Code K tests voor gebruik op de Dako Autostainer

c-kit pharmdx Code K 1907 35 tests voor gebruik op de Dako Autostainer Toepassing Voor in-vitrodiagnostiek. De c-kit pharmdx -assay is een kwalitatief, immunohistochemisch (IHC) kitsysteem voor gebruik op de Dako Autostainer, bedoeld voor de identificatie van expressie van het c-kit-eiwit/cd117-antigeen (c-kit-eiwit in normale en neoplastische in paraffine ingebedde weefsels voor histologische beoordeling. De c-kit pharmdx polyklonale konijnenantilichamen detecteren met name het c-kit-eiwit in cellen die CD117-antigeen tot expressie brengen. De c-kit pharmdx is geïndiceerd als hulpmiddel bij de differentiële diagnose van gastrointestinale stromale tumoren (GIST). Na het diagnosticeren van GIST kunnen de resultaten verkregen met c-kit pharmdx worden gebruikt als hulpmiddel bij het identificeren van de patiënten die in aanmerking komen voor een behandeling met Gleevec /Glivec (imatinib mesilaat). De resultaten van de hematoxyline- en eosinekleuringen (H&E) en een panel antilichamen kunnen van nut zijn bij de differentiële diagnose van GIST. De beoordeling moet worden uitgevoerd door een bevoegde patholoog binnen de context van de klinische voorgeschiedenis van de patiënt en van andere diagnostische onderzoeken en met de juiste controles. Opmerking: Deze test is niet bedoeld als het enige uitgangspunt voor het diagnosticeren van GIST en niet bedoeld als het enige uitgangspunt voor de keuze van Gleevec/Glivec als behandeling. Het resultaat van c-kit negatieve GIST-patiënten behandeld met Gleevec/Glivec is niet vastgesteld. Een negatief resultaat sluit niet per definitie de diagnose GIST uit, noch een behandeling met Gleevec/Glivec 1,2,3 Alle patiënten in het Novartis Gleevec/Glivec klinisch onderzoek werden geselecteerd met behulp van een Novartis Clinical Trial Protocol (NCTP). Het primaire anti-c-kit polyklonale konijnenantilichaamreagens dat in het NCTP werd gebruikt, was afkomstig van Dako. Het c-kit pharmdx primaire polyklonale antilichaamreagens heeft dezelfde methode van productie, zuivering en kwaliteitscontrole ondergaan als het NCTP polyklonale anti-c-kit-reagens. Samenvatting en uitleg Inleiding Het proto-oncogen c-kit, ook bekend als CD117-antigeen of stamcelfactor-receptor, is een type III transmembraan tyrosinekinasereceptor van 145 kd. Het c-kit-gen codeert voor een transmembraan tyrosinekinasereceptor die structureel overeenkomt met de platelet derived growth factor -receptoren A en B alsmede met de koloniestimulerende factor-1-receptor en aangenomen wordt dat dit gen een belangrijke rol speelt bij de hematopoëse, spermatogenese en melanogenese. Het c-kit-eiwit bevat extracellulaire domeinen met 5 Ig-achtige loops, een uiterst hydrofoob transmembraandomein en een intracellulair domein met tyrosinekinase-activiteit gesplitst door een kinase-inzet in een ATP-bindingsregio en in een fosfotransferasedomein. De receptoractivatie gaat gepaard met receptordimerisatie, substraatfosforylering en autofosforylering, receptorinternalisatie, activering van eiwitkinases en fosfolipases en de transcriptie van verschillende proto-oncogenen. 4 De c-kit-tyrosinekinasereceptorroute blijkt van belang te zijn voor de tumorgroei en -progressie bij diverse vormen van kanker. 5 Mutaties in het c-kit-gen resulteren in een ligand-onafhankelijke fosforylering (activering) van het c-kit tyrosinekinase en aangenomen wordt dat dit een belangrijke pathogene rol speelt bij bijvoorbeeld gastrointestinale stromale tumoren. 6 Gastrointestinale mesenchymale tumoren zijn van oudsher moeilijk te differentiëren en te diagnosticeren. In 2001 werd imatinib mesilaat (Gleevec, Novartis, Bazel, Zwitserland) door de Amerikaanse Food and Drug Administration [Amerikaanse geneesmiddelregistratieautoriteiten] goedgekeurd als behandeling voor gastrointestinale stromale tumoren (GIST). Deze goedkeuring werd gebaseerd op een klinisch onderzoek waaraan volwassenen deelnamen met GIST waarbij het c-kit-eiwit tot expressie werd gebracht, zoals aangetoond met behulp van immunohistochemie (Novartis Clinical Trial Protocol). Deze patiënten werden behandeld met imatinib mesilaat. 7 De GIST-gevallen worden omschreven als drie morfologische categorieën: spindle cell, epithelioïde en gemengde types. Ongeacht de morfologie brengen de meeste GISTen c-kit tot expressie in een aanzienlijk deel van de tumorcellen. 8-11 Opgemerkt dient te worden dat een klein percentage van de GISTen het c-kit-eiwit niet tot expressie brengen. Relatief weinig andere tumoren kunnen c-kit-eiwit-positief zijn. Hiertoe behoren gemetastaseerd melanoom, angiosarcoom, Ewing-sarcoom, mastocytoom, seminoom en kleincellig longcarcinoom. GISTen zijn normaal gesproken positief voor hoogmoleculair caldesmon, vaak positief voor CD34 (60 80%) en meestal negatief voor desmine en S100-eiwit. 12 Specificiteit Het polyklonale konijnen-c-kit-antilichaam werd verkregen door subcutane injectie van een 14 aminozuur (aa) peptide (posities 963-976 van de intracellulaire C -terminus van het c-kit-eiwit) gekoppeld aan thyroglobuline. Het antiserum werd specifiek gezuiverd door middel van antigeengebonden, geactiveerde thiol-avidgel F-affineitschromatografie. (111802-003) 305756NL_001 p. 1/15

Een klein aantal van de wekedelensarcomen bleken eveneens c-kit/cd117-positief te zijn. 6 Een aantal van deze monsters (bijvoorbeeld leimyosarcoom) werd onderzocht op c-kit-expressie. Het onderzoek omvatte een vergelijking tussen de c-kit pharmdx -assay en het Novartis Clinical Trial Protocol (NCTP) zoals dit werd toegepast voor de selectie van patiënten voor behandeling met Gleevec in de klinische onderzoeken die door Novartis werden uitgevoerd. Twee van de in totaal achtentwintig geteste monsters vertoonden een positieve kleuring. Het resultaat was bij beide protocols gelijk. Alle positieve immunokleuring verdween na absorptie van het primaire antilichaam met een synthetisch peptide (16 aminozuren C-terminale einde van het c-kit-eiwit). Dientengevolge reageerde het primaire antilichaam dat werd gebruikt in de c-kit pharmdx -assay specifiek met het c-kit-eiwit in de twee positief kleurende wekedelensarcomen. Eigen onderzoek met behulp van c-kit pharmdx toonde een expressie van het c-kit-eiwit in diverse normale cellen. Dit betrof cellen zoals de ductale en myo-epitheelcellen van de borst, uitsteeksels Purkinje-cellen, lamina propria-cellen van het colon, tubulair nierepitheel, melanocyten en myo-epitheelcellen van de huid, interstitiële cellen van Cajal van de dunne darm en mestcellen. De cytoplasmatische reactiviteit in granulocyten werd veroorzaakt door endogene peroxidaseactiviteit en werd zichtbaar gemaakt met het negatievecontrolereagens. Reagentia Code K1907 is bestemd voor geautomatiseerde kleuring met behulp van de Dako Autostainer. De vermelde materialen zijn voldoende voor 35 tests (35 patiëntenglaasjes en 10 controleglaasjes geïncubeerd met primair antilichaam tegen het c-kit-eiwit en 35 glaasjes geïncubeerd met het bijbehorende negatievecontrolereagens. Het aantal tests is gebaseerd op het gebruik van het c-kit pharmdx Autostainerprotocol met gebruiksklare reagentia. De kit levert de materialen voor maximaal 10 afzonderlijke kleuringsruns. Bijgeleverde materialen Hoeveelheid 1x9 ml Beschrijving c-kit pharmdx polyklonaal konijnen-igg 1x9 ml Polyklonaal konijnen-anti-humaan c-kit-igg in een Tris-HCl-buffer, bevat stabiliserend eiwit en 0,015 mol/l natriumazide. Konijnen-IgG negatievecontrolereagens 2x5 objectglaasjes Polyklonaal konijnen-igg met een concentratie gelijk aan of groter dan de positieve anti-ckitconcentratie in een Tris-HCl-buffer, bevat stabiliserend eiwit en 0,015 mol/l natriumazide. c-kit pharmdx -controleglaasjes Elk objectglaasje bevat coupes van twee formalinegefixeerde, in paraffine ingebedde muizen (+) en humane (-) cellijnen in pelletvorm die een gemiddeld niveau van expressie van het c-kit-eiwit en geen expressie van c-kit vertonen. De IHC-kleuringsscores van de celpellets zijn 2+ en 0. Principe van de procedure De c-kit pharmdx IHC-kit bevat polyklonale antilichamen en controleglaasjes voor het uitvoeren van een IHC-kleuringsprocedure voor formalinegefixeerde en in paraffine ingebedde monsters. Na incubatie met het primaire polyklonale antilichaam tegen het humane c-kit-eiwit wordt voor deze kit aanbevolen een gebruiksklaar visualisatiereagens gebaseerd op dextraantechnologie te gebruiken. Dit reagens bestaat uit zowel secundaire geiten-anti-konijn-antilichaammoleculen als horseradish-peroxidasemoleculen die zijn gekoppeld aan een normaal dextraanpolymeer-backbone, wat de noodzaak wegneemt van toepassing van achtereenvolgens een koppelingsantilichaam en peroxidaseconjugaat. De enzymatische omzetting van het daarna toegevoegde chromogeen geeft een zichtbaar reactieproduct op de plaats van het antigeen. Het monster kan dan worden tegengekleurd en worden afgedekt. De resultaten worden beoordeeld met behulp van een lichtmicroscoop. Er worden controleglaasjes met twee formalinegefixeerde, in paraffine ingebedde humane cellijnen met een kleuringsintensiteitsscore van 2+ en 0 bijgeleverd voor een kwaliteitscontrole van de werking van de kitreagentia. (111802-003) 305756NL_001 p. 2/15

