Integrin alfa3beta1 and tetraspanin CD151 in particular in the skin and the kidney Sterk, L.M.T.

Transcriptie

1 UvA-DARE (Digital Academic Repository) Integrin alfa3beta1 and tetraspanin CD151 in particular in the skin and the kidney Sterk, L.M.T. Link to publication Citation for published version (APA): Sterk, L. M. T. (2003). Integrin alfa3beta1 and tetraspanin CD151 in particular in the skin and the kidney General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam ( Download date: 05 Feb 2017

2 Samenvatting voor de leek Opmerkingen vooraf: De figuren, tabellen en schema's waar in de tekst naar verwezen wordt zijn in het Engels. De nummering van de figuren, tabellen en schema's en de volgorde waarin de verschillende hoofdstukken worden behandeld is bepaald door de Engelstalige inleiding en is derhalve niet noodzakelijkerwijs de juiste volgorde voor deze samenvatting. Inleiding Weefselverbanden worden gevormd door de binding van cellen aan elkaar of aan de omringende tussencelstof, ook wel de extracellulaire matrix (ECM) genaamd. Deze binding komt tot stand door adhesiereceptoren zoals de integrinen, welke zich bevinden aan het oppervlak van de cel. De integrinen (figuur 1) zijn opgebouwd uit twee ketens (a en p) waarvan in het algemeen een klein deel in de cel is gelegen (cytoplasmatische domein) en door de celwand steekt (transmembraan domein, TMD). Het grootste deel is buiten de cel gelegen (extracellulaire domein, ECD) en bevat de ligand-bindingsplaats samengesteld uit een klein deel van beide ketens waarmee het integrine bindt aan matrix moleculen. Er bestaan verschillende a en (3 subunits. Door verschillende combinaties van a en p subunits ontstaan 24 verschillende integrinen, die verschillende extracellulaire matrix moleculen (liganden) kunnen binden. Een van die matrix moleculen is laminine (LN) (figuur 2). Laminine bestaat uit drie ketens (cc, p en y). Combinaties van verschillende a, p en y ketens vormen 15 laminine isovormen (tabel 2). Isovormen lijken sterk op elkaar, maar toch zijn er kleine structurele en vaak ook functionele verschillen. Omdat binnen de integrinefamilie een bepaalde groep min of meer exclusief laminine bindt, worden zij de laminine-bindende integrinen genoemd. Dit zijn oc3pi, a6pi, a7pi en a6p4 (figuur 2; tabell). De a ketens van deze integrinen ondergaan tijdens de productie verschillende bewerkingen waardoor zowel hun ECD als hun cytoplasmatisch domein kan verschillen. Zo ontstaan splicevarianten die worden aangeduid met X1 of X2 voor het extracellulaire deel en A, B of C voor het cytoplasmatische domein. De integrine ketens worden als losse ketens gemaakt in het endoplasmatisch reticulum, een celorganel dat gezien kan worden als de eiwitfabriek van de cel. De ketens binden vervolgens aan elkaar en worden dan naar het Golgiapparaat getransporteerd waar soms nabewerking van de ketens plaatsvindt. Vervolgens worden de integrinen van het Golgi-apparaat in blaasjes afgesnoerd en getransporteerd naar het celoppervlak om daar tot expressie te komen. Naast de binding aan ECM moleculen kunnen integrinen via hun cytoplasmatische deel interacties aangaan met vele andere moleculen. Met de ontwikkeling van nieuwe technieken worden steeds meer moleculen beschreven welke een interactie met integrinen lijken te kunnen aangaan. Sommige van die moleculen behoren tot de cytoskelet(verbindings)eiwitten zoals vinculine, taline, a-actinine en actine (figuur 4). Zij vormen het inwendige geraamte van de cel. Verandering in de samenstelling of ligging van cytoskeleteiwitten maakt dat de cel van vorm kan veranderen. In combinatie met het binden of loslaten van delen van de cel maakt dit dat de cel kan bewegen en zich bijvoorbeeld kan verplaatsen (figuur 3). Celbeweging of verplaatsing treedt op bij vele processen in het lichaam, zoals bijvoorbeeld wondheling, infiltratie of uitzaaiing bij kanker, bloedstolling, de immuunrespons en de embryonale ontwikkeling. De invloed die een integrine kan uitoefenen op de vorm, verplaatsing, deling en overleving van de cel wordt signalering genoemd. Signalering kan optreden van VI

