UvA-DARE (Digital Academic Repository) Microenvironment and anti-cd20 based therapies in CLL Jak, M. Link to publication Citation for published version (APA): Jak, M. (2012). Microenvironment and anti-cd20 based therapies in CLL General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: http://uba.uva.nl/en/contact, or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (http://dare.uva.nl) Download date: 31 Jan 2017
Chronisch lymfatische leukemie Chronisch lymfatische leukemie (CLL) is een vorm van witte bloedcel (lymfocyten) kanker. Het is de meest voorkomende leukemie in de Westerse wereld. De ziekte treft met name oudere mensen; de gemiddelde leeftijd waarop CLL zich presenteert is 65 jaar. CLL kenmerkt zich door een ophoping van kwaadaardige lymfocyten (zogenaamde B-cellen) in het bloed maar ook in de lymfklieren, de milt en het beenmerg van de patiënt. Omdat de CLL cellen niet doodgaan en blijven delen, blijven de cellen zich ophopen in bovengenoemde organen. Patiënten krijgen dan last van vergrootte lymfklieren, een grote milt en verdringing van goede, niet kwaadaardige cellen in het beenmerg waardoor uiteindelijk o.a. een bloedarmoede kan ontstaan. Het beloop van de ziekte verschilt per patiënt en hangt van een aantal factoren af. De meeste patiënten (30%) hebben een mild ziektebeloop en blijven de eerste 5 tot 10 jaar symptoomloos. De ziekte wordt vaak ontdekt bij mensen zonder klachten die bijvoorbeeld een bedrijfskeuring ondergaan. Vijftien procent van de patiënten echter overlijdt binnen 2 tot 3 jaar na de diagnose. Er wordt steeds meer bekend over het verschil in CLL vormen en de bijbehorende verschillende prognoses. Zo is inmiddels duidelijk dat de mutatiestatus van de zware ketens van immunoglobulines (IGHV genen) een belangrijke voorspeller is van het ziektebeloop. Patienten met ongemuteerde IGHV genen hebben een beduidend slechtere prognose dan patiënten met gemuteerde IGHV genen. Ongemuteerde CLL cellen hebben een hogere expressie hebben van de B-cel receptor (BCR) dan gemuteerde CLL cellen. De BCR is een belangrijk eiwit op het oppervlak van B-cellen waarmee B-cellen signalen (antigenen) uit hun omgeving oppikken om te kunnen overleven en delen. Omdat ongemuteerde CLL cellen een hoge BCR expressie hebben en bovendien ook een sterkere BCR signaleringscapaciteit hebben, pakken ze dus makkelijker overlevingssignalen op uit hun omgeving (ook wel micromilieu genoemd) en blijven daardoor langer leven. CLL cellen gaan zoals gezegd niet makkelijk dood en blijven ongeremd delen, een kenmerk van de meeste kwaadaardige cellen. Rol micromilieu in CLL Er is veel onderzoek gedaan naar de onderliggende oorzaken van verminderde apoptose (het doodgaan van cellen) gevoeligheid van CLL cellen. Het blijkt dat CLL cellen veel anti-apoptotische eiwitten tot expressie brengen, eiwitten die processen van celdood remmen. Signalen die CLL cellen uit het micromilieu (in lymfklieren) ontvangen spelen hierbij een belangrijke rol. Deze gedachte wordt ondersteund door het feit dat CLL cellen in een reageerbuisje (dus buiten de patiënt) snel doodgaan terwijl ze in het lichaam van de patiënt juist lang blijven leven. Er moeten dus in het lichaam van de patiënt signalen aanwezig zijn die de CLL cellen in leven houden. Deze signalen krijgen CLL cellen van andere niet-cll cellen (bijvoorbeeld T-cellen) in de lymfklieren. Een voorbeeld van zo n overlevingssignaal is CD40 ligand (CD40L), een eiwit dat T-cellen op hun oppervlak hebben en dat kan binden met CD40 op CLL cellen. Niet alleen blijven CLL cellen beter leven als gevolg van signalen uit 155