Benodigde materialen, maar niet bijgeleverd Het c-kit pharmdx IHC-protocol werd gevalideerd aan de hand van de volgende Dako-kleuringsreagentia: Wash Buffer (code S3006) Dual Endogenous Enzyme Block (code S2003) Target Retrieval Solution (code S1699 of S1700) EnVision+ HRP, Anti-Rabbit (code K4002 of K4003) DAB+ (code K3467 of K3468) Opmerking: Voor het verkrijgen van juiste kleuringsresultaten mogen alleen deze kleuringsreagentia met c-kit pharmdx worden gebruikt. Afwijkingen van dit aanbevolen protocol zijn niet gevalideerd. Andere materialen nodig voor het uitvoeren van c-kit pharmdx zijn onder andere: Hematoxyline, op alcohol- of waterbasis zoals Hematoxylin van Dako (code S3301 of S3302) Dekglaasjes Waterbad, gekalibreerd en met een temperatuurhandhavingscapaciteit van 95 99 C of een hogedrukpan, gekalibreerd en met een verhittingscapaciteit van 125 C Gedestilleerd of gedemineraliseerd water (water van reagenskwaliteit) Droogstoof met een temperatuurhandhavingscapaciteit van 56 60 C Ethanol, absoluut en 95% Lichtmicroscoop (4x 40x objectiefvergroting) Afdekmedium, zoals Faramount van Dako (code S3025) of Glycergel van Dako (code C0563) of Ultramount van Dako (code S1964) Positieve en negatieve weefsels, te gebruiken als procedurecontroles (zie paragraaf Kwaliteitscontrole) Objectglaasjes, Fisher s SuperFrost Plus, poly-l-lysine-gecoate glaasjes, geladen glaasjes of Silanized Slides van Dako (code S3003) (zie paragraaf Bewerking van het monster) Kleurbakjes of -baden Timer (geschikt voor intervallen van 2 30 minuten) Xyleen, tolueen of xyleenvervangers 1 ml pipet Dako Autostainer Universal Staining System (code S3400) of Autostainer Plus (code S3800) met Dako Autostainer-software versie 3.0.0 of hoger. (Raadpleeg de gebruikershandleiding voor de Dako Autostainer voor de noodzakelijke onderdelen) Opmerking: Alle bijgeleverde of afzonderlijk verkrijgbare reagentia zoals Wash Buffer van Dako (code S3006) zijn speciaal voor gebruik met deze test samengesteld. Om de test conform de specificaties te laten verlopen kunnen deze onderdelen niet worden vervangen. Voorzorgsmaatregelen 1. Voor professionele gebruikers. Voor in-vitrodiagnostiek. 2. Dit product bevat natriumazide (NaN 3), een chemische stof die in zuivere vorm zeer giftig is. Bij productconcentraties die echter niet als schadelijk worden geclassificeerd, kan opgehoopt NaN 3 reageren met loden en koperen afvoerbuizen, waardoor zeer explosieve metaalaziden ontstaan. Bij afvoeren ruim naspoelen met water om ophoping van aziden in de afvoerbuizen te voorkomen. 3. Zoals voor elk product van biologische herkomst geldt, dienen de juiste bewerkingsprocedures te worden nageleefd voor zowel de monsters als de reagentia. 4. Afwijking van de beschreven incubatietijden, temperaturen en methoden kan onjuiste uitslagen opleveren. 5. Vervang de primaire antilichamen of negatievecontrolereagentia niet door primaire antilichamen en negatievecontrolereagentia van andere partijen (de partijnummers zijn vermeld op de flaconlabels) of door reagentia van andere producenten. Dit kan tot onjuiste resultaten leiden. 6. De kitreagentia zijn optimaal verdund voor gebruik met de aanbevolen reagentia. Verdere verdunning wordt niet aanbevolen en kan verlies van antigeenkleuring tot gevolg hebben. Dergelijke veranderingen moeten door de gebruiker worden geverifieerd. 7. Draag de juiste beschermende uitrusting om contact met ogen en huid te vermijden. 8. Ongebruikte oplossing dient te worden verwijderd in overeenstemming met lokale, provinciale en landelijke richtlijnen. 9. Veiligheidsinformatieblad voor professionele gebruikers op aanvraag beschikbaar. Risk and safety zinnen DAB-chromogeen R 40 Carcinogene effecten zijn niet uitgesloten. R43 Kan overgevoeligheid veroorzaken bij contact met de huid. R68 Onherstelbare effecten zijn niet uitgesloten. S35 Deze stof en de verpakking op veilige wijze afvoeren. S 36/37 Draag geschikte beschermende kleding en handschoenen. Normaal gesproken mogen personen jonger dan 18 jaar niet met dit product werken. Gebruikers moeten zorgvuldig worden geïnstrueerd over de juiste werkprocedure, de gevaarlijke eigenschappen van het product en de noodzakelijke veiligheidsmaatregelen. (*DAB-chromogeen is benodigd, maar wordt niet met deze kit meegeleverd). (111802-003) 305756NL_001 p. 3/15