3 buiten de cel naar binnen (outside-in) zodat via celadhesie invloed uitgeoefend wordt op cytoplasmatische processen, of van binnen de cel naar buiten (inside-out) zodat via binding van cytoplasmatische eiwitten invloed wordt uitgeoefend op de binding van de cel aan zijn omgeving. Signalering is een ingewikkeld proces dat leidt tot een cascade aan veranderingen waaronder het activeren van bepaalde enzymen. Bij sommige receptoren aan het celoppervlak liggen de te activeren enzymen besloten in het cytoplasmatische deel van de receptor. Integrinen missen deze "intrinsieke enzymatische activiteit" en zijn dus afhankelijk van een tweede boodschapper. Een dergelijke boodschapper is "focal adhesion kinase" (FAK) dat na binding van het integrine met cytoplasmatische eiwitten zoals vinculine, een "focal adhesion" (FA) vormt, waarna signalen verder kunnen worden doorgegeven aan het cytoskelet en aan andere signaleringsroutes die bijvoorbeeld betrokken zijn bij de celproliferatie (figuur 4). Recent is ook de familie van de tetraspaninen beschreven als potentiële kandidaat voor de binding aan integrinen. De tetraspaninen worden zo genoemd omdat deze moleculen de celmembraan vier keer doorkruisen (figuur 5). Hun functie is nog grotendeels onbekend, maar wordt nu langzaam ontrafeld. Tetraspaninen zoals CD151 binden niet alleen aan integrinen, maar ook onderling en aan vele andere moleculen waaronder andere tetraspaninen en signaleringsmoleculen. Hierdoor kan er aan het celoppervlak een netwerk van tetraspaninencomplexen ontstaan (tabel 3). Waarschijnlijk is deze netwerkformatie nodig om verschillende signaleringscascades met elkaar te verbinden waardoor "informatie" kan worden uitgewisseld en de verschillende cascades op elkaar afgestemd kunnen worden. De onderzoeksgroep van Martin Hemler was een van de eerste die aantoonde dat de binding tussen integrinen en tetraspaninen plaats vindt tussen hun ECDs. Zij bestudeerden, net als ik, met name het integrine a.3(31 en het tetraspanine CD151 en lieten zien dat de onderlinge bindingsplaats op de integrine a keten juist boven het celoppervlak en op het tetraspanine op de grote extracellulaire lus (LEL) is gelegen. Bovendien werd aangetoond dat a.3[31 zeer sterk is gebonden aan CD151 en dat deze binding al tot stand komt in het endoplasmatisch reticulum, dus voordat a3 31 aan het celoppervlak tot expressie komt. In het verleden vroeg men zich af hoe het kan dat het extracellulaire deel van het integrine invloed kan uitoefenen op bepaalde cytoplasmatische signaleringsenzymen waar het integrine geen directe binding mee aan gaat. Dit raadsel is recent opgelost toen men kon aantonen dat bepaalde tetraspaninen deze signaleringsenzymen in het cytoplasma kunnen binden en tegelijkertijd via hun LEL binden aan het ECD van de integrine a keten. De familie van tetraspaninen groeit nog altijd omdat er steeds weer nieuwe "leden" worden ontdekt en doordat al eerder beschreven moleculen ook tot de tetraspanine familie blijken te behoren en daardoor vaak onder meerdere namen in de literatuur bekend zijn. Omdat dit proefschrift ook handelt over de weefseldistributie van de verschillende integrinen en tetraspaninen, wordt de weefselopbouw van de huid en de nier toegelicht. De huid is opgebouwd uit de opperhuid of epidermis die in contact staat met de buitenwereld en de ondergelegen lederhuid of dermis. De epidermis bestaat uit meerdere lagen. De onderste of basale cellaag zorgt voor de aanmaak van nieuwe cellen (keratinocyten) die vervolgens naar het oppervlak toe uitrijpen en uiteindelijk afsterven. Tussen de epidermis en dermis bevindt zich een basaalmembraan. Een basaalmembraan bevat altijd een of meerdere laminine isovormen en andere ECM moleculen. Hemidesmosomen zorgen voor een adequate binding van de basale cellaag van de epidermis aan de basaal membraan en de dermis. Hemidesmosomen zijn speciale structuren die met elektronenmicroscopisch onderzoek (een microscoop VII

