UvA-DARE (Digital Academic Repository) Endothelial cell-derived microparticles Abid Hussein, M.N. Link to publication Citation for published version (APA): Abid Hussein, M. N. (2008). Endothelial cell-derived microparticles General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: http://uba.uva.nl/en/contact, or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (http://dare.uva.nl) Download date: 27 Oct 2017
Chapter 8 Algemene discussie en samenvatting 153
Algemene discussie en samenvatting Doel van dit proefschrift In dit proefschrift zijn de antigene opmaak (hoofdstuk 2) en fosfolipidensamenstelling (hoofdstuk 3) van micropartikels (MP) van endotheelcellen (EMP) onderzocht. Daarnaast is de relatie bestudeerd tussen de vorming van micropartikels door endotheelcellen en hun loslaten van de kweekbodem (hoofdstukken 4 en 5). Ook is het vermogen van EMP onderzocht bij het initiëren van een trombus in vivo (hoofdstuk 3) en is hun bijdrage onderzocht aan het mogelijk beschermen van de endotheelcel tegen apoptose (hoofdstuk 6). Identificeren van EMP De cellulaire herkomst van MP wordt meestal vastgesteld door de aanwezigheid van unieke en veelal celspecifieke oppervlakte merkers te meten. In de meeste wetenschappelijke studies worden dan ook monoklonale antistoffen gebruikt die zijn gericht tegen dergelijke specifieke antigenen (positieve identificatie). Ook kunnen antistoffen worden gebruikt die juist gericht zijn tegen antigenen die niet op EMP worden geëxposeerd (exclusie). Zowel positieve identificatie als exclusie experimenten gaan uit van de veronderstelling dat dezelfde antigenen aanwezig zijn op de cellen en de van deze cellen afkomstige MP. Een voorbeeld van een merker die wordt gebruikt voor positieve identificatie is de endotoxine receptor (CD14), die alleen aanwezig is op monocyten en op MP van deze cellen (monocyten-mp; MMP). Zowel monocyten als MMP kunnen dus worden geïdentificeerd door gebruik te maken van een antistof tegen CD14. Omdat CD14 exclusief wordt geëxposeerd op MMP, kunnen deze positief worden herkend in een mengsel van MP afkomstig van verschillende soorten cellen. De meestal hiervoor gebruikte techniek is flowcytometrie. Een voorbeeld van exclusie is het gebruik van een antistof gericht tegen glycoproteïne Ib (CD42). Gebruikmakend van een anti-cd42 antistof kunnen, bijvoorbeeld in een plasmamonster, CD42-negatieve (EMP) en CD42- positieve MP (MP die van bloedplaatjes afkomstig zijn; PMP) van elkaar worden onderscheiden. Het gebrek aan consensus tussen onderzoekers over de wijze waarop EMP in menselijke lichaamsvloeistoffen het best kunnen worden geïdentificeerd, blijkt duidelijk uit Tabel 1 (pagina 18). Deze tabel laat zien dat meer dan 20 verschillende 154
Chapter 8 antistoffen of combinaties van antistoffen zijn gebruikt om EMP te identificeren, hetzij door positive identificatie (bijvoorbeeld CD146, CD62E en CD144) of door exclusie (bijvoorbeeld CD31+/CD42-). Om verschillende redenen zijn EMP moeilijk te identificeren. In hoofdstuk 2 wordt aangetoond dat de vitronectine receptor, ook wel integrine v 3 (CD51, CD61) genoemd, is geëxposeerd op menselijke navelstrengendotheelcellen, terwijl deze receptor niet of nauwelijks op EMP aanwezig is. Om EMP te identificeren worden vaak antistoffen gebruikt die gericht zijn tegen de adhesie receptor PECAM-1 (CD31; platelet-endothelial cell adhesion molecule-1). In hoofdstuk 2 wordt aangetoond dat deze receptor niet alleen op EMP maar ook op PMP aanwezig is. Dit maakt identificatie van EMP in humane plasmamonsters lastig, omdat PMP veel algemener zijn dan EMP. Ook laat dit