Opslag Bewaar het c-kit pharmdx -kitsysteem bij 2 8 C. De controleglaasjes moeten eveneens bij 2 8 C word en bewaard. Gebruik de kit niet na de vervaldatum die op de buitenzijde van de doos is vermeld. Er zijn geen duidelijke tekenen die duiden op instabiliteit van dit product; daarom moeten bij patiëntenmonsters tegelijk positieve en negatieve controles worden uitgevoerd. Als de reagentia worden bewaard onder andere omstandigheden dan gespecificeerd in de bijsluiter, moeten deze door de gebruiker worden gevalideerd. 13 Kwaliteitsverklaring Bewerking van het monster De reagentia van het c-kit pharmdx-kitsysteem zijn op kwaliteit gecontroleerd door middel van immunohistochemie met de volgende uitgangspunten: antigeenversterking in een Pascal pressure cooker (code S2800) geprogrammeerd op 30 seconden bij 125 C, af koelen tot 90 C, gevolgd door het EnVision+ Rabbit, HRP system. De biopsiemonsters moeten met zorg worden behandeld om het weefsel intact te houden voor IHC-kleuring. De standaardmethoden van weefselbewerking moeten op alle monsters worden toegepast. 14 In paraffine ingebedde coupes Formalinegefixeerde en in paraffine ingebedde weefsels zijn geschikt voor gebruik. Alternatieve fixatieven zijn niet gevalideerd en kunnen tot onjuiste resultaten leiden. De biopsiemonsters moeten in blokjes van 3 of 4 mm worden gesneden en gefixeerd gedurende de bij het fixatief behorende fixatietijd. Vervolgens worden de weefsels gedehydeerd en gecleared in een alcohol- en xyleenreeks, gevolgd door infiltratie met gesmolten paraffine. De paraffinetemperatuur mag niet hoger zijn dan 60 C. Op juiste wijze gefixeerde en ingebe dde weefselblokjes met expressie van het c-kit-eiwit zijn voorafgaand aan het snijden en opbrengen op glaasjes 14, 15 onbeperkt houdbaar, mits koel bewaard (15 25 C). De weefselmonsters moeten in coupes van 3 5 µm worden gesneden. Na het snijden moeten de weefsels worden opgebracht op Fisher s SuperFrost Plus, Silanized Slides van Dako (code S3003), geladen objectglaasjes of op poly-l-lysine-gecoate glaasjes en in droogrekjes worden geplaatst. De rekjes met de glaasjes moeten op een absorberende doek worden afgetikt om onder de paraffine en op het glaasje achtergebleven water te verwijderen, waarna ze gedurende één uur bij kamertemperatuur moeten drogen. Daarna moeten de rekjes met de glaasjes gedurende één uur in een stoof bij 56 60 C worden geplaatst. Overtollig water dat eventueel op de glaasjes na uithalen uit de stoof is achtergebleven, moet worden verwijderd door de glaasjes op een doek af te tikken en ze gedurende nogmaals één uur in de stoof te laten drogen. Na uithalen uit de stoof moeten de objectglaasjes op kamertemperatuur worden bewaard tot ze afgekoeld zijn en de paraffine uitgehard is. Om de antigeniciteit te handhaven moeten de weefselcoupes die zijn aangebracht op de glaasjes en bij kamertemperatuur (20 25 C) worden bewaard, binnen 2 maanden na het snijden worden gekleurd. Raadpleeg het Dako-handboek: Immunochemical Staining Methods 16 of referentie 14 en 15 voor nadere bijzonderheden over de bewerking van de monsters. Het gebruik van ontkalkte weefsels is niet gevalideerd en wordt niet aanbevolen. De objectglaasjes nodig voor de c-kit-beoordeling en verificatie van tumoraanwezigheid moeten tegelijkertijd worden geprepareerd. Minimaal 5 objectglaasjes moeten worden geprepareerd: 1 glaasje voor tumoraanwezigheid, 2 glaasjes voor beoordeling van het c-kit-eiwit en 2 glaasjes voor back-up. Bereiding van het reagens De volgende reagentia moeten voorafgaand aan de kleuring worden bereid: Target Retrieval Solution (code S1699) Bereid voldoende Target Retrieval Solution door een verdunning te maken van Target Retrieval Solution 10x 1:10 met behulp van gedestilleerd of gedemineraliseerd water (water van reagenskwaliteit) voor de wasstappen. Gooi na gebruik de Target Retrieval Solution weg. Opmerking: bij gebruik van Target Retrieval Solution van Dako (code S1700) is geen verdunning nodig. Wash Buffer Solution (code S3006) Bereid voldoende hoeveelheid Wash Buffer (wasbuffer) door een verdunning te maken van Wash Buffer 10x 1:10 met behulp van gedestilleerd of gedemineraliseerd water (water van reagenskwaliteit) voor de wasstappen. Bewaar ongebruikte oplossing niet langer dan 7 dagen bij 2 8 ºC. Gooi de buffer weg als deze troebel is. Substrate-Chromogen Solution (DAB+) (code K3467 of K3468) Deze oplossing moet voor gebruik goed gemengd worden. Een neerslag in de oplossing beïnvloedt de kleuringskwaliteit niet. Voeg voor de bereiding van DAB+ Substrate-Chromogen Solution 1 druppel Liquid DAB+ Chromogen toe aan 1 ml DAB+ Substrate Buffer en meng. Gooi ongebruikte oplossing weg. Het bereide DAB+ is ongeveer 5 dagen stabiel mits bewaard bij 2 8 C. Belangrijke opmerking: de kleur van het Liquid DAB+ Chromogen in de fles kan variëren van helder tot licht lavendelbruin. Dit heeft geen invloed op de werkzaamheid van dit product. Maak de verdunning zoals hierboven beschreven. De toevoeging van overmaat Liquid DAB+ Chromogen aan de DAB+ Substrate Buffer leidt tot een verslechtering van het positieve signaal. (111802-003) 305756NL_001 p. 4/15

Afdekmedium Niet-waterige, permanente afdekking, zoals Dako Ultramount (code S1964), wordt aanbevolen. Waterige afdekmedia zoals Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, gebruiksklaar (code S3025) of Dako Glycergel Mounting Medium (code C0563) zijn eveneens geschikt. Maak de Glycergel vloeibaar door deze voorafgaand aan het gebruik te verwarmen tot circa 40(±5) C. Kleuringsprocedure op de Dako Autostainer Opmerkingen bij procedure Voorafgaand aan het gebruik moet de gebruiker deze aanwijzingen zorgvuldig doorlezen en zich ermee vertrouwd maken (zie paragraaf Voorzorgsmaatregelen). Zie de Dako Autostainer, Universal Staining System, User Guide. Alle reagentia moeten voor de immunokleuring op kamertemperatuur (20 25 C) worden gebracht. Ook moete n alle incubaties bij kamertemperatuur worden uitgevoerd. Laat de weefselcoupes tijdens de kleuringsprocedure niet uitdrogen. Uitgedroogde weefselcoupes kunnen een toegenomen niet-specifieke kleuring vertonen. Opmerking: De bij dit systeem geleverde reagentia en instructies zijn ontwikkeld voor een optimaal resultaat bij gebruik van de aanbevolen reagentia en materialen. Verdere verdunning van deze reagentia of afwijkingen van de incubatietijden of -temperaturen kunnen onjuiste of tegenstrijdige uitslagen opleveren. Deparaffineren en rehydreren De weefselglaasjes moeten voorafgaand aan de kleuring worden gedeparaffineerd om het inbedmedium te verwijderen, en gerehydreerd. Zorg ervoor dat alle paraffine wordt verwijderd. Resten inbedmedium resulteren in sterkere niet-specifieke kleuring. STAP 1. Plaats de glaasjes in een xyleenbad en incubeer gedurende 5 (±1) minuten. Verwissel de baden en herhaal eenmaal. STAP 2. Tik overtollige vloeistof af en plaats de glaasjes in absoluut ethanol gedurende 3 (±1) minuten. Verwissel de baden en herhaal eenmaal. STAP 3. Tik overtollige vloeistof af en plaats de glaasjes in 95% ethanol gedurende 3 (±1) minuten. Verwissel de baden en herhaal eenmaal. STAP 4. Tik overtollige vloeistof af en plaats de glaasjes in water van reagenskwaliteit gedurende 5 (±1) minuten. Vervolg de kleuringsprocedure met Target Retrieval. De xyleen- en alcoholoplossingen moeten na 40 objectglaasjes worden vervangen. Tolueen of xyleenvervangers, zoals Histoclear, kunnen in plaats van xyleen worden gebruikt. Antigeenversterking Aanbevolen procedure: Waterbad STAP 1. Vul de kleurbakjes, bijvoorbeeld Coplin-bakjes, met de verdunde Target Retrieval Solution (zie paragraaf Reagensbereiding). Plaats de kleurbakjes met Target Retrieval Solution in een waterbad. Verhit het waterbad en de Target Retrieval Solution tot 95 99 C (niet laten koken). Dek de bakjes af met een deksel om de temperatuur te stabiliseren en verdamping te voorkomen. STAP 2. Dompel de op kamertemperatuur gebrachte gedeparaffineerde coupes in de voorverwarmde Target Retrieval Solution in de kleurbakjes. Breng de temperatuur van het waterbad en de Target Retrieval Solution opnieuw op 95 99 C. Incubeer gedurende 20 (±1) minuten bij 95 99 C. STAP 3. Neem het hele bakje met glaasjes uit het waterbad. Laat de glaasjes afkoelen in de Target Retrieval Solution gedurende 20 (±1) minuten bij kamertemperatuur. STAP 4. Schenk de Target Retrieval Solution af en spoel de coupes in Wash Buffer (zie paragraaf Reagensbereiding). STAP 5. Dompel voor een optimale werking de coupes gedurende 5 (±1) minuten in Wash Buffer na antigeenversterking en voorafgaand aan de kleuring. Antigeenversterking Hogedrukpan (30 seconden bij 125 C) Het is van groot belang consistent te zijn met het antigeenversterkingsprotocol voor reproduceerbaarheid van de kleuringsresultaten. De hogedrukpan moet een temperatuurhandhavingscapaciteit hebben van 125 C en elke run met de hogedrukpan moet dezelfde totaalhoeveelheid vloeistof (Target Retrieval Solution en water in hogedrukpan) en hetzelfde aantal objectglaasjes bevatten. Het optimale protocol is als volgt: STAP 1. Voeg voor elke run een zelfde hoeveelheid water van reagenskwaliteit toe aan de hogedrukpan (500 ml of volg de instructies van de fabrikant). STAP 2. Vul elk van de twee hittebestendige plastic kleuringsbakjes, geschikt voor een rek met 24 objectglaasjes, met 250 ml geprepareerde Target Retrieval Solution (zie paragraaf Reagensbereiding). STAP 3. Dompel de op kamertemperatuur gebrachte gedeparaffineerde coupes in de voorverwarmde Target Retrieval Solution in de kleurbakjes. (111802-003) 305756NL_001 p. 5/15