4 die 1 miljoen maal kan vergroten) goed herkenbaar zijn en bevatten onder andere het laminine-bindende integrine oc6(34. De p4 keten is in tegenstelling tot de andere integrine (3 ketens zeer lang en kan vele andere voor een hemidesmosoom specifieke moleculen binden, zoals plectine, BP180 en BP230, welke nodig zijn voor de stabiliteit van een hemidesmosoom. Wanneer iemand geen a6[34 aanmaakt dan worden er ook geen hemidesmosomen gemaakt. Het gevolg is dat de epidermis loslaat van de dermis waardoor er blaren ontstaan. Cellen van patiënten die geen p4 aanmaken ((34 deficiënt; PA-JEB cellen) hebben wij gebruikt om de ontwikkeling van een hemidesmosoom te bestuderen (zie hieronder). Dit hebben wij onder andere gedaan door middel van transfectie. Transfectie is een moleculair biologische techniek waarbij (delen van) de genetische code van een eiwit (DNA) in de cel wordt gebracht waardoor de cel dit eiwit zelf gaat aanmaken. Net als van a6(34, was ook van a3(31 bekend dat het op de basale cellen van de epidermis zit, echter niet alleen aan de onderzijde waar de hemidesmosomen met a6(34 zich bevinden, maar ook aan de zijkanten tussen de keratinocyten. Op cel-cel kontakten tussen de keratinocyten bevinden zich adherens juncties die betrokken zijn bij de informatie overdracht tussen cellen, hetgeen bijvoorbeeld nodig is om gelijktijdig te differentiëren, af te sterven, of zich te verplaatsen. Ook in keratinocyten in kweek (in vitro), maar ook in endotheelcellen (bekleding van bloedvaten) in vitro en in vivo (in een (levend) organisme) wordt a3[31 zowel aan de onderzijde als tussen de cellen in adherens juncties aangetroffen. a3 31 lijkt dus niet zoals de andere laminine-bindende integrinen alleen maar betrokken bij de cel-matrix adhesie, maar ook bij de cel-cel adhesie. De opbouw van de nier is wat gecompliceerder dan die van de huid. Grofweg bestaat de nier uit schors en merg. In de schors bevinden zich de meeste filterlichaampjes of glomeruli en in het merg zijn voornamelijk de afvoerbuisjes (tubuli) van de glomeruli gelegen, omgeven door bloedvaatjes. De tubuli monden uiteindelijk uit in het nierbekken van waaruit de urine via de urineleider naar de blaas wordt afgevoerd. Een glomerulus (figuur 6A) is eigenlijk niets anders dan een vaatkluwen (arteriole) met aan de binnenzijde endotheelbekleding en aan de buitenzijde de podocyten, uitpuilend in de urineruimte (figuur 6B). De endotheelcellen en de podocyten worden van elkaar gescheiden door de glomerulaire basaal membraan (GBM), opgebouwd uit onder andere laminine. De vaatkluwen in de glomerulus is min of meer opgehangen aan het mesangium opgebouwd uit de mesangiale cellen met hun tussencelstof. De mesangiale cellen kunnen door hun contractiele eigenschappen de diameter van het bloedvat variëren en daarmee de bloeddruk in de glomerulus. De podocyten zijn hoog gespecialiseerde cellen bestaande uit een cellichaam met aan één zijde uitlopertjes (voetjes) waarmee zij op de basaal membraan staan. De voetjes worden even boven de GBM onderling verbonden door een dun "vliesje" (diafragma). Deze diafragmata zijn dus een vorm van cel-cel contacten en zijn in feite gemodificeerde adherens juncties zoals die ook op andere cellen voorkomen. In de podocytaire adherens juncties bevinden zich naast