UvA-DARE (Digital Academic Repository) Pattern recognition receptors, sensing re(n)al danger Pulskens, W.P.C. Link to publication Citation for published version (APA): Pulskens, W. P. C. (2012). Pattern recognition receptors, sensing re(n)al danger General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: http://uba.uva.nl/en/contact, or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 12 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (http://dare.uva.nl) Download date: 15 jan. 2017
Nederlandse samenvatting De nieren zijn belangrijke organen die onder andere verantwoordelijk zijn voor de regulatie en handhaving van een optimale zout- en waterhuishouding van het lichaam. Een nier fungeert hiervoor als een filter waarin het bloed gezuiverd wordt en afvalstoffen worden afgevoerd. Nierfalen is momenteel een groot klinisch probleem wat geassocieerd wordt met een hoge mate van morbiditeit en mortaliteit. De nog steeds toenemende incidentie van nierfalen legt hiermee een enorme druk op de kosten en capaciteit van de gezondheidszorg, en doordat de huidige behandelingsmogelijkheden slechts ondersteunend zijn, is het essentieel dat meer kennis vervaardigd wordt om de onderliggende moleculaire pathologische processen die leiden tot nierfalen te ontrafelen. Een belangrijk kenmerk waar verschillende vormen van nierfalen, onafhankelijk van de onderliggende oorzaak, mee te karakteriseren zijn is ontsteking. Ontstekingsreacties dragen daarnaast ook sterk bij aan het ontstaan van verschillende vormen van nierfalen. De huidige opvatting is dat ontstekingsreacties worden opgewekt door zogenoemde patroon-herkennings receptoren die behoren tot het aangeboren immuunsysteem. Deze receptoren kunnen, naast pathogene componenten, verschillende lichaamseigen moleculen detecteren die vrijkomen na cel- of weefselschade. In het onderzoek beschreven in deze thesis hebben we de rol van verschillende van deze patroon-herkennings receptoren onderzocht in de onderliggende pathologische processen van nierfalen. Hiervoor hebben we gebruik gemaakt van de experimentele modellen ischemie/reperfusie (I/R) en unilaterale ureter obstructie (UUO) die representatief zijn voor acuut en chronisch nierfalen. In hoofdstuk 2 hebben we de rol van Toll-like receptor (TLR)-4 en zijn twee intracellulaire signaleringscascades, de MyD88- en TRIF-afhankelijke cascades, bestudeerd tijdens acuut nierfalen. Uit onze resultaten blijkt dat TLR4 zorgt voor het opwekken van een heftige en overdreven ontstekingsreactie na I/R, welke geassocieerd is met verhoogde schade aan de nierbuisjes (tubuli) en een verminderde nierfunctie. Daarnaast hebben we door gebruik te maken van beenmerg chimere muizen en in vitro experimenten met behulp van primaire tubulus epitheel cellen laten zien dat het nier epitheel-geassocieerde TLR4 een belangrijke rol speelt in dit pathologisch proces. We vonden echter geen preferentieel gebruik van ofwel de MyD88- dan wel de TRIF-afhankelijke signaleringscascades gedurende I/R schade. Deze data suggereren dat selectieve blokkering van TLR4 potentiële positieve effecten zou kunnen hebben tijdens acuut nierfalen om daarmee de ontstekingsreacties te temperen dat vervolgens de nier morfologie en functie helpt te behouden. 193