Opmerking: Voor het verkrijgen van consistente resultaten moeten er voor elke run 48 glaasjes in de drukkamer worden geplaatst. Als er minder dan 48 monsterglaasjes bewerkt moeten worden, moet het rek opgevuld worden met blanco glaasjes. Als er 24 glaasjes of minder worden bewerkt, kan de tweede kleuringsbak worden gevuld met 250 ml water om Target Retrieval Solution te besparen. STAP 4. Plaats de twee kleurbakjes in de hogedrukpan en sluit het deksel stevig. STAP 5. Stel de hogedrukpan in op verwarmen tot 125 C; incubeer de glaasjes gedurende 30 seconden bi j 125 C. Laat de hogedrukpan voor het openen 30 minu ten afkoelen zonder te ontluchten. STAP 6. Controleer voor het openen of de hogedrukpan is ontlucht. Verwijder de kleuringsbakjes, schenk de Target Retrieval Solution af en spoel de coupes in Wash Buffer of water van reagenskwaliteit. STAP 7. Dompel de coupes gedurende 5 (±1) minuten in Wash Buffer na antigeenversterking en voorafgaand aan de kleuring. Opmerking: de Target Retrieval Solution is bedoeld voor eenmalig gebruik. Niet opnieuw gebruiken. Geautomatiseerd kleuringsprotocol Zie de Dako Autostainer, Universal Staining System, User Guide. STAP 1. Selecteer het protocol en programmeer de kleuringsrun (afbeelding 1). STAP 2. Gebruik de autoprogramma s om het programma in te stellen en start het c-kit pharmdx -programma. STAP 3. Plaats de reagensflacons in het reagentiarek van de Dako Autostainer volgens de door de computer bepaalde reagentia-opstelling. STAP 4. Plaats de objectglaasjes in de Dako Autostainer volgens de door de computer bepaalde glaasjesopstelling. STAP 5. Start de run. STAP 6. Neem de glaasjes uit de Dako Autostainer. Verzamel DAB+ Substrate-Chromogen Solution-afval in een container voor biologisch gevaarlijk materiaal voor een juiste wijze van afvoeren. Ga verder met Tegenkleuring en Afdekken. Opmerking: Spoel de glaasjes met water van reagenskwaliteit na de DAB+ Substrate-Chromogen-stap. (Dako Autostainer-hardware-versies 02 en 03 spoelen de glaasjes in water van reagenskwaliteit na de substraatchromogeenstap. De 01-hardware-versie van de Dako Autostainer spoelt de glaasjes in buffer. Daarom moeten de glaasjes die met 01-hardware van de Dako Autostainer zijn gekleurd, worden gespoeld met water van reagenskwaliteit nadat zij uit de Autostainer zijn gehaald). Afbeelding 1. Autostainer-programmeerraster Weergave van het programma zoals dat door de Dako Autostainer wordt uitgevoerd. Het programmeerraster (hierboven) is een pharmdx Master Protocolsjabloon dat protocolelementen bevat die nodig zijn voor een run met de c-kit pharmdx -kit. In dit voorbeeldraster zijn alleen c-kit-reagentia afgebeeld. Tegenkleuring (instructies voor hematoxyline) Het gekleurde eindproduct van de kleuringsreactie is niet in alcohol en water oplosbaar. Hematoxyline, op alcohol- of op waterbasis zoals Hematoxylin van Dako (code S3301 geautomatiseerd, of S3302, handmatig) kan worden gebruikt. Gebruik geen tegenkleuringen waarvan de kleuring terugloopt. STAP 1. Neem de objectglaasjes uit de Dako Autostainer en voer een tegenkleuring in hematoxyline uit zoals hieronder beschreven. STAP 2. Dompel de glaasjes in een hematoxylinebad. Incubeer gedurende 2 5 minuten, afhankelijk van de concentratie van de gebruikte hematoxyline. STAP 3. Spoel voorzichtig in een bad met water van reagenskwaliteit. Zorg ervoor dat alle achtergebleven hematoxyline verwijderd is. Optioneel: dompel de glaasjes 10 keer in een bad met 0,037 mol/l ammoniakwater (zie paragraaf Reagensbereiding). (111802-003) 305756NL_001 p. 6/15

Opmerking: het gebruik van Hematoxylin van DakoCytomatios (code S3301) wordt sterk aanbevolen. Na een incubatie van 3 minuten produceert deze tegenkleuring een zacht paarsblauw eindproduct dat een specifieke immunokleuring niet maskeert. Een sterke tegenkleuring kan een zwakke expressie van c-kit-eiwit maskeren. STAP 4. Spoel voorzichtig in een bad met water van reagenskwaliteit gedurende 2 5 minuten. Afdekking Niet-waterige, permanente afdekking, zoals Dako Ultramount (code S1964), wordt aanbevolen. Waterige afdekmedia zoals Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, gebruiksklaar (code S3025) of Dako Glycergel Mounting Medium (code C0563) zijn eveneens geschikt. Maak de Glycergel vloeibaar door deze voorafgaand aan het gebruik te verwarmen tot circa 40(±5) C. Opmerking: Aanbevolen wordt de objectglaasjes binnen zes weken na kleuring te interpreteren. Er kan echter wat vervaging optreden, afhankelijk van verschillende factoren, zoals onder andere tegenkleuring, afdekmaterialen, gehanteerde methoden en opslagomstandigheden. Om vervaging te minimaliseren moeten de glaasjes in het donker bij kamertemperatuur (20 25 C) worden bewaard. Kwaliteitscontrole Afwijkingen in de aanbevolen procedures voor weefselfixatie, bewerking en inbedding in het laboratorium van de gebruiker kunnen aanzienlijke variaties in de resultaten opleveren, waardoor het noodzakelijk is naast de door de Dako geleverde controleglaasjes regelmatig interne controles uit te voeren. In de VS dienen de richtlijnen kwaliteitscontrole van het College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry geraadpleegd te worden. Zie ook de CLIS Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline 17 en referentie 18-21 voor aanvullende informatie. c-kit pharmdx -controleglaasjes (bijgeleverd) Elk van de bijgeleverde controleglaasjes bevat twee formalinegefixeerde, in paraffine ingebedde muizen (+) en humane (-) cellijnen in pelletvorm met kleuringsintensiteitsscores van 2+ en 0. Eén van deze glaasjes moet in elke kleuringsprocedure worden gekleurd. De beoordeling van de cellijnen op de door Dako geleverde controleglaasjes geeft een indicatie van de validiteit van de kleuringsrun. De glaasjes mogen niet worden gebruikt als hulpmiddel bij de beoordeling van de patiëntenresultaten. Positief controleweefsel De controleweefsels moeten verse monsters zijn, afkomstig van autopsie, biopsie of chirurgie die zo spoedig mogelijk na afname op dezelfde wijze als de patiëntenmonsters worden gefixeerd, bewerkt en ingebed. De positieve weefselcontroles geven aan of het weefsel op de juiste wijze is bewerkt en de kleuringen correct zijn uitgevoerd. Bij elke kleuringsrun moet één positieve weefselcontrole voor elke set testomstandigheden worden meegenomen. De weefsels die als positieve weefselcontrole dienen, moeten een zwak positieve kleuring vertonen zodat geringe veranderingen in de sensitiviteit van het primaire antilichaam aangetoond kunnen worden. De bij dit systeem bijgeleverde controleglaasjes of monsters die op andere wijze zijn geprepareerd dan het patiëntenmonster/de patiëntmonsters valideren alleen de juiste werking van het reagens en niet de weefselbewerking. Bekende positieve weefselcontroles mogen alleen worden gebruikt voor het controleren van de juiste werking van bewerkte weefsels en testreagentia, en NIET als hulpmiddel voor het vaststellen van een specifieke diagnose van patiëntenmateriaal. Als de positieve weefselcontroles geen positieve kleuring laten zien, moeten de resultaten met de testmonsters als ongeldig worden beschouwd. Normale celtypen die kunnen worden gebruikt als zwak c-kit-positief zijn onder andere basale epidermale melanocyten en glandulaire myo-epitheelcellen van de huid, alsmede epitheel- en myo-epitheelcellen van de borst. Als sterke interne controles kunnen neuronale (interstitiële cellen van Cajal) en mestcellen in de darm dienen. Negatief controleweefsel Gebruik een negatief controleweefsel (waarvan bekend is dat het negatief is voor het c-kit-eiwit) dat op dezelfde wijze is gefixeerd, bewerkt en ingebed als het patiëntenmonster/de patiëntmonsters bij elke kleuringsrun om de specificiteit van het primaire antilichaam te controleren en om een indicatie te geven van de specifieke achtergrondkleuring. Het grote aantal verschillende celtypen aanwezig in de meeste weefselcoupes kunnen dienen als negatieve controle (dit moet door de gebruiker worden geverifieerd). Als er in het negatieve controleweefsel specifieke kleuring optreedt, moeten de resultaten met de patiëntenmonsters als ongeldig worden beschouwd. Weefselelementen die als negatieve controle kunnen dienen, zijn onder andere myocyten in hartweefsel. Acinuscellen van de pancreas zijn eveneens c-kit-negatief, terwijl het epitheel van de afvoergangen van de pancreas positief kleurt. Niet-specifiek Negative Control Reagent Gebruik het bijgeleverde Negative Control Reagent in plaats van het primaire antilichaam met een coupe van elk patiëntenmonster voor beoordeling van niet-specifieke kleuring en voor betere interpretatie van de specifieke kleuring op de antigeenplaats. De incubatietijd voor het Negative Control Reagent moet gelijk zijn aan die voor het primaire antilichaam. (111802-003) 305756NL_001 p. 7/15

