UvA-DARE (Digital Academic Repository) Cell-derived microparticles : composition and function Biró, É. Link to publication Citation for published version (APA): Biró, É. (2008). Cell-derived microparticles : composition and function General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: http://uba.uva.nl/en/contact, or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (http://dare.uva.nl) Download date: 15 Feb 2017
CHAPTER 14 Samenvatting
CHAPTER 14 M icropartikels zijn kleine blaasjes met een diameter van 0.1 1 μm die ontstaan tijdens activatie of apoptose van diverse celtypen door een proces van budding, d.w.z. uitstulpen en vervolgens afsnoeren van een deel van het celmembraan. In vivo verschilt de concentratie, cellulaire herkomst, samenstelling en functie van micropartikels per lichaamsvloeistof en is dit alles ook deels afhankelijk van de gezondheidstoestand van het individu. De afgelopen decennia is het aantal studies naar het mechanisme van ontstaan van micropartikels en naar hun samenstelling en functie bij diverse ziektebeelden exponentieel gegroeid. Desondanks waren veel vraagstukken nog niet opgehelderd. Het was bijvoorbeeld nog niet onderzocht of bij het ontstaan van micropartikels de lipiden selectief uit het celmembraan naar de micropartikels gesorteerd worden, en of vanuit hetzelfde type moedercel micropartikels met verschillende lipidensamenstellingen worden afgesnoerd bij gebruik van verschillende stimuli. Wat betreft hun functie waren de stollingsbevorderende eigenschappen van micropartikels die in vivo in de humane circulatie ontstaan, nog niet getest in in vivo modellen. Wat hun ontstekingsbevorderende eigenschappen betreft, was het vermogen van micropartikels om complement te activeren alleen in vitro getest en ontbrak bewijs dat hetzelfde ook in vivo zou gebeuren. Het doel van de studies beschreven in dit proefschrift was om een aantal aspecten rond de samenstelling van micropartikels te bestuderen, alsmede hun stollings- en ontstekingsbevorderende (met name complement activerende) eigenschappen bij diverse ziektebeelden. Deel I In Hoofdstuk 2 worden de methoden beschreven die in ons laboratorium worden gebruikt voor de bloedafname, initiële monsterverwerking, monsteropslag, isolatie en analyse van micropartikels met behulp van flowcytometrie. Bloed wordt afgenomen met minimale stuwing en met een naald met een grote diameter om celactivatie of -beschadiging te voorkomen. Als anticoagulans wordt voornamelijk citraat gebruikt, en na het scheiden van het plasma van de cellen door middel van centrifugeren, wordt het plasma dat ook de micropartikels bevat ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij 80 C. Vóór analyse worden de monsters op smeltend ijs ontdooid om de structuur van de micropartikels zo min mogelijk te beschadigen. De micropartikels worden door middel van differentiële centrifugatie geïsoleerd, vervolgens aangekleurd met fluorescente antistoffen en/of annexine V, en gemeten met behulp van de flowcytometer. Gebruik van geschikte controles en zorgvuldige titratie van alle probes is hierbij essentieel. Deel II In dit deel worden studies beschreven waarin de samenstelling en stollingsbevorderende eigenschappen van micropartikels werden onderzocht. 238
SAMENVATTING In Hoofdstuk 3 worden de fosfolipidensamenstelling en cholesterolgehalte van plaatjesmicropartikels, verkregen met verschillende stimuli, vergeleken met die van geïsoleerde plaatjesmembraanfracties (plasma-, granulaire-, en intracellulaire membranen), en daarnaast wordt de expositie van activatiemerkers geanalyseerd op de bloedplaatjes en de plaatjesmicropartikels. De fosfolipidensamenstelling van de micropartikels was significant verschillend van de fosfolipidensamenstelling van de intracellulaire membranen van bloedplaatjes, en bleek tussen de samenstelling van plasmamembranen en granulaire membranen in te zitten. Dit suggereert dat het samensmelten van de granulaire membranen met het plasmamembraan nog vóór het afsnoeren van micropartikels gebeurt, of in ieder geval dan al begonnen is. Deze resultaten zijn in overeenstemming met de bevinding dat antigenen op de micropartikels worden gevonden die bij rustende bloedplaatjes uitsluitend in de granulaire membranen te vinden zijn. De fosfolipidensamenstelling van de micropartikels was afhankelijk van de gebruikte plaatjesstimulus, en de verschillen in fosfolipidensamenstelling correleerden met de expositie van P-selectine op de