In hoofdstuk 3 hebben we gekeken welke functie het intracellulaire NLRP3- inflammasoom heeft in de detectie van necrotische cellen en de daaropvolgende ontstekingsreactie. Uit onze resultaten blijkt dat het NLRP3-inflammasoom verschillende vormen van necrotische cellen, waaronder cellen die necrotisch zijn als gevolg van hypoxie (zuurstoftekort), kan detecteren en vervolgens zorgt voor de secretie van IL1β, een belangrijk proinflammatoir molecuul. Dit effect wordt voornamelijk veroorzaakt door de mitochondriale subfractie van deze necrotische cellen, waaronder via ATP, dat geproduceerd wordt door actief functionerende mitochondriën. Ook in vivo zagen we dat afwezigheid van het NLRP3-inflammasoom leidt tot hogere overleving, minder verlies van nierfunctie en minder ontsteking gedurende acute tubulaire necrose. Deze data suggereren dat remming van het NLRP3-inflammasoom de acute ontstekingsreactie en daaraan geassocieerde tubulaire schade kan verminderen tijdens acuut nierfalen. In hoofdstuk 4 hebben we gekeken wat de rol van de nier is in de detectie van mitochondriën en mitochondriale componenten en het opwekken van ontstekingsreacties. Mitochondriën zijn een intracellulaire bron van endogene moleculen die het aangeboren immuunsysteem kunnen activeren. Uit onze resultaten blijkt dat nier epitheelcellen een ontstekingsreactie opwekken na stimulatie met necrotische cellen, die deels veroorzaakt wordt door de mitochondriale subfractie. Muizen met steriele nierschade blijken verhoogde concentraties van circulerend mitochondriaal DNA (mtdna) te hebben. Daarnaast leidt het inspuiten van mtdna in de circulatie tot een ontstekingsreactie in de nier, welke echter niet geassocieerd is met verlies van nierfunctie. Ernstig zieke mensen met de diagnose SIRS (systemische ontsteking) blijken verhoogde concentraties van cytokines (ontstekingsstofjes) en mtdna in hun plasma te hebben vergeleken met andere patiënten op de intensive care unit. Het additioneel ontstaan van acuut nierfalen had hier geen additioneel significant effect meer op. Deze data laten zien dat de nier cellulaire schade detecteert in de vorm van mitochondriën om vervolgens een ontstekingsreactie te induceren. Daarnaast blijkt acuut nierfalen geassocieerd te zijn met hoge concentraties mtdna in de circulatie, dat overeenkomt met eerdere studies die suggereerden dat mitochondriën een link vormen tussen weefselschade en ontsteking. We denken dat de nier actief kan participeren in dit proces. De aanwezigheid en verhoging van concentraties mtdna in de circulatie zou een voorspellende waarde kunnen vormen voor het ontstaan van systemische ontsteking met of zonder acuut nierfalen. Het nucleaire eiwit HMGB1 wordt uitgescheiden door necrotische cellen en kan daardoor fungeren als een DAMP om ontstekingsreacties op te wekken, onder 194
andere via de receptor RAGE. In hoofdstuk 5 hebben we de therapeutische mogelijkheden bekeken van aangrijpen in de HMGB1-RAGE as en het neutraliseren van HMGB1 door middel van blokkerende antilichamen. Onze resultaten laten zien dat het remmen van HMGB1 door middel van specifieke blokkerende antilichamen een duidelijk positief effect teweegbrengt gedurende nier I/R schade, wat blijkt uit de verbeterde nierfunctie en verminderde nierschade en ontstekingsreactie. Daartegenover blijkt echter dat genetische deficiëntie van RAGE geen effect heeft op de nierfunctie en schade, zodat het fenotype gelijkwaardig is tussen wild type en RAGE deficiënte muizen gedurende nier I/R. Deze resultaten leveren bewijs dat het endogene molecuul HMGB1 massaal vrijkomt tijdens acuut nierfalen en vervolgens zorgt voor nierschade en verminderde nierfunctie door activatie van het aangeboren immuunsysteem. Deze effecten blijken echter onafhankelijk te zijn van de receptor RAGE. In hoofdstuk 6 hebben we de rol van de intracellulaire calciumbindende eiwitten S0A8 en S0A9 onderzocht tijdens acuut nierfalen. Deze moleculen zijn aangetoond tijdens ischemische orgaanschade, en