het micromilieu, ook de delingscapaciteit neemt toe. Tenslotte worden CLL cellen resistent tegen verschillende soorten medicijnen als gevolg van signalen van cellen uit het micromilieu. In dit proefschrift is de rol van T-cellen in het overleven en het ontstaan van resistentie van CLL cellen voor medicijnen bestudeerd (hoofdstuk 2 en 3). Dit laatste vormt uiteraard een belangrijk probleem in de behandeling van CLL. Aan de ene kant beïnvloeden T-cellen CLL cellen door overlevingssignalen te geven waardoor CLL cellen langer blijven leven. Aan de andere kant hebben CLL cellen ook weer een invloed op de overleving en het ontstaan van bepaalde soorten T- cellen, o.a. de zogenaamde regulatoire T-cellen (Tregs). Tregs hebben een remmende werking op de afweerreactie en zijn in die zin ongunstig in CLL. De afweerreactie van het lichaam die optreedt tegen de slechte CLL cel met als doel deze te doden wordt geremd door de aanwezigheid van Tregs. CLL cellen zelf kunnen de vorming van Tregs induceren (beschreven in dit proefschrift) en zo dus zichzelf beschermen tegen een dodelijke aanval. Behandeling van CLL Of en wanneer patiënten met CLL behandeld worden hangt af van het stadium van de ziekte en de klachten van de patient. Als er behandeling nodig is, wordt dat gegeven in de vorm van chemotherapie al of niet gecombineerd met rituximab (een anti-cd20 antilichaam). In dit proefschrift is veel onderzoek gedaan naar het effect van anti-cd20 antilichamen op CLL cellen en hierover volgt later meer. De standaard behandeling voor relatief jonge patiënten in goede conditie is op dit moment fludarabine, cyclofosfamide en rituximab. Van deze behandeling is bewezen dat het de overall survival (overleving) significant verbetert. Helaas komt de ziekte echter altijd terug en is CLL tot op heden met onze huidige behandelingen niet te genezen. De oorzaak voor het terugkeren van de ziekte is het uiteindelijk resistent (ongevoelig) worden van de CLL cellen voor de behandelingsmiddelen (zoals bacteriën resistent worden tegen antibiotica). Er moet dus gezocht worden naar nieuwe middelen die deze resistentie omzeilen. Bovendien is het van belang middelen te zoeken die zowel efficiënt zijn, als weinig toxisch. Tenslotte zijn het over het algemeen oudere kwetsbare patiënten die behandeld moeten worden voor CLL. Een voorbeeld van minder toxisch middelen dan chemotherapie zijn antilichamen. Dit zijn eiwitten die lijken op lichaamseigen stoffen; in het menselijk lichaam worden antistoffen (antilichamen) aangemaakt door afweercellen om bijvoorbeeld bacteriën op te ruimen. Zo n antilichaam herkent een deel van de bacterie, bindt eraan en vervolgens helpen andere cellen het bacterie-antilichaam complex kapot te maken. Het gebruik van antilichamen als behandeling bij CLL werkt volgens datzelfde principe. Het antilichaam dat toegediend wordt herkent een deel van de CLL cel, bindt daaraan, en andere cellen helpen het antilichaam-cll complex kapot te maken. CD20, anti-cd20 antilichamen en manier van celdood Anti-CD20 antilichamen herkennen CD20, een eiwit dat CLL cellen tot expressie brengen. De functie van CD20 zelf is tot op heden niet opgehelderd, mogelijk speelt het een rol in 156