moleculen die in zijn algemeenheid voorkomen in adherens juncties zoals cadherine en catenine, vele specifieke moleculen zoals nefrine, podocine, ZO-1 en synaptopodine (figuur 8). Glomeruli hebben tot taak bloed te filteren en er zo urine van te maken. Daarbij mogen stoffen die belangrijk zijn voor het lichaam, zoals eiwitten, niet via de urine worden uitgescheiden. Afvalstoffen moeten juist wel worden afgevoerd. Wanneer eiwitten in de urine worden aangetroffen (proteïnurie) betekent dit dat de selectieve filterfunctie of doorlaatbaarheid van de glomerulus niet goed functioneert. Men denkt dat voor de selectieve doorlaatbaarheid de volgende, soms onderling samenhangende factoren van belang zijn: de VIM

5 samenhang van de endotheel cellen onderling en hun adhesie aan de GBM, de compositie van de GBM, en de integriteit van de epitheliale podocyten cellaag door middel van hun onderlinge samenhang en hun binding aan de GBM. De (embryonale) ontwikkeling van de nier (= nefrogenese; figuur 7) is een zeer complex proces waarbij uit dicht opeen gelegen cellen met vele differentiatie mogelijkheden (blasteem) zowel de tubuli als uiteindelijk ook de glomeruli zich ontwikkelen (resp. tubulogenese en glomerulogenese). De glomerulogenese bestaat achtereenvolgens uit een blaasjes- (figuur 7A), comma- en s-stadium (figuur 7B) gevolgd door maturatie naar het uiteindelijk volwassen stadium (figuur 7C). Tijdens de nefrogenese komen verschillende integrinen aan de verschillende celoppervlakken tot expressie (tabel 4). In de volledig ontwikkelde (adulte) glomerulus komt het integrine a3pm het meest voor en wordt tot expressie gebracht door alle aanwezige cellen, terwijl a6[31 de tubulus epitheelcellen aan de onderliggende tubulaire basaal membraan bindt. Bevindingen In hoofdstuk 2 beschrijven wij aan de hand van het gebruik van zelfgemaakte antilichamen die de verschillende cytoplasmatische varianten van a3 herkennen, de weefseldistributie en functionele eigenschappen van oc3a en a3b. a3a wordt door zowel epitheel, endotheel als spiercellen tot expressie gebracht, terwijl a3b alleen voorkomt op bepaalde endotheelcellen in de hersenen en het hart. Opvallend is dat o.3 31 niet alleen voorkomt op cel-matrix grensvlakken waar het zorgt voor adhesie van de cel aan de basaalmembraan, maar ook op cel-cel contacten waar het een rol kan spelen in functies die optreden na cel adhesie. Ofschoon a3a wel en a3b niet gefosforyleerd wordt, is er geen verschil in de liganden die zij kunnen binden. Recent werd aangetoond door de groep van Martin Hemler dat het verschil in de mogelijkheid tot fosforylering toch leidt tot een verschil in functie, daar a3a na fosforylering, vermoedelijk door rechtstreekse interactie met het cytoskelet, de cel van vorm doet veranderen. Hoofdstuk 3 is een beschrijvende studie over het distributie patroon van integrinen en matrix eiwitten in de (ontwikkelende) nier. De expressie en productie van integrinen en matrix componenten door podocyten en mesangiale cellen in vitro komt goed overeen met de in vivo situatie. Omdat wij geen beschikking hadden over glomerulaire endotheelcellen werden deze niet getest. Bovendien werd gebaseerd op de toen bekende literatuur destijds gedacht dat de podocyten de belangrijkste producenten waren van GBM componenten. Wij stelden echter vast dat de podocyten in vitro geen nidogen maken. Nidogen is een essentieel bestanddeel van een basaalmembraan dat zorgt voor de juiste driedimensionale structuur van de verschillende ECM componenten. Van endotheelcellen elders uit het lichaam was bekend dat zij nidogen produceren. Derhalve namen wij aan dat ook de gespecialiseerde endotheelcellen in de glomerulus deze ECM component voor de GBM zouden produceren. Recent is inderdaad aangetoond door St. John en Abrahamson dat de contributie van GBM componenten geproduceerd door glomerulaire endotheelcellen inderdaad veel groter is dan voorheen werd gedacht. Vroeg in de nefrogenese wordt tijdens de transformatie van mesenchym (blasteem) naar epitheel, een primitieve basaalmembraan gemaakt die laminine-1 bevat. De belendende cellen hechten aan deze basaalmembraan met a6b[31, dat ook op (primitieve) tubulus epitheelcellen tot expressie wordt gebracht. Tijdens de IX

