UDC 631.423.4:631.465 Bodem Bepaling van de urease-activiteit NEDERLANDSE NORM NEN 5796 Soil - Determination of urease activity 1e druk, november 1989 1 Onderwerp Deze norm beschrijft een methode voor het bepalen van de urease-activiteit (ureolytische activiteit) van grond. 2 Toepassingsgebied De norm is van toepassing op alle soorten grond. Bij de bepaling is het van belang dat het grondmonster homogeen is. De methode is niet bruikbaar bij inhomogene grondmonsters. De norm is bedoeld om te worden toegepast bij de bepaling van de invloed van chemische stoffen op de urease-activiteit van grond. Voor een toelichting op het gebruik van de norm in dergelijk onderzoek, zie de bijlage. Dit document mag slechts op een stand-alone PC worden geinstalleerd. Gebruik op een netwerk is alleen. toestaan als een aanvullende licentieovereenkomst voor netwerkgebruik met NEN is afgesloten. This document may only be used on a stand-alone PC. Use in a network is only permitted when a supplementary license agreement for us in a network with NEN has been concluded. 3 Beginsel Door incubatie van een grondmonster met een ureumoplossing wordt ureum door het enzym urease omgezet in koolstofdioxide en ammoniak. De resterende hoeveelheid ureum wordt fotometrisch bepaald en de urease-activiteit wordt berekend op basis van de snelheid van omzetting van ureum. 4 Reagentia Gebruik alleen reagentia van analytisch zuivere kwaliteit en gedemineraliseerd water. De hierna vermelde ureumoplossingen dienen telkens vers te worden bereid, de overige oplossingen zijn ten minste 6 maanden houdbaar. 4.1 Ureumoplossing, p(ch 4 N 2 0) = 0,060 mol/l. 4.2 Oplossing van fenylkwikacetaat in dimethylsulfoxide, p(c 8 H 8 0 2 Hg) = 5 g/l. Waarschuwing Kwikhoudende analyseresiduen dienen zorgvuldig te worden verzameld en mogen niet worden geloosd op de riolering. Ze kunnen ter verwerking worden aangeboden aan bedrijven die erkend zijn in het kader van de Wet chemische afvalstoffen. 4.3 Oplossing van kaliumchloride in water, c(kci) = 2 mol/l. 4.4 Fenylkwikacetaat/kaliumchloride-oplossing p(c 8 H 8 0 2 Hg) = 5 mg/l. Meng 1 ml van de fenylkwikacetaatoplossing (4.2) met 1 I kaliumchloride-oplossing (4.3). 4.5 Oplossing van 2,3-butaanmonoxim (diacetylmonoxim) in water 1 ), p(c 4 H 7 N0 2 ) = 25 g/l. 4.6 Oplossing van thiosemicarbazide in water 2 ), p(ch 5 N 3 S) = 5 g/l. 4.7 Een mengsel van 1,5 g ijzer(lll)chloride, 30 ml orthofosforzuur (85 % m/m) en 45 ml gedemineraliseerd water. 4.8 Zwavelzuur, c(h 2 S0 4 ) = 3 mol/l. Verdun geconcentreerd zwavelzuur, c(h 2 S0 4 ) = 18 mol/l (Q = 1,84 g/ml), 1 : 5 (V/V) met water. Opmerking Giet hierbij de benodigde hoeveelheid geconcentreerd zwavelzuur voorzichtig uit in een vijfmaal grotere hoeveelheid water. 4.9 Standaardureumoplossing, c(ch 4 N 2 0) = 5,0 mmol/l. 4.10 Verdunde standaardureumoplossingen. Pipetteer in maatkolven van 100 ml, resp. 0,00; 1,00; 2,00; 4,00; 6,00; 8,00, 10,00 en 20,00 ml van de standaardureumoplossing (4.9). Vul aan metfenylkwikacetaat/kaliumchloride-oplossing (4.4) en meng. De zo verkregen oplossingen bevatten resp. 0,00; 0,05; 0,1 ; 0,2; 0,3; 0,4, 0,5 en 1,0 mmol/l aan ureum. 1) CAS-nr. (Chemical Abstracts Service Registry Number): 57-71-6. 2) CAS-nr. 79-19-6. NEN 5796