ze zijn beschreven als specifieke liganden voor TLR4, zodat het vrijkomen van deze moleculen bij celschade zou kunnen leiden tot het opwekken van een ontstekingsreactie. In deze studie laten we zien dat S0A8 en S0A9 sterk tot expressie komen op tubulus epitheel cellen, en dat ze een TLR4-afhankelijke ontstekingsreactie opwekken in deze cellen. In de acute fase na I/R is de expressie van S0A8/A9 in de nier sterk verhoogd, maar ze dragen niet bij aan de vorming van tubulaire schade of verminderde nierfunctie. Deficiëntie van S0A9 (en als gevolg daarvan een niet functionerend S0A8/A9 complex) leidt echter tot aanhoudende verminderde nierfunctie, tubulaire schade, en een chronische ontstekings- en fibrotische reactie in de herstelfase na I/R. Bovendien zien we in deze muizen een aanhoudende polarisatie naar zogenoemde M2-type macrofagen. Extracellulair S0A8/A9 leidt voornamelijk tot een M1-type macrofaag activatie, terwijl macrofagen van S0A9 deficiënte muizen een hyper activatie zien van voornamelijk M2-type macrofagen. Deze data impliceren dat extracellulair dan wel intracellulair S0A8 en/of S0A9 op een verschillende manier de intrinsieke macrofaag activatie en polarisatie beïnvloeden. Dit heeft gevolg met betrekking tot het aanzetten van essentiële herstelmechanismen in de nier na schade. Progressief nierfalen is te karakteriseren als een cascade van verschillende onderliggende pathologische processen, waaronder de lokale ophoping van macrofagen en myofibroblasten, verbindweefseling en atrofie van de tubuli. In hoofdstuk 7 bestudeerden wij of TLR4 een rol speelt in deze processen door middel 195
van het experimentele UUO model dat de pathologie van chronische nierschade nabootst. Onze resultaten laten zien dat TLR4 in eerste instantie zorgt voor een vertraging in het ontstaan van de tubulaire schade, maar in de latere fase wel zorgt voor verhoogde fibrose tijdens UUO. Afwezigheid van TLR4 is geassocieerd met verhoogde expressie van Bambi, een negatieve regulator van TGFβ signalering, hoewel de expressie van TGFβ zelf niet wordt beïnvloed. Uit in vitro experimenten blijkt dat primaire tubulus epitheel cellen en myofibroblasten een TLR4-afhankelijke profibrotische reactie opwekken na TGFβ stimulatie, dat is geassocieerd met verhoogde levels van Bambi. Deze data suggereren dat TLR4 de gevoeligheid van niercellen beïnvloedt voor TGFβ stimulatie, en dat dit een therapeutische mogelijkheid zou kunnen zijn om verbindweefseling van de nier te remmen gedurende chronische nierschade. In hoofdstuk 8 onderzochten we de rol van het intracellulaire NLRP3-inflammasoom gedurende progressief nierfalen door middel van NLRP3 deficiënte muizen te onderwerpen aan het experimentele UUO model. Hieruit blijkt dat NLRP3 deficiëntie leidt tot verhoogde tubulaire schade en interstitieel oedeem vorming. Dit zou kunnen worden verklaard door de verhoogde intratubulaire druk en verhoogde tubulaire en vasculaire permeabiliteit in NLRP3-deficiente muizen, als gevolg van de gereduceerde expressie van adhesie moleculen (claudines) die cellen binden aan elkaar. De verminderde epitheel barrière functie in de NLRP3 deficiënte muizen is niet geassocieerd met een verandering in het aantal apoptotische of delende cellen. Bovendien blijkt uit onze resultaten dat afwezigheid van NLRP3 geen invloed heeft op de opwekking van ontstekingsreacties en verbindweefseling van de nier gedurende UUO. Deze data suggereren een belangrijke rol voor het NLRP3-inflammasoom in het behouden van de nier integriteit en de bescherming tegen tubulaire schade in de vroege fase tijdens progressief nierfalen. 196