Als bij seriecoupes gebruik wordt gemaakt van panels antilichamen, kunnen de negatief kleurende gebieden op één glaasje dienst doen als negatieve controle of als controle voor niet-specifieke achtergrondbinding voor andere antilichamen. Assayverificatie Voorafgaand aan het eerste gebruik van een antilichaam of kleuringssysteem in een diagnostische procedure moet de gebruiker de specificiteit van het antilichaam controleren door deze te testen met een serie weefsels uit het eigen laboratorium met bekende IHC-werkingseigenschappen voor zowel positieve als negatieve weefsels. Raadpleeg de procedures voor kwaliteitscontrole zoals eerder omschreven in dit deel van de bijsluiter en de Quality control requirementsvan het CAP Certification Program for Immunohistochemistry en/of CLIS Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline. 17 Deze kwaliteitscontroleprocedures moeten voor elke nieuwe partij antilichamen worden herhaald of in geval van een wijziging in de assayparameters. Gastrointestinale stromale tumoren (GIST) met bekende kleuringsintensiteiten van het c-kit-eiwit en negatieve weefsels zijn geschikt voor assayverificatie. Tabel 1: Het doel van dagelijkse kwaliteitscontrole Weefsel: Gefixeerd en bewerkt als het patiëntenmonster Door Dako meegeleverd controleglaasje. Positieve controle: weefsel of cellen met het te bepalen target-antigeen (kan zich in het weefsel van de patiënt bevinden). De ideale controle is zwak positief kleurend weefsel dat het gevoeligst is voor antilichaamof antigeenafbraak. Negatieve controle: weefsels of cellen waarvan verwacht wordt dat deze negatief zijn (kunnen zich bevinden in het weefsel van de patiënt of positief controleweefsel) Specifiek antilichaam & detectiesysteem Controleert alleen de kleuringsprocedure. (De beoordeling van de cellijnen op de door Dako geleverde controleglaasjes geeft een indicatie van de validiteit van de kleuringsrun.) Controleert alle stappen van de analyse. Valideert reagentia en procedures gebruikt voor de kleuring van c-kit-eiwit. Aantonen van onbedoelde kruisreactiviteit van antilichaam met cellen/cellulaire componenten. Achtergrondinformatie: Niet-specifiek antilichaam (Rabbit Negative Control Reagent meegeleverd Aantonen van niet-specifieke achtergrondkleuring. Aantonen van niet-specifieke achtergrondkleuring. Weefsel van de patiënt. Aantonen van specifieke kleuring. Aantonen van niet-specifieke achtergrondkleuring. Beoordeling van de kleuringsprocedure De beoordeling van de objectglaasjes moet door een patholoog met behulp van een lichtmicroscoop worden uitgevoerd. Alle beoordelingen moeten worden uitgevoerd in het tumorgebied van het monster. Een objectief met 10x of 20x vergroting volstaat voor de beoordeling van immunocytochemische kleuring en de interpretatie. Voor interpretatie van de kleuringsresultaten moeten intacte cellen worden gebruikt, aangezien necrotische of gedegenereerde cellen vaak niet-specifiek kleuren. 17 Elke c-kit pharmdx -kit bevat positieve en negatieve cellijnen voor validatie van de werking van de assays. Juiste kleuring van de controleglaasjes geeft aan dat de c-kit pharmdx -assay correct functioneert en het protocol correct is uitgevoerd. Ontbreken van kleuring van de HT-29-controlecellijn (0) en matige bruine cytoplasmatische of paranucleaire kleuring in de P815-controlecellijn (2+) geven aan dat de kleuringsrun juist is uitgevoerd. Een afwijking van de optimale kleuringsintensiteit van de positieve controlecellijn (te zwak of te sterk), kan een fout-negatief of fout-positief resultaat geven, waarna de test moet worden herhaald. Een beoordeling van een positieve weefselcontrole moet worden uitgevoerd. Een zwakke kleuring van myoepitheelcellen van de huid duidt erop dat de reagentia goed functioneren. Als de positieve weefselcontrole niet positief kleurt, moeten de resultaten met de testmonsters als ongeldig worden beschouwd. De negatieve weefselcontrole moet na de positieve weefselcontrole worden onderzocht om de specifieke labeling van het antigeen door het primaire antilichaam te verifiëren. Uitblijven van specifieke kleuring in de negatieve weefselcontrole bevestigt het ontbreken van kruisreactiviteit van het antilichaam met cellen/cellulaire componenten. Wanneer in de negatieve controle specifieke kleuring optreedt, moeten de resultaten met het monster van de patiënt als ongeldig worden beschouwd. Indien zich niet-specifieke kleuring voordoet, is deze meestal diffuus. In sporadische gevallen kan ook kleuring van bindweefsel worden waargenomen in coupes van weefsels die overmatig met formaline zijn gefixeerd. Voor beoordeling van kleuringsresultaten moeten intacte cellen worden gebruikt. Necrotische of gedegenereerde cellen kleuren dikwijls niet-specifiek. 18 (111802-003) 305756NL_001 p. 8/15

Onderzoek de patiëntmonsters als laatste. Positieve kleuringsintensiteit moet binnen de context van een eventuele niet-specifieke achtergrondkleuring van de negatieve reagentia controle worden beoordeeld. De beoordeling van de expressie van c-kit-eiwit moet binnen de algemene morfologische en klinische context van de tumor plaatsvinden. Er zijn drie morfologische categorieën van GIST te onderscheiden: spindle cell (70%), epithelioïd (20%) of gemengde soorten. 22 Ongeacht de morfologie brengt het merendeel van GISTen c-kit-eiwit tot expressie in een aanzienlijk deel van de tumorcellen. Homogene immunokleuring met c-kit pharmdx wordt voornamelijk gezien in het cytoplasma, met of zonder een Golgi/perinucleair (puntachtig) patroon, en in de celmembranen waarbij de membranen al dan niet rondom aansluitend gekleurd kunnen zijn. Enkele gevallen vertonen een heterogeen (een mengsel van sterk of zwak cytoplasmatisch en/of membraneus) kleuringspatroon. Kleuring is tevens waargenomen in de extracellulaire ruimten. De testresultaten van c-kit pharmdx moeten worden gemeld als positief of negatief, waarbij de cytoplasmatische kleuring en membraankleuring als de te beoordelen structuur dienen (tabel 2). Positiviteit voor de expressie van c-kit-eiwit wordt gedefinieerd als een specifieke cytoplasmatische en/of membraneuze kleuring in de tumorcellen. Focale positiviteit of kleuring in minder dan 10% van de tumorcellen moet met terughoudendheid worden geïnterpreteerd. 23 Zoals bij elk immunohistochemisch onderzoek, wil een negatief resultaat zeggen dat het antigeen niet is aangetoond en niet dat het antigeen niet in de onderzochte cellen of weefsels voorkwam. Opgemerkt dient te worden dat een klein percentage GISTen geen c-kit-eiwit tot expressie brengt. Het ontbreken van c-kit-eiwit-kleuring sluit de diagnose GIST niet uit. Tabel 2: c-kit pharmdx -kleuringsresultaten Melden aan de behandelend arts c-kit-eiwit negatief c-kit-eiwit positief Definitie Uitblijven van kleuring in de tumorcellen. Positieve kleuring wordt gedefinieerd als een IHC-kleuring van het cytoplasma en/of membraan van de tumorcel boven achtergrondniveau. Kleuringsintensiteit: 1+, 2+ of 3+ Maak, indien nodig, gebruik van een panel antilichamen om fout-negatieve reacties te herkennen. Als de kleuring focaal positief is, moet overwogen worden extra tests uit te voeren om tot een GIST-diagnose te komen. Genetische tests en de in tabel 3 genoemde kleuringspatronen dragen bij aan de differentiatie tussen GIST en andere mesenchymale tumoren. Zie voor specifieke informatie over immunoreactiviteit de paragrafen Samenvatting en uitleg en Beperkingen en prestatiekenmerken. Tabel 3. Immunohistochemisch schema voor de differentiële diagnose van spindle cell-tumoren van het maagdarmkanaal. 8 c-kit CD34 SMA Gladde spier-actine S-100 Desmine GIST 95% 60 70% 30 40% 5% 2% Gladde spiertumor - 10 15% + Zeldzaam + Schwannoom - Gebruikelijk - + - Fibromatose Discutabel* Zeldzaam + - Zeldzaam * Het merendeel van de auteurs meldt dat fibromatosa negatief zijn voor c-kit. Afhankelijk van de incubatietijd en de sterkte van de gebruikte hematoxyline, zal tegenkleuring leiden tot een licht- tot donkerblauwe kleuring van celkernen. Overmatige tegenkleuring kan de interpretatie van de resultaten bemoeilijken. Beperkingen Algemene beperkingen IHC is een diagnostische procedure die uit meerdere stappen bestaat. Voor uitvoering ervan is een gespecialiseerde opleiding vereist wat betreft de keuze van de geschikte reagentia en weefselselectie, -fixatie en -bewerking, preparatie van IHC-objectglaasjes en beoordeling van de kleuringsresultaten. De kwaliteit van weefselkleuring is afhankelijk van de wijze van behandeling en bewerking van het weefsel voorafgaand aan de kleuring. Onjuiste fixatie, bevriezing, ontdooiing, wassen, drogen, verhitting, snijden of verontreiniging met andere weefsels of vloeistoffen kan oorzaak zijn van artefacten, insluiting van antilichamen of fout-negatieve resultaten. Variaties in fixatie- en inbeddingsmethoden of inherente onregelmatigheden binnen het weefsel kunnen leiden tot inconsistente resultaten. De klinische interpretatie van elke positieve kleuring, of het uitblijven daarvan, moet worden beoordeeld binnen de context van de klinische presentatie, de morfologie en andere histopathologische criteria. De klinische beoordeling van een kleuring of het uitblijven daarvan moet worden aangevuld door morfologisch onderzoek met de juiste controles, alsmede door andere diagnostische onderzoeken. De beoordeling van het gekleurde preparaat is de verantwoordelijkheid van een bevoegd patholoog die bekend is met de toegepaste antilichamen, reagentia en methoden. De kleuring moet worden uitgevoerd in een gecertificeerd erkend laboratorium onder supervisie van een patholoog die verantwoordelijk is voor de beoordeling van de gekleurde objectglaasjes en zorg draagt voor de juiste positieve en negatieve controles. (111802-003) 305756NL_001 p. 9/15