micropartikels bij gebruik van de fysiologische stimuli collageen, trombine, of collageen plus trombine, maar niet bij gebruik van de calcium ionofoor A23187. Dit wijst erop dat de micropartikels verkregen met calcium ionofoor A23187 kwalitatief verschillen van die verkregen met fysiologische stimuli. Verder werd er een tendens tot een verhoogd cholesterolgehalte bij micropartikels waargenomen vergeleken met de drie plaatjesmembraanfracties, wat zou kunnen wijzen op een verrijking in lipid rafts in de micropartikels. Dit verdient verder onderzoek. In Hoofdstuk 4 wordt de trombogene werking van micropartikels geïsoleerd uit humaan bloed onderzocht in een in vivo model, alsmede de rol hierin van weefselfactor (tissue factor, TF) dat zich op het oppervlak van de micropartikels bevindt. In een veneus stase trombose model in ratten waren micropartikels, geïsoleerd uit pericardbloed van patiënten die een cardiochirurgische ingreep met cardiopulmonaire bypass (CPB) ondergingen, zeer trombogeen. Dit terwijl micropartikels geïsoleerd uit veneus bloed van gezonde vrijwilligers niet trombogeen waren. De hoeveelheid TF antigeen geëxposeerd op de micropartikels uit pericardbloed was hoger dan de geëxposeerde hoeveelheid op de micropartikels uit het bloed van gezonde vrijwilligers, en het stollingsbevorderende effect van de micropartikels uit pericardbloed kon volledig teniet worden gedaan door toevoeging van een remmende antistof tegen humaan TF terwijl een controle antistof geen effect had. Deze experimenten hebben dus laten zien dat humane micropartikels in vivo trombogeen zijn, dat deze eigenschap afhankelijk is van hun TF expositie, en dat hun fosfolipidenoppervlak op zich onvoldoende is om trombusvorming te veroorzaken in het gebruikte trombose model. In Hoofdstuk 5 wordt de fosfolipidensamenstelling van endotheelmicropartikels, afgesnoerd van rustende en van interleukine (IL)-1α-gestimuleerde endotheelcellen, geanalyseerd. Daarnaast wordt de trombogene werking van deze micropartikels getest, alsmede de rol van TF hierin, in het in vivo trombose model dat ook in Hoofdstuk 4 werd 14 239
CHAPTER 14 gebruikt. Micropartikels van IL-1α-gestimuleerde cellen bevatten grotere hoeveelheden van de aminofosfolipiden fosfatidylserine en fosfatidylethanolamine en ook meer TF antigeen, vergeleken met micropartikels van rustende endotheelcellen. De micropartikels van gestimuleerde endotheelcellen waren sterk trombogeen in het veneus stase trombose model in ratten, in tegenstelling tot de micropartikels van niet-gestimuleerde cellen, die niet trombogeen waren. De trombogene werking van de micropartikels van de gestimuleerde endotheelcellen was ook hier afhankelijk van TF. Dit blijkt uit het feit dat de werking met een remmende antistof tegen TF teniet kon worden gedaan, analoog aan de proeven met pericardmicropartikels beschreven in Hoofdstuk 4. In Hoofdstuk 6 wordt de relatie onderzocht tussen de mate van activatie van bloedplaatjes, gekwantificeerd aan de hand van hun P-selectine en CD63 expositie, en de aantallen en P-selectine en CD63 expositie van de micropartikels die van deze bloedplaatjes worden afgesnoerd na stimulatie in vitro. De gebruikte stimulantia waren de meer fysiologische stimulus trombine receptor activerend peptide (TRAP) en de calcium ionofoor A23187. Beide veroorzaakten een aanzienlijke toename van P-selectine en CD63 expositie op de bloedplaatjes, vergeleken met niet-geactiveerde bloedplaatjes. De aantallen afgesnoerde micropartikels waren bij stimulatie met TRAP niet verschillend van nietgeactiveerde bloedplaatjes, maar stimulatie met A23187 resulteerde in significant hogere aantallen micropartikels. De percentages micropartikels die de activatiemerkers exposeerden waren echter verhoogd zowel bij stimulatie met TRAP als bij stimulatie met A23187, terwijl deze activatiemerkers ontbraken op micropartikels van niet-geactiveerde bloedplaatjes. Deze experimenten hebben laten zien dat de percentages plaatjesmicropartikels die P-selectine en CD63 exposeren de mate van activatie van bloedplaatjes beter weerspiegelen dan de totale aantallen plaatjesmicropartikels. Vervolgens werden de concentraties plaatjesmicropartikels en hun P-selectine en CD63 expositie gemeten in jongere en oudere gezonde vrijwilligers en patiënten met cardiovasculaire aandoeningen. De totale concentraties plaatjesmicropartikels waren vergelijkbaar in alle groepen, maar in oudere gezonde vrijwilligers vergeleken met jongere werden hogere