 22 C), ingekuild maïsmedium (50 g VS/l), ingekuild luzernemedium (50 g VS/l). Vier azijnzuurconcentraties: 0 ml AZ/l, 1 ml AZ/l, 3 ml AZ/l, 5 ml AZ/l. Voor elk object werd in drie herhalingen gewerkt. Alle objecten werden aeroob geïncubeerd in het donker bij 22 C; voor het mineraal medium werd de proef ook bij 27 C uitgevoerd. De resultaten werden opgevolgd na drie en na negen dagen. Hierbij zou het ROC zich gedurende de eerste drie dagen in het mycelium moeten bevinden, vervolgens zou dit mycotoxine vrijgesteld worden in het medium (Garcia-Rico et al., 2008; Ohmomo et al., 1979). Na drie dagen werd op 2 ml van het medium de ph bepaald. Na negen dagen werd het mycelium van het medium gescheiden door middel van filtratie door miracloth. Ook hier werd een ph-bepaling uitgevoerd op het medium. Het aldus bekomen mycelium werd in twee delen verdeeld: één deel werd gestockeerd bij 20 C voor eventuele kwantitatieve ROCbepaling; het andere deel werd onderworpen aan een kwalitatieve bepaling van ROC via de Pagina 58

67 Ehrlich kleurreactie. Hierbij werden stukjes mycelium op een petriplaat aangebracht zoals weergegeven op Figuur 15. Op elk myceliumstukje werd een in Ehrlich reagens gedrenkt stukje filterpapier geplaatst. Vervolgens werd elk stukje filterpapier gecontroleerd op al dan niet paarsverkleuring (Figuur 16). Een paarse verkleuring duidt op aanwezigheid van een alkaloïd, in dit geval ROC. Een kleurreactie na twee tot zes minuten wijst op een sterke reactie, terwijl een verkleuring na zeven tot tien minuten eerder een zwakke reactie aangeeft. Figuur 15: Het aanbrengen van stukjes mycelium voor de Ehrlich kleurreactie. Figuur 16: Postieve objecten bij de kwalitatieve ROC-bepaling. Pagina 59