Nieuwe ontwikkeling voor het bepalen van de biodiversiteit en ecologische kwaliteit. Marco Jaspers Holger Cremer Timme Donders Frank Schuren

Transcriptie

1 Nieuwe ontwikkeling voor het bepalen van de biodiversiteit en ecologische kwaliteit. Marco Jaspers Holger Cremer Timme Donders Frank Schuren

2 Noodzaak: Europese Kaderrichtlijn Water Monitoring, onderhoud en verbetering van de ecologische kwaliteit van oppervlaktewateren verplicht Behoefte aan een krachtig en betrouwbaar instrument Gebaseerd op de samenstelling van indicator organismen 2

3 Doel van het Hydrochip project Ontwikkeling van een op DNA gebaseerd meetsysteem waarmee snel de samenstelling van de diatomeeën populatie kan worden vastgesteld om op die manier de ecologische kwaliteit te kunnen vaststellen. 3

4 Detectie van Waterorganismen via DNA Markergen (b.v. toxine, 16S) DNA EXTRACTIE GENERIEKE PCR MASS SEQUENCING ENKELSTRENGS MAKEN Mass Sequencing: Generiek Inzicht in Populatie Chip HYBRIDISATIE (BINDING) DNA Chip: - Generiek - Inzicht in Populatie

5 Voorbeeld van een research chip

6 Op zoek naar Markers: Open approach Onbevooroordeeld, niet gebaseerd op bestaande kennis. Focus op biodiversiteit en nieuwe markers Monsters geselecteerd op basis van diversiteit DNA isolatie gevolgd door mass sequencing 18s analysis for eukaryotes 16s analysis for prokaryotes

7 DNA targets Eukaryoten (waaronder diatomeeën en meeste algen): 18s rrna gen: aanwezig in alle eukaryoten, sterk geconserveerd, veel gebruikt voor taxonomie Prokaryoten (bacteriën): 16s rrna gen: aanwezig in alle bacteriën, sterk geconserveerd, veel gebruikt voor taxonomie, interessant voor blauwalgen

8 Flora analysis by 454 pyrosequencing Characteristics Next generation sequencing technique individual sequence runs in 10 hours! Short sequence tags: 16s rdna hypervariable regions Advantages: Provides very good view on composition complex flora Probes based on relevant sequence data 8

9 Sampling diverse locations

10 Biodiversity at phylum level Bacillariophyta(100) Total D inophyceae(100) Total O om ycetes(100) Total Cryptom onadales(100) Total Raphidophyceae(1 0 0 ) Total Eustigm atophyceae(100) Total Cnidaria(100) Total Pinguiophyceae(9 8 ) Total D ikarya(97) Total PX_clade(1 0 0 ) Total Porifera(8 7 ) Total Synurophyceae(96) Total Apicom plexa(100) Total Perkinsea(1 0 0 ) Total Porifera(6 3 ) Total Chrysophyceae(8 6 ) Total Arthropoda(1 0 0 ) Total Bacillariophyta(6 1 ) Total Streptophyta(1 0 0 ) Total Eustigm atophyceae(75) Total D ikarya(100) Total Chrysophyceae(100) Total PX_clade(99) Total Glom erom ycota(100) Total Synurophyceae(1 0 0 ) Total Chrysophyceae(96) Total D ikarya(98) Total Chrysophyceae(9 5 ) Total Porifera(100) Total Ciliophora(1 0 0 ) Total Raphidophyceae(9 3 ) Total Glom erom ycota(95) Total Glom erom ycota(93) Total Chrysophyceae(8 9 ) Total Porifera(8 8 ) Total Raphidophyceae(7 2 ) Total Ciliophora(8 4 ) Total Perkinsea(8 0 ) Total Synurophyceae(6 1 ) Total Synurophyceae(75) Total