hoofdstuk zien dat EMP in het door ons gebruikte model systeem, dat willen zeggen gekweekte humane navelstrengendotheelcellen die worden gestimuleerd met de ontststekingsmediator interleukine-1 (IL-1 ), een grote variatie laten zien in hun antigene opmaak. Omdat in vivo verschillende soorten endotheelcellen voorkomen en deze zich in een steeds veranderende omgeving bevinden, mag worden verondersteld dat ook ex vivo tal van populaties EMP voorkomen die onderling een aanzienlijke variatie kunnen vertonen in hun antigene opmaak. Samengevat, de zoektocht naar een universele merker of combinaties van merkers die ex vivo alle EMP zou kunnen identificeren, is dan ook uitzonderlijk complex. E-selectine weerspiegelt endotheelcel activatie E-selectine (CD62E) is een cel-specifieke adhesie receptor die alleen op gestimuleerde endotheelcellen tot expressie wordt gebracht. Hoofdstuk 2 laat zien dat een subpopulatie van EMP, afkomstig van IL-1 -gestimuleerde endotheelcellen, E-selectine exposeert. Deze expositie bevestigt niet alleen hun cellulaire herkomst, maar geeft tevens aan dat de endotheelcellen geactiveerd waren tijdens het afsnoeren van EMP. E-selectine wordt niet op PMP gevonden. Deze merker kan dus worden gebruikt om EMP, afkomstig van geactiveerde endotheelcellen, positief te identificeren. Uit de experimenten, beschreven in hoofdstuk 2, bleek dat ongeveer 50% van het E-selectine antigeen in het kweeksupernatant geassocieerd was met EMP. Met andere woorden, het niet- 155
Algemene discussie en samenvatting celgebonden, zogenaamd soluble E-selectine omvat ten minste twee vormen die tegelijkertijd aanwezig kunnen zijn: het EMP-geassocieerde en het niet-empgeassocieerde (het echt soluble ) E-selectine. In een eerdere studie is door ons de aanwezigheid onderzocht van MP-geassocieerd E-selectine in plasmamonsters van patiënten met sepsis en meervoudig orgaanfalen. Deze plasmamonsters bevatten verhoogde concentraties van het E-selectine antigeen. De hoeveelheid E-selectine die geassocieerd was met EMP in deze patiënten bleek echter klein te zijn [1]. In welke mate selectines of andere niet cel-gebonden receptoren geassocieerd zijn met (E)MP in vivo is onbekend. Fosfolipidensamenstelling van EMP In hoofdstuk 3 wordt aangetoond dat EMP, afkomstig van IL-1 -gestimuleerde endotheelcellen, verrijkt zijn in fosfatidylserine (PS) en fosfatidylethanolamine (PE). De fosfolipidensamenstelling van EMP is dus mede afhankelijk is van activatie van endotheelcellen. Omdat de fosfolipidensamenstelling van alle EMP is gemeten, kan niet worden uitgesloten dat er verschillen bestaan in fosfolipidensamenstelling tussen EMP. Dit kan relevant zijn, omdat bijvoorbeeld in hoofdstuk 2 is aangetoond dat minder dan 20% van de EMP detecteerbare hoeveelheden van het weefselfactor antigeen exposeert na stimulering van de endotheelcellen met IL-1. In hoeverre de fosfolipidensamenstelling van weefselfactor-exposerende EMP verschilt van EMP die geen weefselfactor exposeren, moet nader worden onderzocht. Ook blijft de vraag onbeantwoord in hoeverre de waargenomen veranderingen in de totale fosfolipidensamenstelling ook het lipide oppervlak van de MP betreffen (hoofdstuk 3). Relatie tussen EMP, niet-adherente en adherente endotheelcellen Zoals in de inleiding van dit proefschrift al is aangegeven (pagina 16), komen zowel in vitro als in vivo niet-adherente ( losse ) endotheelcellen, adherente ( vaste ) endotheelcellen en EMP naast elkaar voor. In hoeverre EMP afkomstig zijn van nietadherente endotheelcellen en/of van adherente endotheelcellen, is onbekend. In hoofdstuk 4 hebben wij in vitro de relatie onderzocht tussen EMP, niet-adherente en adherente 156