6 glomerulogenese gaan de primitieve glomerulaire cellen andere laminine ketens produceren waardoor de samenstelling van de basaalmembraan verandert en laminine-1 geleidelijk wordt vervangen door laminine-10 en uiteindelijk laminine-11. Gelijktijdig met deze switch in de productie van laminine isovormen gaan de primitieve glomerulaire cellen a3a tot expressie brengen dat uiteindelijk ook het meest voorkomende integrine in de adulte glomerulus wordt en door alle glomerulaire cellen tot expressie wordt gebracht. Tijdens de nefrogenese vindt er geen switch plaats in de cytoplasmatische varianten van a3 of a6, zoals dat wel is beschreven voor a7 tijdens de myogenese (= ontwikkeling van spiercellen). Als eersten beschreven wij hoe oc8(31 door mesangiale cellen tot expressie wordt gebracht. Later bleek dat a8[31 een receptor is voor nefronectine, een belangrijke factor voor de transformatie van mesenchymale cellen naar epitheel, vroeg in de nefrogenese. In hoofdstuk 4 wordt beschreven hoe wij als eersten de aanwezigheid van een tetraspanine, CD151, in hemidesmosomen vaststelden. CD151 lijkt bovendien essentieel voor de ruimtelijke opbouw en maturatie van de hemidesmosomen. Keratinocyten die in vitro worden uitgezet veranderen van een afgeronde vorm naar een meer afgevlakte vorm, waarbij er een onder- en bovenkant ontstaat (= polarisatie). Vervolgens produceert de cel zelf laminine-5 dat focaal aan de onderzijde wordt gedeponeerd en waarop de cel met oc3p1, gebonden aan CD151, hecht. Wanneer vervolgens a6(34, vermoedelijk ook gebonden aan CD151, op deze prehemidesmosomale structuren hecht, verdwijnt a3(31 en ontstaan er hemidesmosomen. Dit zelfde gebeurt wanneer p4 deficiënte PA-JEB cellen met p4 worden getransfecteerd. Opvallend is dat de hoeveelheid CD151 aanwezig in hemidesmosomen sterk toeneemt nadat a6[34 op de prehemidesmosomale structuren is gehecht. Deze a6p4 gereguleerde toename van CD151 in hemidesmosomen wekte de suggestie nodig te zijn voor de vorming en stabiliteit van de hemidesmosomen tijdens hun volgroeiing en wordt mogelijk bewerkstelligd door de invloed van CD151 op de ruimtelijke ordening van de verschillende eiwitten waaruit de hemidesmosomen zijn opgebouwd. Met behulp van IL2R/(34 chimera's die bestaan uit het extracellulaire deel van de interleukine-2 receptor en het cytoplasmatische domein van [34, stelden wij vast dat voor toename van CD151 in hemidesmosomen (34 aan a6 gebonden moet zijn, hetgeen tevens bevestigt dat integrinen via hun a keten aan tetraspaninen binden. De andere geteste tetraspaninen aanwezig in keratinocyten, CD9, CD63 en CD81, co-lokaliseren niet met de hemidesmosomale structuren. Rond de hemidesmosomen bevinden zich "focal adhesions" (FAs). De functie van deze FAs is nog onduidelijk, maar wijkt in ieder geval af van de klassieke FAs die zich onder het celoppervlak bevinden en betrokken zijn bij de signalering van integrinen naar het cytoskelet na ligand-binding. In de klassieke FAs wordt geen a3(31/cd151 of vrij, niet aan a3p1 gebonden CD151 aangetroffen, maar in de FAs rond hemidesmosomen bevindt zich wel a3(31/cd151 dat ten dele aanwezig blijft, ook op het moment dat oc3 31/CD151 uit de hemidesmosomen verdwijnt. Hoofdstuk 5 handelt over de associatie van CD151 met de verschillende lamininebindende integrinen in vitro en in vivo. In hoofdstuk 4 lieten we al met behulp van biochemische analyse zien dat CD151 zowel aan a3 als aan a6 bindt. In dit hoofdstuk toonden we aan dat CD151 ook aan a7 bindt en dat de verschillende extracellulaire en cytoplasmatische varianten van de laminine-bindende integrinen deze binding niet lijken te beïnvloeden. Interessant is dat x

