Proefschrift_Moyo_Kruyt.book Page 167 Wednesday, eptember 10, 2003 1:03 PM amenvatting amenvatting in het Nederlands Introductie Binnen de orthopaedie wordt op grote schaal gebruik gemaakt van lichaamseigen bot. Dit wordt gebruikt om het genezingsproces van vaak gecompliceerde reparaties aan het bot te stimuleren. Een goed voorbeeld is de zogenaamde posterolaterale wervelfusie: hierbij wordt het lichaamseigen bot naast de wervellichamen gelegd. Nieuw bot dat vanuit de wervellichamen groeit kan het getransplanteerde bot als model/voorbeeld gebruiken en het in de loop van de tijd volledig vervangen. Zo kunnen de twee wervellichamen met nieuw bot aan elkaar vast groeien. Door evolutionaire selectie heeft het menselijk lichaam zich gedurende minstens een miljoen jaar uiterst efficiënt ontwikkeld. Daarbij is geen rekening gehouden met de orthopaedische mogelijkheden van de laatste honderd jaar. Helaas is er dus geen (grote) voorraad reservebot aangemaakt. Het wegnemen van lichaamseigen bot (meestal uit de bekkenkam) is dus in principe een verminking die niet straffeloos kan plaats vinden. De nadelige gevolgen zijn veelomvattend en betreffen met name pijnklachten. Het is daarom een grote uitdaging een alternatief te ontwikkelen voor het lichaamseigen bot met wel alle voordelen, maar niet de nadelen. Daarvoor is het belangrijk de voordelen van het lichaamseigen bot te kennen en mee te nemen in de ontwikkeling van een alternatief: in de eerste plaats wordt het lichaamseigen bot per definitie niet als lichaamsvreemd ervaren en kan het probleemloos worden geïmplanteerd zonder afstotingsverschijnselen. Bij bot van andere (menselijke) donoren, dat veelvuldig als een alternatief wordt gebruikt, is acceptatie van het weefsel wel een probleem, naast het risico dat ziektekiemen kunnen worden overgebracht. In de tweede plaats is een belangrijk voordeel van met name het trabeculaire bot (uit de bekkenkam) dat dit een uitstekend voorbeeldmateriaal is voor het nieuwe reparatiebot. Ten derde, een omstreden maar zeer opvallend verschil tussen het lichaamseigen bot en de huidige alternatieven is dat het lichaamseigen bot vol met levende cellen zit op het moment van transplantatie. In hoeverre dit ook echt een voordeel is, is echter tot op heden onbekend. De belangrijkste reden om hieraan te twijfelen is dat de cellen gedurende de eerste periode na transplantatie afgesloten zijn van bloedvoorziening en daardoor moeilijk kunnen overleven. Vele fundamentele onderzoekers stellen daarom dat alleen in het allerbuitenste deel (zo n 300µm), of in zeer kleine transplantaten (enige kubieke 167
Proefschrift_Moyo_Kruyt.book Page 168 Wednesday, eptember 10, 2003 1:03 PM millimeters) cellen kunnen overleven, terwijl de gangbare grootte van een klinisch toegepast transplantaat al gauw enige kubieke centimeters is (1000x zo groot). Desalniettemin wordt door vele (meer klinisch georiënteerde) onderzoekers verondersteld dat een aanzienlijk aantal van de cellen overleeft en bijdraagt aan nieuwe botvorming. Op basis van de (omstreden) voordelen die het lichaamseigen bot heeft ten opzichte van de huidige alternatieven wordt daarom verondersteld dat een optimaal alternatief moet beschikken over de volgende drie eigenschappen: 1 Volledige acceptatie door de ontvanger; 2 Optimale voorbeeldsfunctie voor nieuw bot; 3 Voorzien van levende cellen die nieuw bot kunnen vormen. Wanneer verschillende wetenschappelijke disciplines gaan samenwerken om vervangingsweefsel zoals een alternatief voor het lichaamseigen bot te ontwikkelen, noemen we dit tissue engineering. Een veelbelovende vorm van tissue engineering is ontstaan uit de combinatie van vindingen in de jaren zeventig van de vorige eeuw, door twee zeer verschillende disciplines. Vanuit de technische chemie werd ontdekt dat