Dit product is niet bestemd voor toepassing bij flowcytometrie. De werkingseigenschappen bij flowcytometrie zijn niet vastgesteld. Weefsels die afkomstig zijn van personen besmet met het hepatitis-b-virus en die het hepatitis-boppervlakteantigeen (HBsAg) bevatten, kunnen niet-specifieke kleuring met horseradish peroxidase vertonen. 24 Reagentia kunnen bij weefsels die niet eerder zijn onderzocht, onverwachte reacties laten zien. De mogelijkheid van onverwachte reacties kan, ook bij reeds onderzochte weefselgroepen, niet geheel worden uitgesloten vanwege de biologische variabiliteit van antigeenexpressie in neoplasmata of andere pathologische weefsels. 17 Meld gedocumenteerde onverwachte reacties aan bij de technische ondersteuning van Dako. Productspecifieke beperkingen Een klein percentage van GISTen brengen het c-kit-eiwit niet tot expressie. Het ontbreken van c-kit-kleuring sluit de diagnose GIST daarom niet uit. Fout-positieve resultaten kunnen voorkomen vanwege niet-immunologische binding van eiwitten of substraatreactieproducten. Ook kunnen ze worden veroorzaakt door pseudoperoxidaseactiviteit (erytrocyten) en endogene peroxidaseactiviteit (cytochroom C). 19 Voor optimale en reproduceerbare resultaten heeft het c-kit-eiwit bij weefsels die standaard gefixeerd (neutraal gebufferde formaline) en in paraffine ingebed zijn, antigeenversterking nodig. Dako adviseert het gebruik van c-kit pharmdx op een Dako Autostainer of Autostainer Plus. Het gebruik van c- Kit pharmdx op alternatieve geautomatiseerde platforms is niet gevalideerd en kan tot onjuiste resultaten leiden. De gekleurde controlecellijnen mogen uitsluitend worden gebruikt voor validatie van de kleuringsrun en mogen niet worden gebruikt om de kleuringsreactie in weefselcoupes te beoordelen. De monsters die worden geconserveerd door standaard bewerking met neutraal gebufferde formaline zijn geschikt voor testen met c-kit pharmdx. Weefsels die zijn gefixeerd met andere fixatieven, zijn niet gevalideerd. Prestatiekenmerken Specificiteit Het c-kit-antilichaamreagens is getest op reactiviteit tegen cellijnen die het c-kit-eiwit tot expressie brengen. Met Western blotting van een lysaat van de kleincellige longcarcinoom-cellijn SY dat c-kit-mrna overmatig tot expressie brengt, labelt het antilichaam een band van 145 kd welke overeenkomt met het c-kit-eiwit. De gelabelde band is behoorlijk breed; van 120 tot 155 kd. Er werd nog een band van 100 kd gelabeld. 25 In andere onderzoeken waarbij een ander antilichaam tegen c-kit werd gebruikt, werd eveneens een 100 kd eiwit gelabeld. Deze labeling verdween na incubatie van het antilichaam met het synthetische c-kit-peptide-antigeen dat wordt gebruikt voor immunisatie. 26 Bij aanvullende onderzoeken werd het c-kit-antilichaamreagens getest met behulp van Western blotting op kruisreactiviteit met eiwitten met eenzelfde structurele homologie, zoals Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFRa), macrofaag colony stimulating factor receptor (c-fms) en FMS-achtige tyrosinekinase 3 (FLT-3). Bij deze homologe eiwitten werd geen kruisreactiviteit waargenomen. Daarnaast reageerde het antilichaamreagens van Dako bij Western blotting niet met een lysaat van de adenocarcinoomcellijn HS, welke het c-kit-eiwit niet tot expressie brengt. 25 Vergelijkende onderzoeken Er werd een immunokleuring uitgevoerd met behulp van de c-kit pharmdx -assay op formalinegefixeerde, in paraffine ingebedde sarcomen en een reeks met meerdere weefsels [multi-tissue arrays] (MTAs) die een aantal sarcomen bevatten met positieve en negatieve c-kit-eiwitexpressie. De weefsels werden getest met behulp van de c-kit pharmdx -assay na toepassing van de twee aanbevolen methoden van heat induced epitope retrieval (HIER). In het kort: voor verhitting werden een waterbad (95 99 C) gedurende 20 minuten en een hogedr ukpan (121 C) gedurende 5 minuten gebruikt, beide gevolg d door 20 minuten afkoelen. De volgende stappen van het kleuringsproces waren identiek. Deze assays werden vergeleken met een tegelijkertijd uitgevoerde simulatierun van het Novartis Clinical Trial Protocol (NCTP) dat eerder gebruikt was voor het selecteren van patiënten voor het klinisch onderzoek waarvoor FDA-goedkeuring verkregen was voor het gebruik van Gleevec/Glivec bij gediagnosticeerde GIST-patiënten. De NCTP gebruikte een 2X hogere concentratie van het primaire polyklonale antilichaam van Dako gericht tegen c-kit (A4502) (hetzelfde reagens als in c-kit pharmdx) en zonder HIER. De resultaten na vergelijking van het NCTP en de c-kit pharmdx -assay waarbij de hogedrukpan voor verhitting werd gebruikt, zijn vermeld in tabel 4 en gelijksoortige resultaten (algehele overeenkomst = 98,7%) werden waargenomen na gebruik van een waterbad voor verhitting. Het percentage positieve en negatieve overeenkomsten was gelijk voor beide vergelijkingen. (111802-003) 305756NL_001 p. 10/15