7 de binding tussen CD151 en a7 net zo sterk is als de binding tussen CD151 en oc3, waarvan wij, net als anderen, hadden vastgesteld dat die uitzonderlijk sterk is. Bij de binding van de verschillende laminine-bindende integrinen is steeds een zelfde epitoop (= deel van een eiwit waartegen antilichamen kunnen worden opgewekt) van CD151 betrokken, dat herkend wordt door het antilichaam TS151R. Door gebruik te maken van TS151R in vivo kregen wij aanwijzingen dat de interactie tussen CD151 en de laminine-bindende integrinen niet overal in het lichaam het zelfde is. Vermoedelijk wordt deze interactie specifiek per celtype gereguleerd door middel van signalering, hetgeen zou kunnen worden beïnvloed door het micromilieu van de cel. Wanneer een cel een laminine-bindend integrine gaat produceren, zoals gebeurt na transfectie van deze integrinen in K562 cellen die zelf geen laminine-bindende integrinen tot expressie brengen, dan neemt de hoeveelheid CD151 aan het celoppervlak toe. Deze toename, welke met name optreedt na transfectie met a3(31, werd later door anderen verklaard doordat zij aantoonden dat a3p1 al voordat het aan het celoppervlak tot expressie wordt gebracht is gebonden aan CD151. Dit verklaart bovendien waarom overal in het lichaam waar a3p1 tot expressie wordt gebracht, ook CD151 wordt aangetroffen. Het omgekeerde is echter niet het geval, want bijvoorbeeld bepaalde hematopoietische cellen (= cellen waaruit het bloed is opgebouwd, bijvoorbeeld K562 cellen) alsook fibroblasten (= steuncellen) bevatten wel CD151, maar geen laminine-bindende integrinen, hetgeen suggereert dat CD151 waarschijnlijk betrokken is bij meerdere functies. Om te zien of verschillende eiwitten zich min of meer op de zelfde plaats bevinden wordt confocale laserscan analyse toegepast. Dit wordt gedaan met behulp van dubbelkleuringen waarbij het ene eiwit wordt aangetoond d.m.v. groen-gelabelde antilichamen en een ander eiwit d.m.v. rood-gelabelde antilichamen. Wanneer de weefselcoupes met een confocale laserscan microscoop (CLSM) worden bestudeerd en beide eiwitten zich op dezelfde plaats bevinden, "versmelten" de kleuren en zijn dan zichtbaar als bijvoorbeeld geel. Ofschoon CD151 niet alleen met laminine receptoren van de integrine familie co-lokaliseert, maar ook met andere laminine receptoren zoals dystroglycan en de Lutherse bloedgroep antigenen, konden wij door middel van biochemische analyse van podocyten of proximale tubulus epitheelcellen geen directe associatie tussen CD151 en deze laminine-receptoren aantonen. In hoofdstuk 6 beschrijven wij in afwachting van de conditionele a3 knock-out muis (= een muis waarin de aanmaak van a.3 onder bepaalde condities kan worden gestopt) die door onze groep wordt gemaakt, het effect van interferentie met a3 op eiwit niveau door middel van het toedienen van a3 antilichamen in vivo in de rat. Hierbij wordt voor het eerst aangetoond dat ook in de glomerulus oc3(31 niet alleen voorkomt op celmatrix grensvlakken, maar ook op cel-cel contacten. Voor dit onderzoek hadden wij de beschikking over verschillende muizen monoclonale antilichamen tegen a3 van de rat, waarvan Ralph 3.2 de adhesie van cellen aan hun matrix kan blokkeren, terwijl Ralph 3.3 dit niet kan. In principe kan Ralph 3.2 a3 31 in vivo dus niet herkennen wanneer oc3pi betrokken is bij celadhesie. Daarom werden de antilichamen toegediend door middel van een onder de huid geplaatst pompje waaruit gedurende een week een constante afgifte van antilichamen aan het bloed plaatsvindt. Op deze wijze was het theoretisch ook voor Ralph 3.2 mogelijk om cc3 te herkennen, namelijk direct nadat a3p1 na productie aan het celoppervlak verschijnt en voordat het gaat binden aan laminine. De Ralph antilichamen werden toegediend aan ratten waarvan een deel zwanger was om zo ook te kijken wat de invloed zou zijn op de nefrogenese. XI