NEN 5796 - Biz. 2 5 Toestellen en hulpmiddelen Gebruikelijke laboratoriumhulpmiddelen en -toestellen, en in het bijzonder de volgende: 5.1 Spectrofotometer geschikt voor metingen bij een golflengte van 525 nm. 5.2 Schudwaterbad, instelbaar op een temperatuur van 35 C. 5.3 Zeef met maaswijdte van 2 mm. 5.4 Filtreerpapier, kwalitatief, fijn en langzaam filtrerend (aanduiding volgens NPR 6300). 5.5 Waterbad, temperatuur 100 C. 5.6 Droogstoof, instelbaar op een temperatuur van 105 C. 6 Monsterneming en monstervoorbehandeling Neem een representatief grondmonster en gebruik dit zo vers mogelijk. Ontdoe het grondmonster van grove delen, zeef zo mogelijk door de zeef (5.3) en homogeniseer het monster goed. Voorkom uitdroging gedurende deze handelingen. Bepaal daarna het watergehalte door wegen, drogen in de droogstoof (5.6) gedurende 16 h bij 105 C, en herweging van een deelmonster van ca. 10 g. 7 Werkwijze 7.1 Incubatie Weeg in drievoud 6 à 7 g voorbehandelde grond (6) tot op 10 mg nauwkeurig in conische kolven van 100 ml en voeg 5 ml gedemineraliseerd water toe, alsmede 1,00 ml ureumoplossing (4.1). Weeg op dezelfde wijze voor de blancobepalingen in drievoud 6 à 7 g grond af en voeg alleen 5 ml gedemineraliseerd water toe. Sluit de kolven af en plaats deze gedurende 5 h in een schudwaterbad (5.2) bij een temperatuur van 35 C. Voeg vervolgens aan iedere kolf 50 ml van de fenylkwikacetaat/-kaliumchloride-oplossing (4.4) toe en aan de blanco's tevens 1,00 ml ureumoplossing (4.1). Schud de monsters gedurende 10 min en filtreer vervolgens door fijn filtreerpapier (5.4). Pipetteer van de verkregen heldere filtraten 5,00 ml in maatkolven van 25 ml. De filtraten zijn, mits bewaard bij 4 C C, ten hoogste 24 h houdbaar alvorens de fotometrische bepaling volgens 7.2 uit te voeren. 7.2 Analyse Opmerking Indien na 5 h incubatie meer dan 50 % van het ureum is omgezet, moet de bepaling worden herhaald met minder analysemonster en/of een kortere incubatietijd. In dit geval wordt aanbevolen om de lineariteit van de reactie in de tijd te bepalen met behulp van een tijdreeks, die ten minste 5 meettijdstippen moet omvatten, en hieruit een juiste incubatietijd te bepalen. Indien de grond een lage urease-activiteit heeft (kleiner dan 0,1 mmol/(kg h), betrokken op droge grond) dient een langere incubatietijd te worden aangehouden of een groter analysemonster in bewerking te worden genomen. Zie NPR 6400 voor algemene richtlijnen voor het uitvoeren van fotometrische bepalingen. Bereid een kleurreagens door mengen van 150 ml zwavelzuur (4.8), 150 ml gedemineraliseerd water, 10 ml 2,3-butaanmonoximoplossing (4.5), 10 ml thiosemicarbazide-oplossing (4.6) en 0,15 ml van het ijzer(lll)chloride/orthofosforzuur/watermengsel (4.7). Deze oplossing dient voor iedere bepaling vers te worden bereid. Pipetteer 15 ml van het kleurreagens bij de heldere filtraten (of kalibratie-oplossingen (zie 7.3)) in de maatkolven. Zet de kolven vervolgens gedurende 20 min in het waterbad (5.5) bij een temperatuur van 100 C. Na afkoelen in koud water dienen de maatkolven tot 25 ml te worden aangevuld met water. Bepaal vervolgens binnen 1 h de extinctie tegen de 0,00 mmol/l oplossing van de reeks verdunde standaardureumoplossingen (4.10) als referentie in een spectrofotometer (5.1) bij een golflengte van 525 nm. Opmerkingen 1. Deze bepaling kan ook in een doorstroomanalysesysteem worden uitgevoerd, zie hiervoor [1]. 2. Indien uit de voorgeschiedenis of chemische analyse van.de gebruikte grond aanwezigheid van koper wo 2 rdt vermoed, dient rekening te worden gehouden met storing van de fotometrische bepaling door Cu + -ionen. Deze storing kan worden opgeheven door toevoeging van 0,5 ml van een 5 % {m/m) oplossing van 8- hydroxychinoline in 96 % {V/V) ethanol aan de kolven, voor het verblijf in het schudbad en het filtreren zoals beschreven in 7.1. In dat geval moet aan de kalibratie-oplossingen (7.3) 0,045 ml van deze oplossing worden toegevoegd.
