UvA-DARE (Digital Academic Repository) On the unusual heme group of myeloperoxidase Kooter, I.M. Link to publication Citation for published version (APA): Kooter, I. M. (1999). On the unusual heme group of myeloperoxidase. General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: https://uba.uva.nl/en/contact, or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (http://dare.uva.nl) Download date: 16 Sep 2019
Samenvatting De ongebruikelijke heem groep van myeloperoxidase Dit proefschrift, in het Nederlands 'De ongebruikelijke heem groep van myeloperoxidase' genaamd, beschrijft het onderzoek naar de structuur en functie van de heem groep, aanwezig in humaan myeloperoxidase. Dit onderzoek is uitgevoerd in het kader van een promotiestudie verricht bij de afdeling Biokatalyse van de Faculteit der Scheikunde aan de Universiteit van Amsterdam. Het onderzoek aan myeloperoxidase is binnen het E.C. Slater Instituut in 1973 door dr R. Wever geïnitieerd toen metingen uitwezen dat witte bloedcellen een zeer reactief en destructieve vorm van zuurstof, het superoxide anion radicaal (0 2 "'), produceerden. Deze zogenaamde granulocyten waren interessant omdat ze groen in plaats van wit waren. De eerste metingen aan complete cellen lieten een signaal zien, wat afkomstig was van een heembevattend enzym: myeloperoxidase. Het is nu bekend dat dit enzym in grote hoeveelheden aanwezig is in polymorfeonucleaire neutrofielen (een type granulocyten), en een functie heeft in het afweermechanisme tegen micro-organismen in ons lichaam. Daar het enzym in staat is om hypochloriet (bleekwater) te produceren en het afwijkende eigenschappen vertoont (bijvoorbeeld, rood verschoven banden in optische absorptie spectra, gecompliceerde resonantie Raman spectra, en omgekeerde band patronen in magnetisch circulair dichroisme spectra), wordt er door veel onderzoeksgroepen al lange tijd onderzoek aan gedaan. De bijzondere eigenschappen van myeloperoxidase worden toegekend aan de in het enzym aanwezige heem groep, waarvan de structuur lange tijd onbekend was. De meeste heem bevattende eiwitten bevatten een niet-covalent gebonden heem groep, zoals in het geval van hemoglobine. Myeloperoxidase maakt deel uit van de homologe dierlijke peroxidase familie, evenals eosinofiel peroxidase, lactoperoxidase en thyroid peroxidase. De structuur van myeloperoxidase is met behulp van X-ray kristallografie opgehelderd. Uit deze structuur is duidelijk dat drie aminozuur residuen van het eiwit zich zeer dicht bij de rand van de heem groep bevinden: een aspartaat op positie 94 (Asp94), een glutamaat op positie 242 (Glu242) en een methionine op positie 243 (Met243). In de loop van dit promotie onderzoek is er door andere onderzoekers een model voorgesteld waarin de Asp94 en het Glu242 residuen beide een covalente ester binding vormen met de heem groep in dierlijke peroxidasen. Myeloperoxidase onderscheidt zich van de andere dierlijke peroxidasen in het feit dat de heem groep van dit enzym een extra binding met het eiwit zou kunnen vormen, een zogenaamde sulfonium ion binding van het Met243 residu met het eiwit. Deze binding tussen de heem groep en het eiwit zou verantwoordelijk zijn voor de unieke eigenschappen van het enzym myeloperoxidase. Hoofdstuk 1. de algemene inleiding, geeft achtergrond informatie over de onderwerpen die in dit proefschrift worden behandeld. Inleidend worden heem bevattende eiwitten behandeld, en enkele structuren van heem groepen zoals deze in de natuur voorkomen. De biosynthese route van heem b, de meest voorkomende heem groep (aanwezig in o.a. hemoglobine) wordt eveneens behandeld. Heem bevattende peroxidases komen veelvuldig voor in de natuur. Het heem bevattende katalytisch centrum van de superfamilie van plant, schimmel en bacteriële peroxidasen wordt behandeld. Vervolgens worden de algemene aspecten, de moleculaire en spectroscopische eigenschappen van de dierlijke peroxidase familie besproken, welke een aparte superfamilie vormen. Ook wordt de kristal 131