8 Co-lokalisatie van a3 31 met moleculen die alleen aanwezig zijn op de adherens juncties tussen podocyten, zoals podocine, ZO-1, P-cadherine en synaptopodine bevestigde onze hypothese dat ook in de podocyt a3p1 niet alleen voorkomt op celmatrix grensvlakken, maar ook op cel-cel contacten. Dit komt dus overeen met de bevindingen zoals die al waren aangetoond voor epitheel- en endotheelcellen elders in het lichaam. Co-lokalisatie werd aangetoond met behulp van confocale laserscan analyse, niet alleen door middel van indirecte fluorescentie met antilichamen tegen verschillende eiwitten op coupes, maar ook door co-lokalisatie van de diafragma eiwitten met a3 antilichamen in situ, na in vivo te zijn toegediend. Behalve dat a3 zich bevindt ter hoogte van adherens juncties in podocyten, werd ook co-lokalisatie aangetoond met VE-cadherine, aanwezig op adherens juncties tussen endotheel cellen. De in vivo toegediende Ralph antilichamen hadden geen invloed op de expressie van de verschillende geteste adherens junctie eiwitten, a3(31 zelf, of op de andere in de glomerulus aanwezige lamine-receptor, dystroglycan. Ook de expressie van bepaalde bij de signalering betrokken eiwitten, p-fak en p-erk, was niet veranderd. In tegenstelling tot de niet blokkerende Ralph 3.3 antilichamen die voornamelijk bonden aan de podocyt-zijde van de GBM, bonden de blokkerende Ralph 3.2 antilichamen voornamelijk aan de endotheelcellen die in verhouding tot de podocyt slechts een geringe hoeveelheid a3p1 tot expressie brengen. Bovendien werd Ralph 3.2 niet alleen aan het celoppervlak van de endotheelcellen aangetroffen, maar met name ook in hun cytoplasma. Deze internalisatie had vermoedelijk plaatsgevonden als gevolg van de binding van Ralph 3.2 aan het daar aanwezige a3(31, om vervolgens te worden gefagocyteerd (= opgegeten) en te worden afgebroken. Ofschoon de endotheelcellen na toediening van Ralph 3.2 ook bij elektronen microscopisch onderzoek afwijkingen lieten zien, leidde dit niet tot proteïnurie, waarmee tevens een ernstig probleem in de selectieve filter functie van de glomerulus werd uitgesloten. De ratten die Ralph 3.3 toegediend hadden gekregen hadden ook geen proteïnurie, noch waren er morfologische afwijkingen van de glomerulaire cellen. Behalve dat de verschillende Ralph antilichamen preferentieel op een verschillende plaats in de glomerulus binden, zijn de niet blokkerende antilichamen wel, maar de blokkerende antilichamen niet terug te vinden in de glomeruli van de foeten waarvan de moeders de antilichamen toegediend hebben gekregen. Het niet blokkerende Ralph 3.3 toonde vanaf het vasculaire stadium van de glomerulogenese een distributie patroon welke de primitieve GBM volgt. Het leek geen invloed te hebben op de expressie van een van de andere geteste adherens junctie eiwitten, noch op de nefrogenese, ofschoon over dit laatste alleen zekere uitspraken zijn te doen na uitgebreide morfometrische analyse. Dat de blokkerende antilichamen niet in foeten of pasgeborenen zijn terug te vinden is vermoedelijk het gevolg van de degradatie van antilichamen in combinatie met het wegvangen door endotheelcellen, zowel in het lichaam van de moeder als in de placenta. Daar Ralph 3.3 ruimschoots in de foeten en pasgeborenen werd teruggevonden was in ieder geval bewezen dat de antilichamen de placentabarrière wel goed kunnen passeren. XII