Tabel 4. 2x2 tabel van het c-kit pharmdx -protocol met testresultaten met hogedrukpan vergeleken met NCTP-testresultaten c-kit pharmdx hogedrukpan TR testresultaat Gelijktijdige NCTPassaytestresultaten Positief Negatief n (%) n (%) (111802-003) 305756NL_001 p. 11/15 Totaal Positief 188 (60,8) 3 (0,9) 191 Negatief 1 (0,3) 117 (37,9) 118 Totaal 189 120 309 Percentage positieve overeenkomst = 188/(188 +1); = 0,995 x 100 = 99,5% (95% exact BI: 97,1% - 100%) Percentage negatieve overeenkomst = 117/(117+3); = 0,975 x 100 = 97,5% (95% exact BI: 92,9% 99,5%) Totale overeenkomst = (188+117)/309 = 0,987 x 100 = 98,7% (95% exact BI: 96,7% 99,7%) Een subset van deze monsters (35 gevallen) betrof weefsels afkomstig van patiënten die deelnamen aan het klinisch onderzoek van Novartis met Gleevec. Van deze patiënten werden er 21 met Gleevec behandeld (58,3%). Na het testen van dezelfde monsters met gesimuleerd NCTP en c-kit pharmdx bleken er 20 monsters positief voor alle drie procedures en 1 monster negatief. Van de 147 patiënten die werd behandeld met Gleevec in de Novartis Gleevec Clinical Trial, bleek 54% een gedeeltelijke respons te vertonen en bij 28% was de aandoening gestabiliseerd. 7 Voor een subset van 259 monsters, opgenomen in tabel 4, werden de c-kit-testresultaten bepaald op het moment dat de monsters in de MTAs werden geplaatst. Vijfendertig van de gevallen werden opgenomen in de klinische onderzoeken met Gleevec (n=35) en de overige gevallen werden getest in de laboratoria die hadden deelgenomen aan de Gleevec-onderzoeken. De resultaten van 179 monsters (het totaal was minder dan 259 vanwege verloren gegane monsters of het ontbreken van tumor in de MTAs) worden vermeld in tabel 5 hieronder. Deze monsters lieten een totale overeenkomst zien met de originele c-kit-status van 94,9% (95% exact BI: 90,7% - 97,7%). Tabel 5: 2x2 tabel van hogedrukpan-testresultaten vergeleken met het originele testresultaat Originele weefsel-c-kit-status Hogedrukpantestresultaat n n n (%) Positief Negatief Totaal Positief 136 3 139 (78%) Negatief 6 34 40 (22%) Totaal 142 37 179 Percentage positieve overeenkomst = 136 / (136+6); = 0,957 x 100 = 95,7% (95% exact BI: 91,0% - 98,4%) Percentage negatieve overeenkomst = 34 / (34+3); = 0,919 x 100 = 91,9% (95% exact BI: 78,1% 98,3%) Totale overeenkomst = (136+34)/ (179); = 0,949 x 100 = 94,9% (95% exact BI: 90,7% 97,7%) Reproduceerbaarheid Inter-run reproduceerbaarheid (handmatige kleuring) De inter-run reproduceerbaarheid werd handmatig getest door twee technici in drie laboratoria gedurende 3 dagen met 5 verschillende monsters (4 positieve, 1 negatieve per laboratorium). In de 30 geteste weefsels verschilde de kleuringsintensiteit met niet meer dan +/- één kleuringsintensiteitsscore met de volgende uitzonderingen: op locaties 1 en 3 varieerde één objectglaasje (per locatie) met twee intensiteitsscores. Dit was het gevolg van weefselverstoring op locatie 1. Er werd een totale uitstekende reproduceerbaarheid (100%) gezien voor positieve versus negatieve resultaten. Inter-laboratorium reproduceerbaarheid (handmatige en geautomatiseerde kleuring met behulp van de Dako Autostainer) Er werd een immunohistochemische kleuring uitgevoerd van 30 gerandomiseerde en geblindeerde monsters met diverse expressieniveaus van c-kit (10 negatief en 20 positief) uitgevoerd in drie geografisch gescheiden laboratoria. Glaasjes met gesneden coupes werden naar elk testlaboratorium gezonden voor handmatige en geautomatiseerde kleuring en beoordeling door een patholoog. Op twee locaties bleek de postieve/negatieve bepaling van de expressie van c-kit-eiwit perfect (100%) binnen en tussen de laboratoria in zowel de handmatige als de geautomatiseerde testprocedures. Op locatie 2 bleken duplicaatglaasjes van twee weefsels, voorafgaand aan het onderzoek bepaald als negatief, in werkelijkheid positief. De follow-up analyse toonde aan dat een klein gebied (circa approximately 20% van de tumorcellen) positief kleurde. Deze sectie van de tumor werd niet gezien in de monsters die in de andere laboratoria werden getest. Intra-run reproduceerbaarheid (handmatige kleuring) In elk van de onderzoekslocaties arden 5 glaasjes van hetzelfde positieve monster opgenomen in de set met 30 handmatig gekleurde monsters. De kleuringsintensiteit en het percentage tumorkleuring arden beoordeeld. Het weefselresultaat bleef positief in elke onderzoekslocatie en de kleuringsintensiteit bleef binnen de +/- 1 intensiteitsscore.

Immuunreactiviteit Een samenvatting van de c-kit pharmdx -assay-immuunreactiviteit op het aanbevolen panel van normale weefsels wordt getoond in tabel 6. Alle weefsels waren formalinegefixeerd en in paraffine ingebed. De bijgeleverde instructies en de in deze bijsluiter aanbevolen reagentia werden gebruikt voor het uitvoeren van tests op 30 normale weefsels met behulp van de DAKO Autostainer. Tabel 6: Beoordeling van normale weefselkleuring met c-kit pharmdx * Weefseltype (aantal getest) Bijnier (3) Beenmerg (3) Borst (3) Hersenen, cerebellum (3) Hersenen, cerebrum (3) Cervix (3) Colon (3) Oesophagus (3) Hart (3) Nier (3) Lever (3) Long (3) Mesotheelcellen (3) Ovarium (3) Pancreas (3) Bijschildklier (3) Perifere zenuw (3) Hypofyse (3) Prostaat(3) Speekselklier (3) Skeletspier (3) Huid (3) Dunne darm (3) Milt (3) Maag (3) Testis (3) Thymus (3) Schildklier (3) Tonsil (3) Uterus (3) Kleuringspatroon Zeldzame mestcellen (2+): cytoplasmatisch Epitheelcellen (3+): membraan en cytoplasmatisch Myo-epitheelcellen: (1+): cytoplasmatisch Uitsteeksels Purkinjecellen (1+): cytoplasmatisch Mestcellen in submucosa (2+): en lamina propria (2+) cytoplasmatisch Mestcellen in submucosa (2+): cytoplasmatisch Tubulair epitheel (2+): cytoplasmatisch Mestcellen en macrofagen (2+): cytoplasmatisch Zeldzame epitheelcellen grote ductus (3+): Mestcellen (2+): cytoplasmatisch Mestcellen in weke delen(2+): cytoplasmatisch Mestcellen (2+): cytoplasmatisch Basale epidermale melanocyten (1+): cytoplasmatisch Glandulaire myo-epitheelcellen (1+): cytoplasmatisch Neuronale cellen(1+): cytoplasmatisch Mestcellen (2+): cytoplasmatisch Mestcellen (2+): cytoplasmatisch Mestcellen in lamina propria (2+): cytoplasmatisch *De meeste geteste weefsels vertoonden positieve kleuring van fibroblasten in stromaweefsel (1+, fibreus) en in mestcellen en macrofagen. Een enkele keer is endogene door peroxidase veroorzaakte kleuring van eosinofielen waargenomen. Eigen onderzoek met behulp van c-kit pharmdx toonde een expressie van het c-kit-eiwit in diverse normale cellen. Dit betrof cellen zoals de ductale en myo-epitheelcellen van de borst, uitsteeksels Purkinje-cellen, lamina propria-cellen van het colon, tubulair nierepitheel, melanocyten en myo-epitheelcellen van de huid, interstitiële cellen van Cajal van de dunne darm en mestcellen. De cytoplasmatische reactiviteit in granulocyten werd veroorzaakt door endogene peroxidaseactiviteit en werd zichtbaar gemaakt met het negatievecontrolereagens. (111802-003) 305756NL_001 p. 12/15