Chapter 8 endotheelcellen. Er bleek een sterke positieve correlatie te zijn tussen de aantallen nietadherente endotheelcellen en EMP. Ook bleken, in tegenstelling tot adherente endotheelcellen, zowel niet-adherente endotheelcellen als EMP caspase 3 te bevatten. Naar aanleiding van deze resultaten hebben wij gepostuleerd dat de meeste EMP afkomstig zijn van niet-adherente endotheelcellen. Toch sluiten deze resultaten niet uit dat een deel van de EMP, wel of niet caspase 3 bevattend, afkomstig is van adherente endotheelcellen. Om meer inzicht te krijgen in de ingewikkelde relatie tussen EMP, niet-adherente en adherente endotheelcellen, zijn de effecten onderzocht van het cholesterolverlagende medicijn simvastatine. Simvastatine wordt verondersteld in vivo de conditie van het endotheel te verbeteren, maar in vitro zijn de resultaten tegenstrijdig. In hoofdstuk 5 wordt aangetoond dat simvastatine, in concentraties die ook in de kliniek worden toegepast, adherente endotheelcellen niet lijkt te beïnvloeden. Wel werd een opvallende toename waargenomen van de aantallen niet-adherente endotheelcellen en EMP. Beide effecten konden weer ongedaan worden gemaakt door de biosynthese van cholesterol te herstellen of de prenylering van eiwitten weer mogelijk te maken. Deze resultaten bevestigen dat het loslaten van endotheelcellen en het afsnoeren van EMP nauwgeassocieerde processen zijn. Deze resultaten laten ook zien dat om een volledig inzicht te krijgen in de conditie van de adherente endotheelcellen, en dus mogelijk ook van het endotheel in vivo, niet alleen naar adherente endotheelcellen moet worden gekeken, maar ook naar de niet-adherente, circulerende endotheelcellen en EMP. Mogelijke functies van EMP Trombus vorming Tot nu toe hebben veel studies zich gericht op de aanwezigheid van (E)MP in diverse ziekten. Omdat in veel studies een toename van PMP is gevonden en deze PMP stollingsbevorderend zijn ex vivo, wordt algemeen verondersteld dat (E)MP ook een rol spelen bij de stolling in vivo. In hoofdstuk 3 is onderzocht of EMP het ontstaan van een trombus kunnen initiëren in een proefdiermodel (veneus stase model; rat). Hierbij is aangetoond dat EMP van gestimuleerde endotheelcellen in staat zijn weefselfactorafhankelijke trombusvorming te initiëren. Omdat deze EMP ook verrijkt zijn in PS en PE, 157
Algemene discussie en samenvatting beide cofactoren van weefselfactor-gemedieerde stolling, mag worden aangenomen dat dergelijke EMP speciaal zijn toegerust om in vivo de stolling te initiëren. Deze bevinding komt overeen met eerdere onderzoeksresultaten van onze groep, waarin werd aangetoond dat ook weefselfactor-exposerende MP, afkomstig uit humaan wondbloed, weefselfactorafhankelijke stolling initiëren in hetzelfde proefdiermodel [2]. Cellulaire overleving Hoofdstuk 4 laat zien dat in het kweekmedium van navelstrengendotheelcellen altijd caspase 3-bevattende EMP aanwezig zijn. Dit zou geïnterpreteerd kunnen worden als het resultaat van een continu fysiologisch proces. Onlangs is in een soortgelijke studie aangetoond dat kweekmedia van diverse soorten gezonde cellen ook een ander type vesicles kunnen bevatten. Deze vesicles, exosomen, blijken ook een caspase 3-achtige activiteit te bevatten [3]. De auteurs van dit artikel hebben verondersteld dat het verpakken van een actief caspase in exosomen een mechanisme kan zijn dat bijdraagt aan cellulaire overleving. In hoofdstuk 6 wordt verondersteld dat een deel van de caspase 3- bevattende EMP afkomstig kan zijn van adherente endotheelcellen. Door