structuur, het heem bevattende katalytisch centrum en de heem structuur in myeloperoxidase en andere dierlijke peroxidasen besproken. Hoofdstuk 2 beschrijft hoe met behulp van Fourier transform infrarood spectroscopie het eerste bewijs is geleverd dat de heem groep in myeloperoxidase (net als in de dierlijke peroxidasen, lactoperoxidase en eosinofiel peroxidase) covalent gebonden zit aan het eiwit via twee zogenaamde ester bindingen. Verschil spectroscopie stelde ons in staat om absorptie banden waar te nemen die gevoelig zijn voor de oxidatie toestand van het enzym. Spectra van gereduceerd en geoxideerd enzym werden met elkaar vergeleken. Twee groepen van absorpties kunnen worden waargenomen afkomstig van respectievelijk de C=0 en de C-Ogroep. Negatieve banden, corresponderend met de geoxideerde enzym toestand (Fe 1+ -heem) werden gevonden bij 1756, 1728 cm" 1 (C=0 groep), en 1164, 1152.5 cm ' (C-O- groep), en positieve banden, corresponderend met de gereduceerde enzym (Fe 2+ -heem) toestand bij 1742, 1723 cm ' (C=0 groep), en 1170, 1159 cm" 1 (C-O- groep). Plaats gerichte mutagenese van myeloperoxidase stelde ons in staat deze banden specifiek toe te kennen aan de Glu242 en Asp94 residuen van het eiwit. Mutatie van Glu242 deed één stel banden verdwijnen, terwijl mutatie van Asp94 resulteerde in het verlies van het andere stel. Verwijdering van de voorgestelde sulfonium ion binding door mutatie van het Met243 residu, toevoeging van de halides fluoride en chloride, als ook incubatie in zuur had voornamelijk een effect op de positie van de banden van de Asp94 ester binding. Hoofdstuk 3 geeft een spectroscopische en enzymatische karakterisering van de Asp94 en Glu242 mutanten van myeloperoxidase. Mutatie van het residu Asp94, en dus verbreking van de ester binding met de heem groep (Hoofdstuk 2) leidt tot twee vormen. De eerste vorm heeft spectroscopische eigenschappen die gelijk zijn aan die van het natieve myeloperoxidase. De tweede vorm heeft spectroscopische eigenschappen gelijk aan die van een Met243Gln mutant (een mutant waarin het Met243 residu dat betrokken is bij de sulfonium ion binding van het enzym vervangen is door een glutamine (Gin), Hoofdstuk 4). Er wordt daarom geconcludeerd dat deze vorm naast de Asp94 ester verbinding ook de voorgestelde sulfonium ion binding mist. De Asp94Asn mutant heeft nog steeds 30% rest activiteit ten opzichte van het natieve myeloperoxidase in de chlorerings reactie (vorming hypochloriet, bleekwater). Wanneer het Glu242 residu gemuteerd wordt tot Gin blijft de sulfonium ion binding intact. Glu242 zorgt echter samen met het ernaast liggende Met243 residu voor de lage symmetrie in de heem groep, zoals vastgesteld via resonantie Raman spectroscopie. Mutatie van een van de residuen leidt waarschijnlijk tot opheffing van de gebogen heem structuur en heeft een groep met een hogere mate van symmetrie tot gevolg. Voor de Glu242Gln mutant wordt er 8% rest activiteit gevonden in de chlorerings reactie. Tevens vertoont het low-spin EPR spectrum van de Glu242Gln mutant een toename in g- strain, wijzend op meer flexibiliteit van de heem ijzer en microheterogeniteit van de eiwit structuur. Hoofdstuk 4 beschrijft het effect van mutatie van Met243, het residu dat betrokken zou zijn in een sulfonium ion binding tussen het eiwit en de heem groep. In deze mutant is de zogenaamde Soret band in het optische absorptie spectrum verschoven van 428 naar 411 nm in de geoxideerde vorm, en van 474 naar 445 nm in de gereduceerde vorm van het enzym. Het alkalische pyridine hemochroom spectrum, dat vaak gebruikt wordt als indicator voor een aanwezige heem groep, is duidelijk veranderd en is nu vrijwel gelijk aan dat voor heem b of protoheem IX. Het resonantie Raman spectrum van deze mutant is aanzienlijk veranderd ten opzichte van dat van het natieve enzym, en wijst op een ijzer porphyrine-achtige 132