het mogelijk is calciumfosfaten zo te mengen en te bakken dat een poreus keramiek ontstaat. Dit materiaal bleek volledig door het lichaam te worden geaccepteerd en, beter nog, een uitstekende geleider voor nieuwe botvorming. Eigenlijk is dat ook niet zo verwonderlijk omdat het mineraal waaruit bot voor het grootste deel bestaat, chemisch gezien, van dezelfde compositie is. Vanuit de haematologie (geneeskunde) was ontdekt dat om bloed-stamcellen, die werden gebruikt voor beenmergtransplantaties, buiten het lichaam te laten groeien, deze cellen op een matras van ondersteunende cellen gekweekt moesten worden. Deze cellen bleken in het beenmerg aanwezig en werden stromale cellen (= Latijn voor matrascellen) genoemd. Lang bleven deze cellen alleen verdienstelijk voor het kweken van de haematologische cellen, tot werd ontdekt dat deze stromale cellen zich in allerlei richtingen konden ontwikkelen. De celsoorten die zo ontstaan bevonden zich allemaal binnen een bepaalde embryonale kiemlaag, de zogenaamde mesodermale laag, waaruit het steun en bewegingsapparaat ontstaat, met onder andere bot en kraakbeencellen. Een andere naam voor deze cellen is ook wel mesenchymale stamcellen. Het onderzoek kwam in een stroomversnelling toen bleek dat de combinatie van poreus keramiek als een dragermateriaal met deze cellen osteogeen was, dit wil zeggen uit zichzelf bot kon maken op plaatsen waar bot normaal niet voorkomt (bijvoorbeeld in de spieren). indsdien is er veel onderzoek gedaan naar tissue 168
Proefschrift_Moyo_Kruyt.book Page 169 Wednesday, eptember 10, 2003 1:03 PM amenvatting engineered bot. Ook in een botomgeving (waar het uiteindelijk zal moeten functioneren) bleek het in staat de genezing te versnellen. Hoewel in het begin snel vooruitgang werd geboekt, met name in kleine proefdieren met relatief kleine implantaten, is de doorbraak naar de kliniek nog niet gekomen. Dit komt met name doordat grotere implantaten (met een veel slechtere overlevingskans) het een stuk minder goed blijken te doen. Zoals zo vaak bij nieuwe ontwikkelingen blijkt ook tissue engineering veel gecompliceerder dan gehoopt. Het doel van ons onderzoek was verschillende aspecten van bot tissue engineering met betrekking tot de haalbaarheid in de klinisch situatie te onderzoeken: 1 Onderzoeken wat de rol is van levende cellen in lichaamseigen bot; 2 Onderzoeken wat de rol is van levende cellen in tissue engineered bot; 3 Ontwikkelen van een techniek om cellen te markeren en vervolgen; 4 Optimaliseren van de tissue engineering techniek; 5 Onderzoeken van de haalbaarheid van tissue engineering voor klinische toepassingen. Daarvoor hebben we vooral gebruik gemaakt van een model waarbij we de werking onderzochten van relatief grote implantaten in de spieren van de geit. Het voordeel van dit model (in de spieromgeving) is dat veel verschillende condities tegelijkertijd kunnen worden onderzocht en dat het gevonden bot met zekerheid afkomstig is van het implantaat en niet deels van omringend bot, zoals in een botomgeving. Bevindingen Ad. 1: De rol van levende cellen in lichaamseigen bot hebben we onderzocht door bot zowel levend als dood te transplanteren in de spieren van geiten. Immers, als levende cellen een rol spelen, zou een verschil meetbaar moeten zijn. Na 12 weken implantatie was inderdaad een groot verschil zichtbaar. Een deel van de dode transplantaten was na 12 weken totaal verdwenen terwijl de levende transplantaten als stevige massa s van (nieuw) bot werden teruggevonden. In tegenstelling tot het dode bot had het levend getransplanteerde bot veel nieuw bot gevormd. Ad. 2: De rol van levende cellen in tissue engineered bot hebben we op een vergelijkbare manier onderzocht. Ook hier bleek nieuwe botvorming in de spier alleen mogelijk met levend getransplanteerde cellen. 169
