RAPPORT RINGONDERZOEK ANTIBIOTICA- SCREENING IN MELK

Instituut voor Landbouw en Visserijonderzoek Wetenschappelijke instelling Landbouw en Visserij Technologie & Voeding Brusselsesteenweg 370, 9090 Melle, België tel. 32 9 272 30 00 fax 32 9 272 30 74 T&VBU@ilvo.vlaanderen.be RAPPORT RINGONDERZOEK ANTIBIOTICA SCREENING IN MELK MICROBIOLOGISCHE TESTEN Delvotest SPNT, Delvotest T & CMT Milk Test Delvotest T (MINI) met flexibele incubatieduur & Eclipse Farm 3G (in validatie) SNELTESTEN Charm MRL/MRLBL3/MRLBL1 Test, SNAP BetaLactam ST, ßetas.t.a.r. (Combo (v1.0)) & Betaxpress Milk Charm Quad Test (in validatie) 23 OKTOBER 2014 S. Ooghe & W. Reybroeck ILVOT&V Melle

Inleiding In het kader van de autocontrole door de zuivelbedrijven van de gecollecteerde melk op antibiotica werd op 23 oktober 2014 een ringonderzoek georganiseerd door het ILVOT&V betreffende de microbiologische testen Delvotest SPNT, Delvotest T, CMT Milk Test & Eclipse Farm 3G en de erkende sneltesten Charm MRL Test, Charm MRLBL3 Test, Charm MRLBL1 Test, SNAP ßlactam ST, ßetas.t.a.r Combo (v1.0) & Betaxpress Milk en de ßetas.t.a.r.. In het kader van een validatiestudie werd door het ILVOT&V ook deelgenomen met de microbiologische testen Delvotest T (MINI) op flexibele incubatieduur (versie in ampullen, DSM Food Specialities bv, NL) & de Eclipse Farm 3G (Zeulab S.L., ES), alsook met een sneltest speciaal ontwikkeld voor de controle voor export van melk naar de Russische Federatie, de Charm Quad Test (Charm Sciences Inc., USA). De zuivelbedrijven werden schriftelijk uitgenodigd om deel te nemen aan dit ringonderzoek. Volgende labo s, gerangschikt in alfabetische volgorde, hebben deelgenomen: Beauvoords Bakhuis Belgomilk Moorslede Danone Danone Hombourg Récolte Fabrelac bvba FrieslandCampina Belgium NV, buitendienst FrieslandCampina Belgium NV, site Aalter FrieslandCampina Belgium NV, site Sleidinge ILVOT&V Incopack NV Inex NV Inza MILCOBEL Kaasmakerij Passendale Fromunion NV Laboratorium Douane & Accijnzen Laiterie de Walhorn La Concorde LDA COOP Limelco NV MIK NV Pur Natur MILCOBEL CVBA (Kallo) MILCOBEL Langemark Olympia Solarec SA 2

1 Verloop ringonderzoek en identificatie monsters Op het ILVOT&V werden twee sets van 8 blind gecodeerde ringmonsters aangemaakt: een eerste set voor de microbiologische testen (codes M1 t.e.m. M 160, overeenkomstig de universele codes A t.e.m. H) en een tweede set voor de sneltesten (codes S1 t.e.m. S192), overeenkomstig de universele codes I t.e.m. P). Voor de codering van de individuele M en Smonsters wordt verwezen naar Bijlage 1. Bij de keuze van de verbindingen werd rekening gehouden met de actieve stoffen van diergeneesmiddelen die in België geregistreerd zijn [1]; bij de keuze van de concentratie werd, in de mate van het mogelijke, rekening gehouden met de MRLwetgeving [2]. De identificatie van de ringmonsters wordt hieronder in detail weergegeven. Identificatie ringmonsters microbiologische testen Ringmonster Gedopeerd antibioticum of Concentratie MRL chemotherapeuticum (µg/kg of ppb) (µg/kg of ppb) A Sulfadiazine 100 100 B Cloxacilline 30 30 C Clavulaanzuur 1000 200 D Cefalexine 100 100 E Benzylpenicilline 3 4 F Cefalonium 20 20 G Blanco H Chloortetracycline 100 100 Identificatie ringmonsters sneltesten Ringmonster Gedopeerd antibioticum of chemotherapeuticum Concentratie (µg/kg of ppb) MRL (µg/kg of ppb) I Benzylpenicilline 3 4 J Cloxacilline 30 30 K Cefalexine 100 100 L Streptomycine chloortetracycline 200 resp. 10 200 resp. 100 M Benzylpenicilline 4 4 N Clavulaanzuur 1000 200 O Cefalonium 20 20 P Blanco 3