het voor de cel potentieel gevaarlijke caspase 3 te verwijderen middels het afsnoeren van caspase 3- bevattende EMP, zouden endotheelcellen mogelijk beter kunnen overleven. De resultaten in dit hoofdstuk tonen aan dat het aannemelijk is dat een aantal EMP inderdaad rechtstreeks afkomstig is van adherente endotheelcellen. Tevens wordt aangetoond dat het remmen van het afsnoeren van EMP leidt tot het accumuleren van caspase 3, het loslaten van endotheelcellen en het ondergaan van geprogrammeerde celdood (apoptose). Andere mogelijk functies Onlangs hebben del Conde en medewerkers aangetoond dat de membranen van weefselfactor-exposerende MMP mogelijk versmelten met geactiveerde bloedplaatjes, waardoor het stollingsbevorderend weefselfactor wordt overgedragen [4]. Omdat de fusie van membranen wordt bevorderd door PS, werd door hem verondersteld dat de weefselfactor-exposerende MP verrijkt zouden kunnen zijn in PS. Onze resultaten, zoals beschreven in hoofdstuk 3, bevestigen deze veronderstelling. Als dit model inderdaad 158
Chapter 8 valide is, dan mag worden aangenomen dat de overdracht van weefselfactor ook andere functies van dit eiwit, zoals bevordering van angiogenese, signaal overdracht en bescherming tegen apoptose, kan overdragen. MP fracties, geïsoleerd uit plasmamonsters van patiënten met preeclampsie, acuut myocard infarct of nierfalen, verstoren de endotheel-afhankelijke vaatverwijding [5-7]. Er zijn meerdere aanwijzingen dat EMP een mogelijk rol spelen in dit proces. Ten eerste wordt de NO-gemedieerde vaatverwijding wel geremd door geïsoleerde EMP uit plasmamonsters van patiënten met nierfalen, maar niet door PMP afkomstig uit dezelfde monsters [7]. Ten tweede remmen in vitro gemaakte EMP de endotheel-gemedieerde vaatverwijding [8-10]. Ten derde is er een verband tussen de aantallen circulerende EMP en de afname van de flow-gemedieerde vaatverwijding in patiënten met nierfalen en in patiënten met diabetes type 2 [7,11]. Via welke mechanismen EMP en andere typen MP het endotheel beïnvloeden, is onbekend. Een mogelijk mechanisme zou kunnen zijn dat membranen van (E)MP en endotheelcellen versmelten, waardoor intravesiculaire moleculen, zoals bijvoorbeeld caspase 3, kunnen worden overgebracht naar het cytosol. In een eerdere studie hebben wij aangetoond dat geïsoleerde fracties van MP uit plasmamonsters van preeclamptische patiënten in vitro de genexpressie van endotheelcellen niet beïnvloeden [12]. Mogelijke verklaringen voor het ontbreken van een effect in dit systeem zouden kunnen zijn dat in onze experimenten veneuze endotheelcellen zijn gebruikt, terwijl arteriële endotheelcellen zijn gebruikt in studies naar endotheel-afhankelijke vaatverwijding. Onze eerdere experimenten zijn bovendien uitgevoerd onder statische omstandigheden, dus zonder shear (schuifkracht). Mogelijk is deze kracht nodig voor een interactie tussen EMP en endotheelcellen. Een onlangs beschreven mechanisme is overdracht van mrna door MP afkomstig van embryonale stamcellen aan hematologische stamcellen, waardoor celdeling en differentiatie van deze cellen worden bevorderd [13]. Klinische relevantie en toekomstige ontwikkelingen In de literatuur wordt de aanwezigheid van EMP bij diverse ziekten in verband gebracht met een verstoorde functie van het endotheel. In dit proefschrift wordt aangetoond dat het afsnoeren van EMP ook een voordeel kan opleveren voor 159