11 Most abundant diatom sequences Organism blast Watertype M31 M08 R06 M12 R04 M01 M27 M27 M27 M07b x Waterlocatie HC-DEK- HC-ETE- HC-GAL- HC-GER- HC-HEI- HC-TEW- HC-TPN- HC-TPZ- HC-TPZ- HC-VEC- x sample ID 1_A4_HC- DEK _A6_HC- ETE _A9_HC- GAL _A11_HC 1_B4_HC- 1_C2_HC- 1_C6_HC- 1_C8_HC- 1_C9_HC- 1_C10_HC -GER-01.1 HEI-01.1 TEW-02.6 TPN-02.4 TPZ-02.4 TPZ VEC-03.4 x clusterseqs o4391 o4392 o4393 o4394 o4396 o4397 o4398 o4399 o4400 o4401 Grand Total Synedra ulna Total Gomphonema affine Total Cocconeis pediculus Total Stephanodiscus hantzschii Total Cyclotella meneghiniana Total Cyclotella cf. scaldensis G1W11 Total Navicula radiosa Total uncultured eukaryote Total Peridinium foliaceum endosymbiont Total Nitzschia thermalis Total Thalassiosira pseudonana Total Achnanthidium minutissimum Total Thalassiosira guillardii Total Encyonema minutum Total Synedra acus Total Nitzschia palea Total Cyclotella sp. CCMP331 Total uncultured diatom Total Navicula cryptocephala Total Planothidium lanceolatum Total Cymatopleura elliptica Total Eunotia implicata Total Nitzschia sigma Total

12 Samenvatting Open Approach Biodiversiteit kan door sequencing in kaart worden gebracht Vooral op phylum niveau Geen makkelijke link naar soorten Heel veel nieuwe sequenties: hoe hier mee om te gaan? De technologie is relatief duur en arbeidsintensief: nog geen routine

13 Searching for Markers: Closed approach To be able to compare results from molecular and microscopical analyses linking both datasets is essential For most indicator organisms currently no reliable DNA sequences available in databases! Unfortunately collecting living diatoms is not a standard approach as it is for many other living organisms. Therefore alternative approaches have been evaluated (culturing, single-cell analysis)

14 Attempts into experimental hydrobiology Culturing diatoms is not trivial Little expertise available, nearly no publications/books Expertise not present in NL, but is present in Gent Collaboration started with Wim Vijvermans and Pieter van Ormelingen, UGent technician TNO visited Gent for few days After some initial problems culturing started to work

15 Experiences culturing diatoms Culturing diatoms is feasible Protocols are available for certain well-studied genera Growth is slow In our experience obtaining a diverse collection of species is very difficult: some species are encountered all the time, whereas many others get easily lost Considering the amount of time and effort in relation to the outcome we decided to quit this path

16 Micromanipulator for single-cell analysis

17 Some examples

18 Approach used Pick single diatoms with micromanipulator Put cell in eppendorf cup and perform PCR amplification of specific gene fragment Perform a second nested PCR reaction to obtain sufficient material for sequencing Sequence analysis through Sanger sequencing Collect diatom from samples Embed single diatom Perform species determination through microscopy Link DNA-sequence to species name

19 Results single-cell analysis The good news is: it worked! The bad news is: it is very laborious and success rate is low Complex protocol with failures at each step: Capillary size/diatom size Getting diatom out of capillary into eppendorf cup Obtaining PCR product Retrieving diatoms Orientation embedded diatoms Ability to determinate single valves In total 600 DNA sequences were determined!