4 De ringmonsters werden op 21 oktober bereid en getest op het ILVOT&V en vervolgens op droogijs verzonden via DHL. De aankomst van de stalen was voorzien op 22 oktober (dag 1 service, levering vóór 12u). Aan de bedrijven werd gevraagd om de ringmonsters bij ontvangst te bewaren in de koelkast en om de analyses uit te voeren op 23 oktober. Zuivelbedrijven 4, 19, 20 & 22 voerden de analyses niet uit op de afgesproken datum. Bij zuivelbedrijf 4 ging het ringonderzoek tweemaal verloren, éénmaal op 22 oktober en éénmaal op 4 november. Bijgevolg analyseerde zuivelbedrijf 4 de ringmonsters pas op 18 november 2014. Bij de derde verzending werd op het ILVOT&V een fout gemaakt door tweemaal de Sreeks te versturen. Vermits er echter een overlap is van 6 ringmonsters in beide reeksen, was het mogelijk om voor bedrijf 4 zes resultaten van de Mreeks te verwerken (geen resultaten voor ringmonsters A en H, zie verder). Zuivelbedrijven 14 & 22 rapporteerden hun resultaten na de vooropgestelde datum. Zuivelbedrijven 1, 2, 3, 5, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17 & 23 rapporteerden de resultaten van hun controlemonsters; zuivelbedrijf 22 rapporteerde de resultaten van zijn controlemonsters voor de microbiologische test; zuivelbedrijven 4, 6, 11, 13, 18, 19, 20 en 21 rapporteerden geen resultaten van controlemonsters hetgeen erop wijst dat 35% van de zuivelbedrijven nog steeds geen gebruik maakt van controlemonsters om de goede uitvoering van hun analyse na te gaan.

5 2 Delvotest SPNT & Delvotest T 2.1 Inleiding Drie zuivelbedrijven namen deel met de Delvotest SP (MINI)NT, de versie in ampullen; één bedrijf nam deel met de Delvotest SP 5PACKNT. Tien zuivelbedrijven namen deel met de Delvotest T, waarvan negen bedrijven met de Delvotest T (MINI) (versie in ampullen) en één met de Delvotest T 5 Pack (versie in microtiterplaten). Aan de deelnemers werd gevraagd om het type test en het type incubator (blockheater (BH), waterbad (WB) of oven (O)) aan te duiden en het lotnummer, de vervaldatum, de incubatieduur en temperatuur te noteren. De temperatuur aanbevolen door het ILVOT&V voor incubatie van de ampullen en de microtiterplaten van de Delvotest bedraagt 64±0,5 C; door DSM Food Specialties wordt een incubatietemperatuur van 64±2 C toegestaan. In de bijsluiters van DSM Food Specialties [3 en 4] wordt aanbevolen om de Delvotest SPNT ampullen en de Delvotest platen af te lezen op 3 uur of op controletijd en om de Delvotest T ampullen af te lezen op 3 uur en 15 minuten of op controletijd. Bij aflezing op controletijd wordt door DSM aanbevolen om gebruik te maken van een negatief controlemonster en de incubatie te beëindigen wanneer dit negatief controlemonster geel kleurt. Door het ILVOT&V wordt een incubatieduur van 3 uur aanbevolen voor de ampullen van de Delvotest SPNT en de microtiterplaten van de Delvotest T en een aflezing op controletijd van de ampullen van de Delvotest T daar er loten op de markt zijn die vroeger omslaan dan na 3 uur en 15 minuten incubatie. Ook de platen van de Delvotest SPNT worden op het ILVOT&V afgelezen op controletijd. Nr. labo 2.2 Resultaten Visuele aflezing Instrumentele aflezing: Zwaarde interpretatie Lotnummer A B C D E F G H A B C D E F G H vervaldatum (type incubator: BH/WB/O) Delvotest SP (MINI)NT ILVO T&V 2,84 () 12,55 () 14,77 () 2,68 () 13,42 () 12,47 () 14,57 () 13,13 () 14B13/1113/02/15 (BH, 3u) 1 14F18/8618/06/15 (O, 3u) 4 14A08/8508/01/15 (?,?) 18 14E20A8520/05/15 (BH,?) Delvotest SP 5 PACKNT ILVO T&V 4,62 13,41 5,06 12,08 14,56 11,98 7,58 5,80 14H01/2101/08/15 (WB, 2u30min)