de deling en differentiatie van B-cellen. Alle B-cellen (zowel goedaardige als kwaadaardige) brengen CD20 tot expressie, met uitzondering van jonge B-cellen in het beenmerg en plasmacellen. Wanneer een patiënt anti-cd20 antilichamen krijgt gaan dus niet alleen de CLL cellen dood, maar ook de goedaardige gezonde B-cellen. De gezonde B-cellen herstellen wel weer na enkele maanden en een voordeel is dat de plasmacellen, die antilichamen maken tegen ziekteverwekkers, niet doodgaan (omdat ze geen CD20 tot expressie brengen) en de patient dus een redelijke afweer behoudt. De manier waarop CLL cellen doodgaan van anti-cd20 antilichamen is zoals boven beschreven (het antilichaam-cll complex wordt opgeruimd door andere cellen), maar ook directe inductie van celdood speelt een rol. De manier waarop dit gaat is niet geheel duidelijk. Als een anti-cd20 antilichaam bindt aan een CLL cel treedt er directe celdood op (zonder dat er andere cellen meehelpen). In dit proefschrift is onderzocht wat de mechanismen zijn van directe celdood inductie na binden van anti-cd20 antilichamen aan CLL cellen in vitro (dus buiten het lichaam van de patient in een reageerbuisje). Daarbij zijn verschillende anti-cd20 antilichamen bestudeerd: type I anti-cd20 antilichamen (rituximab) en type II anti-cd20 antilichamen (GA101). De twee typen onderscheiden zich van elkaar door verschillende eigenschappen: type II antilichamen kunnen sterker directe celdood induceren dan type I antilichamen. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door sterke klontering (homotypische aggregatie) te geven van cellen. Type I antilichamen induceren een calcium (Ca 2+ ) flux in cellen en type II antilichamen niet. De manier waarop de twee typen antilichamen celdood induceren verschilt dan ook wezenlijk. De verschillende mechanismen waarop de beide typen anti-cd20 antilichamen celdood induceren staan in dit proefschrift beschreven (hoofdstuk 4 en 5). Een mooie bevinding is dat de celdood door beide typen antilichamen van het niet-klassieke type is (niet-klassieke apoptose). Dat betekent dat de gangbare manieren van CLL cellen om zich resistent te maken voor klassieke apoptose (door b.v. veel anti-apoptotische eiwitten aan te maken), hier omzeild worden. De CLL cellen gaan op een andere manier dood en hebben niets aan hun resistentie trucjes die ze voor de chemotherapie gebruiken. Helaas brengen CLL cellen lage hoeveelheden CD20 tot expressie, waardoor ze relatief ongevoelig zijn voor celdood door anti-cd20 antilichamen. In dit proefschrift is het effect bekeken van signalen uit het micromilieu (met name het CD40L-CD40 signaal door interactie tussen respectievelijk T-cellen en CLL cellen) op de gevoeligheid van CLL cellen voor de verschillende anti-cd20 antilichamen. Hoewel CD40 stimulatie in CLL cellen aan de ene kant resulteert in resistentie voor chemotherapie, sensitiseert (maakt gevoeliger) het voor dood door anti-cd20 antilichamen. De manier waarop CD40 stimulatie CLL cellen gevoeliger maakt voor type I en type II antilichamen verschilt en staat beschreven in respectievelijk hoofdstuk 4 en 5. Tenslotte is nog bestudeerd wat het effect is van CD40 stimulatie en anti-cd20 behandeling in vivo in een muizenmodel (hoofdstuk 6). In dit proefschrift laten we zien dat vooral de combinatie chemotherapie met anti-cd20 lichamen veel celdood geeft in CLL cellen. Zelfs in CLL cellen die resistent zijn geworden voor de chemotherapie alleen. De combinatietherapie is dus veelbelovend in de therapie voor CLL. 157