Algemene discussie en samenvatting endotheelcellen (Hoofdstuk 6) en dat een toename van EMP (dus) niet noodzakelijkerwijs een merker is voor endotheel activatie of dysfunctie (hoofdstuk 5). Er is steeds meer bewijs dat niet alleen endotheelcellen maar ook andere soorten cellen hun vesicles gebruiken als transportmiddel. Deze vesicles vervoeren afval of andere voor de cel- schadelijke stoffen, en dragen bij aan de communicatie tussen cellen onderling. Gram-negatieve bacteriën snoeren MP af die zowel communicatie signalen als toxinen bevatten. Deze toxinen zijn gericht tegen andere soorten bacteriën en gastheercellen. Vermoedelijk is de afgifte van vesicles aan de omgeving een sterk geconserveerd proces. Experimenten met een gram-negatieve bacterie, Pseudomanas aeruginosa, hebben laten zien dat een intravesiculair signaal molecuul zelf het verpakken in de vesicles van deze bacterie bevordert [14,15]. Onze resultaten met betrekking tot het aanwezig zijn van caspase 3 in EMP passen mogelijk ook in dit model. Uit de literatuur is bekend dat de borsttumor cellijn MCF-7 caspase 3-deficiënt is. Omdat MCF-7 cellen geen MP afsnoeren, zou de aanwezigheid van caspase 3 dus een voorwaarde kunnen zijn voor het afsnoeren van MP. Na transfectie met een caspase 3-construct snoeren MCF-7 cellen ook MP af [16]. Soortgelijke studies, uitgevoerd in ons laboratorium, hebben aangetoond dat MP van MCF-7 cellen, na transfectie met caspase 3 construct, ook zelf caspase 3 bevatten. Mogelijk is dus ook caspase 3 betrokken bij het verpakken in MP. Dergelijke resultaten bevestigen het model dat diverse soorten cellen hun MP gebruiken als afvalbak om caspase 3 te verwijderen. In hoeverre niet alleen MP maar ook andere soorten vesicles, zoals exosomen, bijdragen aan het verwijderen van caspase 3 moet nader worden onderzocht. Tijdens het onderzoek dat heeft geleid tot dit proefschrift is de interesse geleidelijk verschoven van het identificeren en de functies van EMP naar een onderliggende en wellicht veel fundamentelere vraag, namelijk waarom (endotheel) cellen vesicles afgeven aan hun omgeving. Dit proefschrift toont aan dat het concept van circulerende EMP als merkers die de conditie van het endotheel weerspiegelen, mogelijk een onderschatting is van hun biologische en klinische relevantie. Bijvoorbeeld de experimenten met simvastatine hebben aangetoond dat adherente endotheelcellen vitaal lijken te blijven ondanks een toename van EMP en niet-adherente endotheelcellen 160
Chapter 8 (hoofdstuk 5). Bovendien hebben onze resultaten laten zien dat er een verband bestaat tussen aantal EMP en het loslaten van de endotheelcellen in vitro. Het zal duidelijk zijn dat deze resultaten de veronderstelde directe relatie die zou bestaan tussen adherente en niet-adherente endotheelcellen en EMP complexer maakt. De laatste tien jaar is de wetenschappelijke en klinische interesse voor de diverse soorten blaasjes, MP en exosomen, sterk toegenomen. In het medisch onderzoek wordt de aanwezigheid van blaasjes in vivo niet meer beschouwd als een in vitro artefact, maar als een vaststaand feit. Er zijn verschillende toekomstige ontwikkelingen te verwachten met betrekking tot het standaardiseren van de isolatie en detectieprotocollen van (E)MP. In hoeverre het meten van aantallen (E)MP in klinische monsters daadwerkelijk als maat kan dienen voor het niet goed functioneren van cellen, de ernst van de ziekte, stolling of ontsteking, moet nader worden onderzocht. Op basis van de beschikbare wetenschappelijke literatuur en onze resultaten zoals beschreven in dit proefschrift, wordt verondersteld dat het afgeven van vesicles aan de omgeving een in de evolutie geconserveerd proces is, dat kan bijdragen aan de overleving van cellen. Samengevat, het lijkt niet alleen van belang te zijn om vesicles te isoleren en hun talrijke functies te bestuderen in vitro en in vivo, maar het is wellicht even belangrijk om de meer fundamentele vraag te beantwoorden waarom cellen dergelijke multi-purpose vesicles afgeven aan hun omgeving. 161