6 Nr. labo Visuele aflezing Instrumentele aflezing: Zwaarde interpretatie Lotnummer A B C D E F G H A B C D E F G H 14,32 13,10 () 4,64 5,17 () 11,44 11,07 () 14,04 12,00 () 12,78 12,58 () 7,60 8,58 () 4,10 0,78 () vervaldatum (type incubator: BH/WB/O) 14H01/2101/08/15 (WB, 2u30min) 14C06/3106/03/15 (BH, 3u00min) 2 14F30/3130/06/15 (BH, 3u15min) 6?????? 11 14F30/3130/06/15 (BH, 3u15min) 14 14D29A3129/04/15 (BH, 3u15min) 17 14F30/3130/06/15 (BH, 3u15min, 65 C) 19 14D29/3129/04/15 (BH, 3u02min, 63,4 C) 20 13L13/3113/12/14 (BH, 3u, 64(,7) C) 21 14D14/31? (WB, 3u) 22 14G01/3101/07/15 (BH, 3u05min) 3 6,24 Delvotest T (MINI) ILVO 8,19 T&V () Delvotest T 5 Pack ILVO * 8,30 11,72 3,72 12,30 13,88 13,65 8,44 0,30 14H28A3028/08/15 T&V (WB, 2u55min) 16 14G24A30? (WB, 3u00min) De door het ILVOT&V vooropgestelde cutoff Zwaarde voor de interpretatie van de Delvotest SP 5 PACK NT en de Delvotest T 5 Pack bedraagt 3,00. Melkmonsters die bij instrumentele aflezing een numerieke waarde geven 3,00 worden als positief beschouwd. *: randgeval