percentages micropartikels gevonden die P-selectine exposeerden (maar hetzelfde gold niet voor CD63). In patiënten met een myocardinfarct werden hogere percentages micropartikels gevonden met P-selectine en met CD63 op hun oppervlak, en in patiënten met perifeer arterieel vaatlijden alleen hogere percentages micropartikels met CD63 op hun oppervlak, vergeleken met hun controles, de oudere groep van gezonde vrijwilligers. In Hoofdstuk 7 worden merkers van stollingsactivatie, bloedplaatjes- en endotheelcelactivatie, fibrinolyse, en de acuut fase respons gemeten, alsmede de aantallen en cellulaire herkomst van micropartikels in patiënten met de ziekte van Fabry. In mannelijke patiënten waren oplosbaar TF (niet-micropartikel-gebonden TF) en β- tromboglobuline (een bloedplaatjes-specifieke activatiemerker, die tijdens plaatjesactivatie uit de α-granula wordt gesecreteerd) verhoogd ten opzichte van controles van hetzelfde 240
SAMENVATTING geslacht en leeftijd. In vrouwelijke patiënten waren trombine-antitrombine complexen (merkers van stollingsactivatie) en β-tromboglobuline, plaatjes factor-4 (eveneens een bloedplaatjes-specifieke activatiemerker, die tijdens plaatjesactivatie uit de α-granula wordt gesecreteerd), CD63 exposerende plaatjesmicropartikels, en IL-6 verhoogd. Oplosbaar TF correleerde met de nierfunctie en de ernst van de ziekte in mannelijke en vrouwelijke patiënten. In het algemeen waren de gevonden afwijkingen vergeleken met controles minimaal, en konden deze minstens ten dele door de verminderde nierfunctie van de patiënten verklaard worden. Er moet echter ook in beschouwing worden genomen dat meer dan de helft van de patiënten enzymtherapie kreeg, en de niet-behandelde patiënten een milder ziektebeloop hadden. Deel III In dit deel worden studies gepresenteerd waarin de complement-activerende eigenschappen van micropartikels werden onderzocht bij diverse ziektebeelden. Eerst wordt in Hoofdstuk 8 een kort overzicht van het complementsysteem gegeven en daarna een review van de experimentele data die de pathogene rol van het complement systeem in reumatoïde artritis (RA) ondersteunen. In de circulatie en in synoviaalvloeistof van RA patiënten werden verhoogde concentraties complementactivatieproducten gevonden, alsmede verlaagde concentraties niet-geactiveerde complementcomponenten in synoviaalvloeistof. Daarnaast werd depositie van geactiveerde complementcomponenten in synoviaal weefsel en in kraakbeen aangetoond. Als activatoren van het complementsysteem werden immuuncomplexen, C-reactief proteïne (CRP), en bepaalde immunoglobuline (Ig)G glycovormen aangewezen. Verder werd er een associatie aangetoond tussen complementactivatie en een ontstekingsrespons in de aangedane gewrichten en in de diverse typen cellen die in die gewrichten aanwezig zijn, en werden met behulp van diermodellen ook bewijzen geleverd dat complementactivatie een pathogene rol speelt in RA. Aan het einde van dit hoofdstuk wordt een overzicht gegeven van de therapeutische middelen die zijn ontwikkeld om het complementsysteem in RA te beïnvloeden. Vervolgens worden in Hoofdstuk 9 micropartikels uit synoviaalvloeistof en plasma van RA patiënten, en uit plasma van gezonde vrijwilligers geanalyseerd wat betreft oppervlak-gebonden complementcomponenten en complementactivatormoleculen. Micropartikels met de gebonden complementcomponenten C1q, C4 en/of C3 waren in hoge concentraties aanwezig in synoviaalvloeistof van de patiënten, terwijl ze in plasma van de patiënten en in plasma van de gezonde vrijwilligers slechts in lage concentraties aanwezig waren. Hetzelfde gold voor de oplosbare complementactivatieproducten C4b/c en C3b/c. De aanwezigheid van gebonden C1q en met name C4 en C3 (die een covalente binding aangaan met het oppervlak waarop ze zijn geactiveerd) op het oppervlak van de micropartikels suggereerde dat activatie van de klassieke route van het complementsysteem heeft plaatsgevonden op dat oppervlak, en deze resultaten wijzen op een rol van de micropartikels bij de activatie van het complementsysteem in vivo, in plasma van de 14 241