Samenvatting van de hoofdstukken Dit inhoud van dit proefschrift is tweeledig: 1. het bestudeert het effect dat T-cellen en CLL cellen op elkaar hebben en 2. het analyseert het mechanisme en de modulatie van celdood door type I- en type II anti-cd20 antilichamen in CLL. In hoofdstuk 2 vergelijken we het effect van 2 in vitro systemen op activatie, resistentie en proliferatie van CLL cellen. Om die mechanismen te bestuderen, moeten er robuuste en betrouwbare experimentele systemen worden ontwikkeld die de lymfklier (het micromilieu) nabootsen. Een belangrijk signaal uit het micromilieu is CD40 stimulatie van CLL cellen door CD40L, dat tot expressie komt op geactiveerde T-cellen. In deze studie bootsen 2 in vitro systemen deze interactie na: een geactiveerd T-cel systeem (CLL cellen gekweekt met geactiveerde T-cellen) en een 3T40L systeem (CLL cellen gekweekt op een laag muizenfibroblasten die humaan CD40L tot expressie brengen). Activatie en resistentie worden gevonden in beide systemen. Proliferatie echter, een belangrijk kenmerk van CLL cellen in vivo, wordt alleen gezien in het geactiveerde T-cel systeem. Proliferatie is IL-21 afhankelijk. Hieruit blijkt het belang van T-cellen in de pathofysiologie van CLL. Het genexpressie profiel van CLL cellen gekweekt met of geactiveerde T-cellen, of CD40L-transfectanten komt overeen. En deze komt weer overeen met die van CLL cellen uit echte lymfklieren. We concluderen dat beide in vitro systemen de lymfklier goed nabootsen, maar dat gezien de inductie van proliferatie het geactiveerde T-cel systeem het meest betrouwbaar de lymfklier nabootst. In hoofdstuk 3 onderzoeken we de onderliggende mechanismen van verhoogde aantallen Tregs in CLL. Noch analyse van het T-cel receptor repertoire, noch CD45 isoform expressie op Tregs van CLL patiënten geeft bewijs voor chronische antigeen stimulatie als mogelijke oorzaak voor verhoogde Treg expansie in CLL. Echter, we vinden zowel langere overleving als toegenomen aanmaak van Tregs in CLL. RT-MLPA expressie analyse van 34 apoptose regulerende genen laat zien dat in vergelijking met andere CD4 + T cellen, Tregs van zowel gezonde mensen als van CLL patiënten een hoge expressie hebben van het pro-apoptotische Noxa en een lage expressie van het anti-apoptotische Bcl-2. Opvallend is dat Bcl-2 levels van Tregs in CLL patiënten significant hoger zijn dan in gezonde mensen. Dit resulteert in toegenomen overleving en toegenomen resistentie tegen cytostatica-geinduceerde apoptose. Tenslotte vinden we ook dat CLL cellen de aanmaak van Tregs kunnen induceren onder invloed van CD70. De plaats waar Treg aanmaak in het lichaam plaatsvindt is meest waarschijnlijk de lymfklier, waar CD40-geinduceerde opregulatie van CD70 op CLL cellen optreedt. Concluderend, accumuleren Tregs in CLL patiënten als gevolg van toegenomen overleving door verhoogde Bcl-2 expressie, en door verhoogde aanmaak geïnduceerd door CD27-CD70 interactie in proliferatie centra in de lymfklier. In hoofdstuk 4 bekijken we het mechanisme van directe celdood inductie in CLL cellen door het type I anti-cd20 antilichaam rituximab. We analyseren het effect van CD40 stimulatie, een belangrijk signaal uit het micromilieu verantwoordelijk voor de inductie van resistentie in vivo, op de gevoeligheid van CLL cellen voor rituximab. Aan de ene kant induceert CD40 158