Problemen oplossen Tabel 7: Problemen oplossen Probleem Vermoedelijke oorzaak Voorgestelde actie 1. kleuring van de glaasjes. 2. Zwakke kleuring van de glaasjes. 3. Overmatige achtergrondkleuring van de glaasjes. 4. Het weefsel laat los van het glaasje. 5. Extreem sterke, specifieke kleuring. 6. Zwakke kleuring van de 2+ controlecellijn. 1a. Programmeerfout. De reagentia niet in de juiste volgorde toegepast. 1b. De flesjes met reagentia werden niet op de juiste positie in de reagentiarekjes geplaatst. 1c. Onvoldoende reagens in reagensflesje. 1d. Natriumazide in het bad met wasbuffer. 2a. Onvoldoende incubatietijd reagens. 2b. Onjuiste fixatiemethode gebruikt. 2c. Onvoldoende antigeenversterking met Target Retrieval Solution. 3a. Paraffine niet volledig verwijderd. 3b. Bij het opbrengen van de coupes op de objectglaasjes zetmeelbevattende additieven gebruikt. 3c. Glaasjes niet voldoende gespoeld. 3d. Coupes uitgedroogd tijdens de kleuringsprocedure. 3e. De glaasjes zijn uitgedroogd tijdens het plaatsen in de Autostainer. 3f. Niet-specifieke binding van reagens aan de weefselcoupe. 1a. Controleer het programmeerraster ter controle dat de kleuring correct werd geprogrammeerd. 1b. Verifieer de reagensopstelling voor controle van de juiste plaatsing van de reagensflesjes. 1c. Zorg ervoor dat voor het starten van de run de reagensflesjes voldoende reagens bevatten. Raadpleeg de reagensopstelling voor de benodigde hoeveelheden. 1d. Gebruik verse, azidevrije buffer. 2a. Raadpleeg de instructies in de paragraaf Kleuringsprocedure. 2b. Controleer of het patiëntenweefsel niet overmatig is gefixeerd of dat een niet-goedgekeurd fixatief is gebruikt. 2c. Controleer of het waterbad of hogedrukpan correct functioneert en of de antigeenversterkingsprocedure juist werd uitgevoerd. (Lage temperaturen en/of onjuiste tijdsinstellingen veroorzaken zwakke kleuring.) 3a. Gebruik verse clearingoplossingen en volg de procedure zoals vermeld in de paragraaf Deparaffineren en rehydreren. 3b. Vermijd het gebruik van additieven voor de hechting van coupes aan glazen objectglaasjes. Veel van deze materialen zijn immuunreactief. 3c. Zorg ervoor dat de Autostainer voldoende gevuld is voor de run. Controleer of er voldoende buffer aanwezig is voor de gehele run. Indien gewenst kan een extra spoeling worden toegevoegd na de visualisatiestap. 3d. Controleer of de juiste hoeveelheid reagens op de glaasjes wordt opgebracht. Zorg ervoor dat tijdens de run van de Autostainer de kap gesloten is en dat deze niet blootgesteld wordt aan overmatige hitte of tocht. 3e. Zorg ervoor dat de glaasjes vochtig blijven met buffer tijdens het laden en voorafgaand aan het opstarten van een run. 3f. Controleer op de juiste fixatie van het monster en/of de aanwezigheid van necrose. 4a. Onjuiste glaasjes gebruikt. 4a. Gebruik de geladen (Fisher s SuperFrost Plus) of gesilaniseerde glaasjes zoals Silanized Slides van Dako (code S3003). 5a. Onjuiste fixatiemethode gebruikt. 5a. Controleer of alleen de goedgekeurde fixatieven en fixatiemethoden worden gebruikt. 5b. Incubatietijd reagens te lang. 5b. Raadpleeg de instructies in de paragraaf Kleuringsprocedure. 5c. Onjuiste wasbuffer gebruikt. 5c. Gebruik alleen de voor het gebruik met de kit aanbevolen wasbuffer. 6a. Onvoldoende antigeenversterking. 6a. Controleer of de antigeenversterkingsprocedure correct werd uitgevoerd. 6b. Onvoldoende incubatietijd 6b. Controleer of de incubatieduur in de reagens. geprogrammeerde run klopt. (111802-003) 305756NL_001 p. 13/15

6c. Afbraak van het controleglaasje. 6c. Controleer de vervaldatum en opslagcondities van de kit zoals vermeld op de verpakking. Opmerking: raadpleeg de paragraaf Problemen oplossen in het Dako-handboek: Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition 16, de Atlas of Immunohistology 21 of Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 18 Meld ongebruikelijke kleuringsresultaten bij de afdeling technische ondersteuning van Dako. Referenties 1. Heinrich, M., Corless, C., Duensing, A., McGreevey, L., Chen, C.J., Joseph, N., Singer, S., Griffith, D., Haley, A., Town, A., Demetri, G., Fletcher, C. and Fletcher, J. PDGFRA Activating Mutations in Gastrointestinal Stromal Tumors, Science 229: 708-710, 2003 2. Taniguchi, M., Nishida, T., Hirota, S.. Isozaki, K., Ito, T., Nomura, T., Matsuda, and Kitamura, Y. Effect of c-kit mutation on prognosis of gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res 59: 4297-300, 1999 3. Medeiros, F., Codess. C.L., Duensing, A., Homick, J.L., Oliveira, AM., Heinrich, MC., Fletcher, J.A., Fletcher, C.D. KIT-negative gastrointestinal stromal tumors: Proof of concept and therapeutic implications. Am J Surg Pathol. Jul 28(7): 889-894 2004 4. Bühring H-J, Ashman LK, Gattei V, Kniep B, Larregina A, Pinto A, et al. CR2.7 Stem-cell factor receptor (p145(c-kit)) summary report (CD117). Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, et al., editors. Leukocyte typing V. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 5 th International Workshop and Conference; 1993 Nov 3 7; Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press 1995; 1882 5. Smithey BE, Pappo AS, Hill DA. C-kit expression in pediatric tumors: a comparative immunohistochemical study. Am J Surg Pathol 2002; 26:486 6. Hornick JL and Fletcher CDM. Immunohistochemical staining for KIT (CD117) in soft tissue sarcomas is very limited in distribution. Am J Pathol 2002; 117:188. 7. Demetri GD, von Mehren M, Blanke CD, Van den Abbeele AD, Eisenberg B, Roberts PJ, Heinrich MC, Tuveson DA, Singer S, Janicek M, Fletcher JA, Silverman SG, Silberman SL, Capdeville R, Kiese B, Peng B, Dimitrijevic S, Druker BJ, Corless C, Fletcher CD, Joensuu H. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors. NEJM 2002; 347, 7:472. 8. Fletcher CDM, Berman J, Corless C, Gorstein F, Lasota J, Longley JB, Miettinen M, O Leary TJ, Remotti H, Rubin BP, Shmookler B, Sobin LH, and Weiss SW. Diagnosis of Gastrointestinal Stromal Tumors: A Consensus Approach. Human Pathology May 2002; 33:5 459 9. Dematteo RP, Heinrich MC, El-Rifai WM, Demetri G: Clinical management of gastrointestinal stromal tumors: before and after STI-571. Human Pathol 2002; 33:466. 10. Hasegawa T, Matsuno Y, Shimoda T, Hirohashi S: Gastrointestinal stromal tumor: Consistent CD117 immunostaining for diagnostic and prognostic classification based on tumor size and MIB-1 grade. Human Pathol 2002; 33:669. 11. Graadt van Roggen JF, Van Velthuysen MLF, Hogendoorn PCW. The histopathological differential diagnosis of gastrointestinal stromal tumors. J Clin Pathol 2001; 54:96. 12. Kindblom LG, Remotti HE, Aldenborg F, Meis-Kindblom JM. Gastrointestinal pacemaker cell tumor (GIPACT): gastrointestinal stromal tumors show phenotypic characteristics of the interstitial cells of Cajal. Am J of Pathol 1998; 152, 5:1259. 13. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR7163, February 28, 1992 14. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Co. 1980 15. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981 16. Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook: Immunochemical Staining Methods. 3rd Edition. Dako 2001. 17. CLIS (formerly National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS). Quality Assurance for Immunocytochemistry; Approved guideline. Villanova, PA 1999. Order code MM4-A 18. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 19. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special Report: quality control in Immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 20. Herman GE, Effont EA. The taming of Immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech Histochem 1991; 66:194 21. Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. Atlas of Immunohistotechnology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986; 16 22. Demtri GD, Benjamin R, Blanke CD, Choi H, Corless C, DeMatteo RP, Eisenberg BL, Fletcher CDM, Maki RG, Rubin BP, Van den Abbeele AD, and Margaret von Mehren. NCCN Task Force Report: Optimal Management of Patients with Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST) Expansion and Update of NCCN Clinical Practice Guideline. Journal of the National Comprehensive Cancer Network 2004, Volume 1: Supplement 1. 23. Berman J, O Leary TJ. Gastrointestinal Stromal Tumor Workshop. Human Pathology 2001; 32(6):578 24. Omata M, Liew CT, Ascavali M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemsitry. Amer J Clin Pathol 1980; 73:626 25. Tsura Y, Hiraki H, Watanabe K, Igarashi S, Shimamura K, Fukuda T, et al. Preferential localization of c-kit product in tissue mast cells, basal cells of skin, epithelial cells of breast, small cell lung carcinoma and seminoma/dysgerminoma in human: immunohistochemical study on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Virchows Arch 1994; 424:135 26. Yardern Y, Kuang W-J, Yang-Feng T, Coussens L, Munemitsu S, Dull TJ, et al. Human proto-oncogene c-kit: a new cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand. EMBO J 1987; 6:3341 (111802-003) 305756NL_001 p. 14/15

(111802-003) 305756NL_001 p. 15/15