CHAPTER 14 patiënten en gezonde vrijwilligers (op een laag niveau) en in synoviaalvloeistof van de patiënten (op een hoog niveau). Wat betreft de activatormoleculen van de klassieke route, zoals CRP, serum amyloïd P-component (SAP), IgM en IgG, werd er een associatie gevonden in synoviaalvloeistof van RA patiënten tussen IgM en IgG gebonden op het oppervlak van de micropartikels en activatie van de klassieke route van het complementsysteem op dat oppervlak, terwijl in plasma van de patiënten en gezonde vrijwilligers een associatie gevonden werd tussen gebonden CRP en activatie van de klassieke route. In Hoofdstuk 10 werden vergelijkbare analyses uitgevoerd op micropartikels geïsoleerd uit pericardbloed en uit systemisch bloed van patiënten die een cardiochirurgische ingreep met CPB ondergingen. Pericardbloed bevatte hoge concentraties micropartikels met gebonden complementcomponenten op hun oppervlak, terwijl systemisch bloed aan het begin van de ingreep lage concentraties van dergelijke micropartikels bevatte, in overeenstemming met concentraties van de oplosbare complementactivatieproducten C4b/c en C3b/c. In pericardbloed was micropartikelgebonden SAP en IgM geassocieerd met complementactivatie op het oppervlak van de micropartikels, terwijl in systemisch bloed aan het begin van de ingreep micropartikelgebonden CRP daarmee geassocieerd was. Daarnaast is er gekeken of de teruggave van de pericardmicropartikels middels retransfusie van het pericardbloed een effect had op systemische complementactivatie in de patiënten. Concentraties van oplosbare complementactivatieproducten en van micropartikels met gebonden complementcomponenten of complementactivatormoleculen waren echter niet verschillend in systemisch bloed van patiënten aan het einde van de ingreep, ongeacht of ze wel of geen pericardmicropartikels teruggetransfundeerd kregen. Dit wijst erop dat teruggave van pericardbloed via transfusie aan de patiënten niet bijdraagt aan systemische complementactivatie aan het einde van de cardiochirurgische ingreep. In Hoofdstuk 11 wordt de rol van micropartikels bij complementactivatie in patiënten met een myocardinfarct onderzocht. Er werden geen verschillen gevonden tussen patiënten en gezonde vrijwilligers wat betreft aantallen micropartikels met gebonden complementcomponenten op hun oppervlak. Concentraties van het oplosbare complementactivatieproduct C3b/c waren wel iets verhoogd in de patiënten. In overeenstemming met vorige studies was er in gezonde vrijwilligers een associatie tussen micropartikel-gebonden CRP en complementactivatie op het oppervlak van de micropartikels. Er werd echter in de patiënten met myocardinfarct, ondanks verhoogde concentraties oplosbaar CRP en verhoogde concentraties micropartikels met gebonden CRP, geen associatie gevonden tussen micropartikel-gebonden CRP en complementactivatie, maar wel een associatie tussen micropartikel-gebonden IgG en complementactivatie op de micropartikels. Ten slotte wordt in Hoofdstuk 12 de rol van micropartikels in complementactivatie bestudeerd in vrouwen met preëclampsie en in gezonde zwangeren. Er werden geen 242
SAMENVATTING verschillen gevonden wat betreft micropartikels met gebonden complementcomponenten op hun oppervlak tussen vrouwen met preëclampsie en gezonde zwangeren. Hetzelfde gold voor oplosbare complementactivatieproducten. In gezonde niet-zwangere en gezonde zwangere vrouwen was CRP geassocieerd met complementactivatie op het oppervlak van de micropartikels, en in gezonde zwangere vrouwen ook IgM en IgG. In vrouwen met preëclampsie was, ook hier ondanks verhoogde concentraties oplosbaar CRP en verhoogde concentraties micropartikels met gebonden CRP, micropartikel-gebonden SAP en IgG maar niet CRP geassocieerd met C1q binding, echter zonder verdere activatie van het complementsysteem op het oppervlak van de micropartikels. Dit fenomeen (en de afwezigheid van CRP-geïnduceerde complementactivatie op de micropartikels in myocardinfarct patiënten) zou het gevolg kunnen zijn van de activiteit van remmers van het complementsysteem in deze patiënten, en zal verder onderzocht moeten worden. Samengevat dragen de studies beschreven in dit proefschrift bij aan een verdere opheldering van de samenstelling van micropartikels, in het bijzonder wat betreft de lipidensamenstelling van plaatjes- en endotheelmicropartikels die worden verkregen met verschillende stimulantia, en wat betreft het gebruik van plaatjesactivatiemerkers op micropartikels om de mate van activatie van bloedplaatjes van patiënten in te schatten. Daarnaast bewijzen deze studies de TF-afhankelijke trombogene werking van micropartikels in vivo, en leveren aanwijzingen dat ze ook in vivo en dus niet alleen in vitro aan de activatie van het complementsysteem kunnen bijdragen, maar ook dat het mechanisme hiervan per ziektebeeld verschilt. 14 243