chromofoor structuur. Het is opmerkelijk dat deze mutant niet meer in staat is om chloride te oxideren tot hypochloriet. We concluderen dat het Met243 residu verantwoordelijk is voor de speciale eigenschappen van myeloperoxidase en dat een mutatie van dit residu resulteert in een enzym met eigenschappen gelijkend op het dierlijke peroxidase, lactoperoxidase. In Hoofdstuk 5 wordt de voorgestelde sulfonium ion binding verder onderzocht. Het Met243 residu is gemuteerd tot een Thr, een Gin en een Val, de residuen die op deze positie in respectievelijk eosinofiel peroxidase, lactoperoxidase en thyroid peroxidase voorkomen, alsmede in een Cys. De Soret band in de optische absorptie spectra van de geoxideerde mutanten ligt bij ongeveer 411 nm, een waarde die ook voor de andere dierlijke peroxidasen (eosinofiel peroxidase, lactoperoxidase en thyroidperoxidase) wordt gevonden. De chemische structuur van de heem groep is veranderd door de mutatie, wat blijkt uit het alkalische pyridine hemochroom spectrum. Tevens vertonen alle Met243 mutanten meer g-strain in hun low-spin EPR spectra, net als de Glu242Gln mutant (Hoofdstuk 3). Dit impliceert een verhoogde flexibiliteit van de heem ijzer en microheterogeniteit van de eiwit structuur. De resonantie Raman spectra van de mutanten zijn opvallend minder gecompliceerd dan die van het natieve enzym, en vormen een aanwijzing voor een ijzer porphyrine-achtige groep als prosthetische groep van het enzym. Verrassend is dat de Met243 mutanten aanzienlijk minder affiniteit voor chloride vertonen, de dissociatie constante (K d ) is 100-voudig verhoogd. Tevens hebben alle Met243 mutanten hun chlorerings activiteit verloren, behalve de Met243Thr mutant welke nog 15% rest activiteit heeft. In dit opzicht is het opmerkelijk dat eosinofiel peroxidase, dat ook een Thr residu heeft op deze positie ook een mate van chlorerings activiteit heeft. Met behulp van verschil FTIR spectroscopie was het mogelijk om specifiek de "CD 3 -gelabelde methionyl sulfonium ion verbinding te detecteren. We concluderen dat de sulfonium ion verbinding twee verschillende functies heeft. Allereerst fungeert het via zijn positieve lading als een elektron zuigende groep, en ten tweede zorgt het samen met het ernaast gelegen Glu242 residu voor een verstoring van de symmetrie in de heem groep. In Hoofdstuk 6 zijn de elektronische en magnetische eigenschappen onderzocht van de heem groepen in de geoxideerde en gereduceerde toestanden van het natieve myeloperoxidase en de Met243Thr mutant. Dit is onderzocht met variabele temperatuur (273 K-1.6 K) magnetische circulair dichroisme spectroscopie, samen met parallelle elektron paramagnetische resonantie, en optische absorptie studies. De spin toestanden van de geoxideerde en gereduceerde monsters, bij kamer en vloeibaar helium temperatuur, konden worden toegekend. De abnormale eigenschappen van myeloperoxidase die worden waargenomen met magnetische circulair dichroisme spectroscopie (bijvoorbeeld de rood verschoven en tegengestelde banden in de high-spin Fe 3+ en low-spin Fe 2+ toestanden) zijn het directe gevolg van de elektron zuigende sulfonium ion binding waarbij het Met243 residu betrokken is. 133
134