2.3 Bespreking Ringmonster A was gedopeerd met 100 ppb sulfadiazine (testgevoeligheid Delvotest SP 5 PACKNT: < 50 ppb resp. Delvotest T 5 Pack op flexibele incubatieduur: 35 ppb validatiestudies ILVOT&V). Labo s 1 & 18 analyseerden dit staal als negatief met de ampullenversie van de Delvotest SPNT; ILVOT&V analyseerde dit staal als positief met de Delvotest SP(MINI)NT. Uit de Zwaarde bekomen door het ILVOT&V (2,84) blijkt duidelijk dat dit staal een randgeval betreft. Vermits door DSM slechts een testgevoeligheid van 170 ppb geclaimd wordt voor sulfadiazine met de Delvotest SPNT ampullen bij een vaste afleestijd van 3 uur [5], worden de resultaten bekomen door labo s 1 & 18 niet beschouwd als valsnegatieve resultaten. Met de Delvotest SP 5PACKNT werd dit staal als positief gerapporteerd door het ILVOT&V en door labo 3. Merk op dat voor de microtiterplaten een incubatieduur van 2 uur en 30 minuten gehanteerd wordt. Met de Delvotest T (MINI) werd dit staal door labo s 6 en 17 als negatief geanalyseerd en door de overige laboratoria als positief. Uit de Zwaarde bekomen door het ILVOT&V (8,19) blijkt dat dit staal geen randgeval betreft. Vermits ook door de kitfabrikant voor sulfadiazine een testgevoeligheid van 40 ppb geclaimd wordt met de Delvotest T ampullen op controletijd [6], worden de negatieve resultaten van labo s 6 en 17 beschouwd als valsnegatieve resultaten. De (te) lange incubatie van de ampullen door labo 17 en de afwijkende incubatietemperatuur hebben zeker bijgedragen tot dit valsnegatieve resultaat. Met de Delvotest T 5 Pack werd dit staal als positief gerapporteerd door het ILVOT&V en door labo 16. Ringmonster B was gedopeerd met 30 ppb cloxacilline (testgevoeligheid Delvotest SP 5 PACKNT: 15 ppb resp. Delvotest T 5 Pack op flexibele incubatieduur: 8 ppb validatiestudies ILVOT&V) en werd door alle laboratoria als positief bevonden met beide Delvotesten. Ringmonster C was rauwe melk gedopeerd met 1000 ppb clavulaanzuur (testgevoeligheid Delvotest T 5 Pack op flexibele incubatieduur: 900 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit staal werd door alle laboratoria als (randgeval) negatief gerapporteerd met beide Delvotesten. Merk op dat de testgevoeligheid die tijdens de validatiestudie van het ILVOT&V voor clavulaanzuur behaald werd met de Delvotest T 5 Pack op flexibele incubatieduur niet kon bevestigd worden in dit ringonderzoek. Ringmonster D was rauwe melk gedopeerd met 100 ppb cefalexine (testgevoeligheid Delvotest SP 5 PACKNT: 50 ppb resp. Delvotest T 5 Pack op flexibele incubatieduur: 25 ppb validatiestudies ILVOT&V). Dit staal werd door alle laboratoria unaniem als positief geanalyseerd met beide Delvotesten. Ringmonster E was gedopeerd met 3 ppb benzylpenicilline (testgevoeligheid Delvotest SP 5 PACKNT: 2 ppb resp. Delvotest T 5 Pack op flexibele incubatieduur: 1 ppb validatiestudies ILVOT&V). Dit staal werd unaniem door alle laboratoria als positief gerapporteerd met beide Delvotesten. Ringmonster F was gedopeerd met 20 ppb cefalonium (testgevoeligheid Delvotest SP 5 PACKNT: 10 ppb resp. Delvotest T 5 Pack op flexibele incubatieduur: 5 ppb validatiestudies ILVOT&V). Dit staal werd unaniem door alle laboratoria als positief gerapporteerd met beide Delvotesten. Ringmonster G was remstofvrije melk. Dit staal werd door alle laboratoria unaniem als negatief geanalyseerd met beide Delvotesten. M.a.w. er zijn geen valspositieve resultaten voor dit ringmonster. Ringmonster H was gedopeerd met 100 ppb chloortetracycline (testgevoeligheid Delvotest SP 5 PACKNT: > 375 ppb resp. Delvotest T 5 Pack op flexibele incubatieduur: 80 ppb validatiestudies ILVOT&V). 7

8 Dit staal werd door alle laboratoria als negatief gerapporteerd met de Delvotest SPNT. Met de Delvotest T (MINI), de verbeterde versie van de Delvotest voor de opsporing van tetracyclines, werd dit staal door labo s 2, 6, 11, 14, 17, 19, 20 en 21 als negatief geanalyseerd en door het ILVOT&V en door labo 22 als positief. Met de Delvotest T 5 Pack werd dit staal als positief gerapporteerd door het ILVOT&V en als negatief door labo 16. Uit de Zwaarden bekomen door het ILVOT&V (0,78 resp. 0,30) blijkt dat dit staal een randgeval betreft. Vermits door de kitfabrikant voor chloortetracycline slechts een testgevoeligheid van 150 ppb resp. 152 ppb geclaimd wordt met de Delvotest T ampullen resp. microtiterplaten op controletijd [6], worden de negatieve resultaten van labo s 2, 6, 11, 14, 16, 17, 19, 20 en 21 niet beschouwd als valsnegatieve resultaten. De (te) lange incubatie van de ampullen door labo s 2, 11, 14 en 17 heeft zeker bijgedragen tot deze negatieve resultaten. 2.4 Besluit De resultaten van de Delvotest SPNT zijn goed en in overeenstemming met wat men theoretisch (gebaseerd op de testgevoeligheden zoals destijds bekomen met de Delvotest SP 5 PACK NT) zou verwachten. Er zijn geen valspositieve resultaten met de Delvotest SPNT. Met uitzondering van de valsnegatieve resultaten bekomen door labo s 6 en 17 met de Delvotest T ampullen voor ringmonster A (100 ppb sulfadiazine) zijn de overige resultaten goed. De (te) lange incubatie van de ampullen door labo 17 heeft zeker bijgedragen tot dit valsnegatieve resultaat. Met uitzondering van de resultaten bekomen voor ringmonster C (1000 ppb clavulaanzuur) en ringmonster H (100 ppb chloortetracycline) zijn de resultaten in overeenstemming met de resultaten die destijds tijdens de validatiestudie van het ILVOT&V bekomen werden. Er zijn geen valspositieve resultaten met de Delvotest T. Met de Delvotest T wordt chloortetracycline niet langer steeds op MRL opgespoord ondanks het feit dat deze kit een verbeterde versie betreft voor de detectie van tetracyclines; met de Delvotest SPNT wordt chloortetracycline niet op MRL gedetecteerd. Ook sulfadiazine wordt niet langer altijd op MRL opgespoord met de Delvotest SPNT en de Delvotest T. Labo 6 nam opnieuw niet de moeite om het lotnummer & de vervaldatum van de gebruikte reagentia en de incubatieduur en temperatuur te vermelden. Labo 4 gaf geen details door van de gehanteerde incubatieomstandigheden en labo 18 rapporteerde geen incubatieduur. Opnieuw waren de (vals)negatieve resultaten bekomen met de Delvotest T (ampullen) te verwachten. Ondanks verwittiging produceert DSM Food Specialities nog steeds reagentia met een omslagtijd rond 3 uur met de aanbeveling om de ampullen op 3 uur en 15 minuten af te lezen. Gebruikers met snelle reagentia en een verlengde incubatieduur testen bijgevolg met een verminderde detectiecapaciteit met negatieve resultaten voor bepaalde verbindingen op MRL tot gevolg.