20 Wish list Herman van Dam: 150 most abundant species in NL Nr %monster s gemiddelde abundantie (%) cumulatieve abundantie (%) Taxon zout 1 67,33 15,25 15,25 Achnanthidium minutissimum zoet 2 64,11 9,73 24,98 Cocconeis placentula s.l. zeer licht brak 3 70,95 4,84 29,81 Gomphonema parvulum zoet 4 46,92 2,62 32,44 Rhoicosphenia abbreviata zeer licht brak 5 35,39 2,62 35,06 Eunotia bilunaris zeer zoet 6 37,55 2,18 37,24 Nitzschia paleacea zoet 7 50,73 1,81 39,05 Nitzschia palea zoet 8 38,07 1,78 40,83 Gomphonema olivaceum zoet 9 42,39 1,64 42,47 Navicula gregaria zeer licht brak 10 38,07 1,56 44,03 Eolimna minima zoet 11 8,91 1,48 45,51 Eunotia exigua [1] zeer zoet 12 32,92 1,41 46,92 Amphora pediculus zoet 13 24,60 1,17 48,09 Melosira varians zoet 14 27,28 1,14 49,23 Nitzschia frustulum zeer licht brak 15 23,39 1,14 50,36 Diatoma tenuis zeer licht brak 16 19,17 0,95 51,32 Fragilaria famelica zeer licht brak 17 29,85 0,93 52,25 Tabularia tabulata-groep licht brak 18 20,09 0,88 53,13 Fragilaria capucina s.l. zoet 19 10,05 0,88 54,01 Tabellaria flocculosa zeer zoet 20 34,71 0,86 54,87 Navicula cryptotenella zoet

21 Hydrochip analyses In 2010 and 2011 several hundreds of samples were analyzed by microscopy and Hydrochip analysis Because of differences in species coverage direct comparison of results was not yet possible Molecular analysis shows species not detected by microscopy and vice versa To enable comparison of data we turned to an ecological parameter comparison: trophy calculation

22 Comparison results after translation to eutrophy level phytoplankton phytobenthos

23 Current situation Translation of data to ecological parameters works reasonably well (except for oligotrophic samples for which indicator species sequences are lacking) Current research chip is translated to routine chip containing about 150 reliable probes Implementation of technology will be part of new EU-Life project which most likely will start later this year In this project we want to make the translation from prototype to implementation (Vitens)

24 Van Diatomee naar Ecologische Kwaliteit Sample preparation DNA Isolatie Trofiegraad PCR, DNA labelling Binding op chip Vertaalslag 24 Data Analyse HYDROCHIP

25

26 Toekomst: Opschaling naar verschillende type indicatororganismen mogelijk Naast diatomeeën Waterplanten Macro evertebraten Blauwalgen Meerdere indicatoren geven mogelijk een gedetailleerder beeld van de ecologische kwaliteit

27 Verdere toekomst: Lab on a Chip Automatisering en miniaturisering van: - monstervoorbewerking - DNA isolatie en labelling - DNA binding op chip en detectie - Analyse en interpretatie Mogelijkheid tot online monitoring van waterkwaliteit

28 Voordelen Hydrochip in de toekomst: Objectiever want gestandaardiseerde en op termijn geautomatiseerde methode Analyse van groot aantal relevante organismen in ecosysteem Snel resultaat: dus snel sturing op basis van analyse resultaten mogelijk Intensievere analyses mogelijk (meer tijdstippen, meer locaties etc) Goedkoper dan huidige analyses

29 Partners: STOWA: Bas vd Wal, Tessa vd Wijngaart TNO: Frank Schuren, Holger Cremer, Timme Donders, Jordy Coolen, Jolanda Kool, Heleen Koolmees, Marco Jaspers Vitens: Bendert de Graaf, Mark Kiestra, Adrie Atsma, Wouter v Delft Hoogheemraadschap Hollands Noorderkwartier Gert van Ee 29 Waternet Ron vd Oost

30 30

31 31

32 32 Van researchchip naar eerste praktijkchip

33 33 DNA bindingspatroon (Legionella chip)

34 Toekomst: Opschaling in aantal samples mogelijk

35

36 Comparison current and new approach

37 Workflow array development Samples array development and analysis analysis DNA isolation array development DNA isolation sample analysis Microbial flora analysis by 454 sequencing Automated selection microarray probes multi-well chip printing microtiter format DNA isolation and labeling multi-well hybridization scan results for data interpretation Data analysis and interpretation 37

38 Habitat type hydrochip 38 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 Habitat type microscopy

39 Additional results for free: Cyanobacteria

40 Cyanobacteria abundance during the season