Proefschrift_Moyo_Kruyt.book Page 170 Wednesday, eptember 10, 2003 1:03 PM Ad. 3: Een andere methode om te onderzoeken wat de rol is van de cellen, is deze voordat ze worden getransplanteerd te markeren en later in het histologisch beeld te identificeren. Eerst hebben we een markering onderzocht met een fluorescerende stof. Deze kon de cellen goed markeren maar bleek helaas door niet-gemarkeerde gastheercellen cellen te kunnen worden overgenomen. Hierdoor kon de afkomst van gemarkeerde cellen niet meer met zekerheid worden vastgesteld. Een andere methode die we hebben ontwikkeld was met een zogenaamde retrovirale marker. Dit is een methode die met behulp van een virus een markering aanbrengt in het DNA van de cellen en daardoor zeer specifiek is en blijft. Deze methode bleek succesvol en in een studie naar tissue engineered bot in muizen konden we via een directe weg aantonen dat deze cellen inderdaad het nieuwe bot maakten. Ad. 4: Voor het optimaliseren van de techniek hebben we verschillende dragermaterialen en procedures onderzocht. Wat betreft het dragermateriaal bleek dat naast de gewone (macro)porositeit ook de microporositeit van groot belang is. De door IsoTis ontwikkelde drager van biphasisch calciumphosphaat (BCP) met een hoge microporositeit bleek uiteindelijk optimaal. Daarnaast bleek het goed mogelijk om tijdens de operatie cellen die bewaard waren in vloeibare stikstof direct te gebruiken. Dit maakt de procedure een stuk eenvoudiger in vergelijking met de procedure die daarvoor werd gebruikt. Daarbij werd de combinatie van cellen en drager eerst nog een week doorgekweekt en werden de cellen door bepaalde stoffen toe te voegen gestimuleerd om botcel te worden. De operatie moest daarom al een week van te voren vast staan. Wanneer de operatie op het laatst toch niet door zou kunnen gaan (wat in een ziekenhuis niet ondenkbaar is) zou alle moeite voor niets zijn geweest. Ad. 5: Om te onderzoeken of de tissue engineering techniek ook werkte in een klinisch relevant model, hebben we deze onderzocht in een groot botdefect in de geit. Het grote verschil met de andere studies in de spieren was: 1) de grootte van de transplantaten, waardoor overleven van cellen nog moeilijker was en 2) de omgeving. De botomgeving is toch heel anders dan in de spier. Het zou zelfs zo kunnen zijn dat het normale reparatieproces in bot, als reactie op een door ons aangebracht defect, helemaal niet gediend is van de grote hoeveelheid cellen die worden geïmplanteerd. Hoewel er op de korte termijn (9 weken) wel een positief effect van de cellen meetbaar was, bleek dit op de langere termijn (12 weken) niet meer aanwezig. Mogelijk komt dit doordat het reparatiemechanisme van het bot zo sterk is dat het effect van de cellen wordt overschaduwd. 170
Proefschrift_Moyo_Kruyt.book Page 171 Wednesday, eptember 10, 2003 1:03 PM amenvatting Conclusie De resultaten zijn tot nu toe zeer bemoedigend. Het levend zijn van zowel lichaamseigen bot als van tissue engineered bot bleek een absolute voorwaarde voor nieuwe botvorming in de spieren van de geit. Dit betekent dat het uitgangspunt van de noodzaak van levende cellen voor tissue engineering kan worden onderbouwd. Het onderzoek naar de gemarkeerde cellen heeft ook laten zien dat die cellen inderdaad in het nieuw gevormde bot aanwezig zijn. De manier waarop het nieuw gevormde bot zich gedraagt is echter nog onduidelijk, en met name of het echt een bijdrage levert in klinisch relevante situaties is nog niet aangetoond. De techniek staat dus nog in de kinderschoenen en van een volwaardig alternatief voor het lichaamseigen bot is nog geen sprake. Toch kunnen we op basis van het onderzoek concluderen dat tissue engineering de potentie heeft een ideaal alternatief voor het lichaamseigen bot te worden. 171