NEN 5796 - Biz. 3 7.3 Kalibratie Bereid bij iedere meetserie een reeks kalibratie-oplossingen. Pipetteer daartoe 5 ml van de verdunde standaardureumoplossingen (4.10) in maatkolven van 25 ml. Behandel deze oplossingen volgens 7.2. Bepaal de extinctie bij een golflengte van 525 nm tegen de 0,00 mmol/l oplossing van de reeks verdunde standaardureumoplossingen (4.10) als referentie en stel een kalibratiecurve op. 8 Berekening Bepaal met behulp van de kalibratiecurve de ureumconcentraties in ieder van de met ureum geïncubeerde monsters en in de blanco's. Bereken de urease-activiteit volgens: ^ (c b - c) x V t x m waarin: A is de urease-activiteit, in mmol/(kg h), betrokken op droge grond; с is de ureumconcentratie in het filtraat van het met ureum geïncubeerde monster, in mmol/l; c b is de gemiddelde ureumconcentratie in het filtraat van de blanco's, in mmol/l; V is het volume water plus ureumoplossing waarin de incubatie is uitgevoerd, in I (= 0,056 I) (de hoeveelheid water in het grondmonster wordt dus verwaarloosd); f is de incubatietijd (zie 7.1), in h (= 5 h); m is de massa van de droge grand, in kg. Rapporteer als urease-activiteit het gemiddelde van drie bepalingen. 9 Verslag Vermeld in het verslag: a. de gegevens die noodzakelijk zijn voor de karakterisering van de onderzochte grond; b. de gevolgde methode door de vermelding: volgens NEN 5796; c. de gevonden urease-activiteit, in mmol/(kg h), betrokken op droge grond; d. de eventuele bijzonderheden tijdens de bepaling waargenomen; e. alle niet in de norm voorgeschreven handelingen die het resultaat kunnen hebben beïnvloed. 10 Literatuur [1] Marsh, W.H., B. Fingerhut, H. Miller, J. Clin. Chem. Vol. II, No. 6 (1965). [2] Burns, R.G. (ed.). Soil enzymes, Academic Press (London), 1978, pp 149-198. Determination of urease activity
NEN 5796 - Biz. 4 (blanco)
Bestelformulier Stuur naar: NEN Standards Products & Services t.a.v. afdeling Klantenservice Antwoordnummer 10214 2600 WB Delft NEN Standards Products & Services Postbus 5059 2600 GB Delft Vlinderweg 6 2623 AX Delft Ja, ik bestel ex. NEN 5796:1989 nl Bodem - Bepaling van de urease-activiteit 24.00 T (015) 2 690 390 F (015) 2 690 271 www.nen.nl/normshop Wilt u deze norm in PDF-formaat? Deze bestelt u eenvoudig via www.nen.nl/normshop Gratis e-mailnieuwsbrieven Wilt u op de hoogte blijven van de laatste ontwikkelingen op het gebied van normen, normalisatie en regelgeving? Neem dan een gratis abonnement op een van onze e-mailnieuwsbrieven. www.nen.nl/nieuwsbrieven Gegevens Bedrijf / Instelling T.a.v. O M O V E-mail Klantnummer NEN Uw ordernummer BTW nummer Postbus / Adres Postcode Plaats Telefoon Fax Factuuradres (indien dit afwijkt van bovenstaand adres) Postbus / Adres Postcode Plaats Datum Handtekening Retourneren Fax: 015 2 690 271 E-mail: klantenservice@nen.nl Post: NEN Standards Products & Services, t.a.v. afdeling Klantenservice Antwoordnummer 10214, 2600 WB Delft (geen postzegel nodig). Voorwaarden De prijzen zijn geldig tot 31 december 2018, tenzij anders aangegeven. Alle prijzen zijn excl. btw, verzend- en handelingskosten en onder voorbehoud bij o.m. ISO- en IEC-normen. Bestelt u via de normshop een pdf, dan betaalt u geen handeling en verzendkosten. Meer informatie: telefoon 015 2 690 391, dagelijks van 8.30 tot 17.00 uur. Wijzigingen en typefouten in teksten en prijsinformatie voorbehouden. U kunt onze algemene voorwaarden terugvinden op: www.nen.nl/leveringsvoorwaarden. LEREN, WERKEN EN GROEIEN MET NEN preview - 2018