stimulatie resistentie tegen cytostatica, maar aan de andere kant maakt het CLL cellen juist gevoeliger voor rituximab-geinduceerde celdood. De toegenomen gevoeligheid is specifiek voor anti-cd20 behandeling. Rituximab-geinduceerde celdood in CD40-gestimuleerde CLL cellen gaat snel (binnen enkele uren is de cel dood) en is caspase- en p53-onafhankelijk. Rituximab induceert Ca 2+ - en zuurstof radicaal (ROS)- afhankelijke niet-apoptotische celdood. Door de basale ROS productie te verhogen maakt CD40 stimulatie CLL cellen gevoeliger voor rituximab-geinduceerde celdood. Tenslotte, zien we bij combinatie behandeling met rituximab en fludarabine synergistische effecten op celdood in CD40-gestimuleerde CLL cellen. Door ROS te induceren, maakt rituximab CLL cellen gevoeliger voor fludarabinegeinduceerde celdood. In hoofdstuk 5 onderzoeken we de onderliggende mechanismen van het type II anti-cd20 antilichaam (GA101) geïnduceerde celdood in CLL. Ook hier maakt CD40 stimulatie CLL cellen gevoeliger voor anti-cd20 geinduceerde celdood, en we hebben de basis voor deze sensitisatie ontrafeld. GA101-geinduceerde celdood treedt al op zonder toevoeging van een tweede crosslinking antilichaam. GA101 induceert lysosomale celdood in CLL, waar het barsten van lysosomen zorgt voor een uitstoot van hydrolases in het cytosol en voor niet-klassiek apoptotische celdood. CD40 stimulatie vermeerdert het aantal lysosomen en de activiteit ervan en daarbij sensitiseert het CLL cellen voor GA101-geinduceerde celdood. Tenslotte testen we in CD40 gestimuleerde CLL cellen het effect van combinatie behandeling met GA101 en verschillende cytostatica op celdood. Combinatie behandeling resulteert in sterke celdood inductie, ook in ongemuteerde en in p53-dysfunctionele CLL cellen. Deze data laten zien dat GA101 effectief is tegen chemoresistente CLL cellen. Hoofdstuk 4 en 5 geven een rationale voor de behandeling van CLL cellen met een combinatie van cytostatica en anti-cd20 antilichamen. Hoofdstuk 6 beschrijft de potentiële rol van CD40 stimulatie op celdood geïnduceerd door type I- en type II anti-cd20 antilichamen in vivo. Humaan CD20 transgene muizen worden eerst behandeld met muizen anti-cd40 antilichamen en vervolgens krijgen zij rituximab of GA101 toegediend. Na 5 dagen wordt B-cel depletie in het perifere bloed en secundair lymfoide organen gemeten. Ook in muizen, sensitiseert CD40 stimulatie in vitro voor anti-cd20 gemedieerde celdood. CD40 stimulatie in vivo geeft een massale toename van het totaal aantal B-cellen in perifeer bloed, milt en lymfklieren, die allemaal gedepleteerd worden na rituximab of GA101 behandeling. Een uitzondering zijn de rijpe B-cellen in het beenmerg, waar CD40 voorbehandeling leidt tot resistentie voor zowel rituximab als GA101. Over het algemeen worden er in dit systeem geen verschillen gevonden tussen rituximaben GA101-geinduceerde celdood. We concluderen dat voor de meeste B-cel subsets CD40-CD40L interactie een onwaarschijnlijk mechanisme is voor het ontstaan van resistentie voor anti-cd20 antilichamen. In vivo behandeling met CD40 antilichamen moet voorzichtig worden benaderd omdat CD40 stimulatie resulteert in een forse toename van B-cel aantallen, wat voor patiënten met B-cel maligniteiten zeer onwenselijk is. 159
In hoofdstuk 7 wordt een samenvatting en discussie gegeven en worden suggesties gedaan voor toekomstige behandelingen voor CLL. Conclusie Hoewel voor CLL tot op heden geen curatieve behandeling is, geeft het groeiende inzicht in de effecten van het micromilieu, op zowel de biologie van CLL cellen als de gevoeligheid voor cytostatica en anti-cd20 antilichamen, ons nieuwe mogelijkheden voor toekomstige verbeteringen in de behandelingsresultaten in CLL patiënten. 160