Algemene discussie en samenvatting References 1. Osmanovitch N, Romijn FPHTM, Joop K, Sturk A, Nieuwland R. Soluble selectins in sepsis: microparticle-associated, but only to a minor degree. Thromb. Haemost. 2000;84:731-2. 2. Biró É, Sturk-Maquelin KN, Vogel GM, Meuleman DG, Smit MJ, Hack CE, Sturk A, Nieuwland R. Human cell-derived microparticles promote thrombus formation in vivo in a tissue factor-dependent manner. J. Thromb. Haemost. 2003;1:2561-8. 3. de Gassart A, Geminard C, Fevrier B, Raposo G, Vidal M. Lipid raft-associated protein sorting in exosomes. Blood 2003;102:4336-44. 4. Del Conde, I, Shrimpton CN, Thiagarajan P, Lopez JA. Tissue-factor-bearing microvesicles arise from lipid rafts and fuse with activated platelets to initiate coagulation. Blood 2005;106:1604-11. 5. VanWijk MJ, Svedas E, Boer K, Nieuwland R, VanBavel E, Kublickiene KR. Isolated microparticles, but not whole plasma, from women with preeclampsia impair endothelium-dependent relaxation in isolated myometrial arteries from healthy pregnant women. Am. J. Obstet. Gynecol. 2002;187:1686-93. 6. Boulanger CM, Scoazec A, Ebrahimian T, Henry P, Mathieu E, Tedgui A, Mallat Z. Circulating microparticles from patients with myocardial infarction cause endothelial dysfunction. Circulation 2001;104:2649-52. 7. Amabile N, Guerin AP, Leroyer A, Mallat Z, Nguyen C, Boddaert J, London GM, Tedgui A, Boulanger CM. Circulating endothelial microparticles are associated with vascular dysfunction in patients with end-stage renal failure. J. Am. Soc. Nephrol. 2005;16:3381-8. 8. Densmore JC, Signorino PR, Ou J, Hatoum OA, Rowe JJ, Shi Y, Kaul S, Jones DW, Sabina RE, Pritchard KA, Jr., Guice KS, Oldham KT. Endothelium-derived microparticles induce endothelial dysfunction and acute lung injury. Shock 2006;26:464-71. 9. Esposito K, Ciotola M, Schisano B, Gualdiero R, Sardelli L, Misso L, Giannetti G, Giugliano D. Endothelial microparticles correlate with endothelial dysfunction in obese women. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2006;91:3676-9. 10. Brodsky SV, Zhang F, Nasjletti A, Goligorsky MS. Endothelium-derived microparticles impair endothelial function in vitro. Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol. 2004;286:H1910-H1915. 162
Chapter 8 11. Tushuizen ME, Nieuwland R, Rustemeijer C, Hensgens BE, Sturk A, Heine RJ, Diamant M. Elevated endothelial microparticles following consecutive meals are associated with vascular endothelial dysfunction in type 2 diabetes. Diabetes Care 2007;30:728-30. 12. Lok CA, Böing AN, Reitsma PH, van der Post JA, van BE, Boer K, Sturk A, Nieuwland R. Expression of inflammation-related genes in endothelial cells is not directly affected by microparticles from preeclamptic patients. J. Lab Clin. Med. 2006;147:310-20. 13. Ratajczak J, Miekus K, Kucia M, Zhang J, Reca R, Dvorak P, Ratajczak MZ. Embryonic stem cell-derived microvesicles reprogram hematopoietic progenitors: evidence for horizontal transfer of mrna and protein delivery. Leukemia 2006;20:847-56. 14. Winans SC. Microbiology: bacterial speech bubbles. Nature 2005;437:330. 15. Mashburn LM, Whiteley M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature 2005;437:422-5. 16. Janicke RU, Sprengart ML, Wati MR, Porter AG. Caspase-3 is required for DNA fragmentation and morphological changes associated with apoptosis. J. Biol. Chem. 1998;273:9357-60. 163
164