9 Als advies kan gegeven worden dat de Delvotest T ampullen steeds op controletijd dienen afgelezen te worden daar zowel trage als snelle loten op de markt zijn gebracht en er derhalve geen vaste afleestijd kan geadviseerd worden. Voor een aflezing op controletijd dient evenwel steeds gebruik gemaakt te worden van controlemonsters! Merk op dat zuivelbedrijven 4, 6, 11, 18, 19, 20 en 21 geen resultaten van controlemonsters rapporteerden waardoor aangenomen wordt dat deze bedrijven ook geen gebruik maken van controlemonsters! Vermits labo 17 een incubatieduur van 3 uur en 15 minuten hanteerde en daarbij wel gebruik maakte van controlemonsters is het valsnegatieve resultaat bekomen door dit labo dus deels te wijten aan het gebruik van een lot reagentia dat niet geschikt is voor aflezing op 3 uur en 15 minuten.

10 3 CMT Milk Test 3.1 Inleiding Vier zuivelbedrijven namen deel met de CMT Milk Test Single Test (versie in ampullen); één labo nam deel met de CMT Milk Test Microplate (versie in microtiterplaten). Aan de deelnemers met de CMT Milk Test werd gevraagd om de cupjes visueel alsook, indien mogelijk, met behulp van een vlakbedscanner af te lezen. Er werd hen eveneens gevraagd om het type test en het type incubator (blockheater (BH) of waterbad (WB)) aan te duiden en het lotnummer, de vervaldatum, de incubatieduur en temperatuur en, indien van toepassing, de softwareversie van de CScan te noteren. 3.2 Resultaten Nr. Visuele aflezing Instrumentele aflezing: CIFwaarde interpretatie Lotnr. vervaldatum (type incubator: BH of labo A B C D E F G H A B C D E F G H WB) CMT Milk Test Single Test (aanbevolen incubatieduur ILVOT&V: 3u) ILVO 6,8 10,0 0,9 9,8 9,6 10,0 0,7 0,3 4N09AU6C09/06/15 T&V () () () () () () () () (BH) 7 4,5 6,3 1,1 6,1 6,1 6,1 0,8 0,9 4K24A3624/05/15 (BH) 10 4,9 6,3 2,8 6,1 6,1 6,1 1,1 1,1 4K24AW6C24/05/15 (BH) 12 2,8 5,3 1,1 5,3 5,3 6,1 1,1 1,1 4K24AW6C24/05/15 (BH) 15 4,7 6,3 0,8 5,3 6,1 6,3 0,4 0,8 4A09CUGC? (BH) CMT Milk Test Microplate (aanbevolen incubatieduur ILVOT&V: 2u55min) ILVO 6,4 10,0 4,5 10,0 10,0 10,0 1,2 1,6 4S17A27K17/08/15 T&V (WB, 2u55minuten) 3 5,6 9,8 3,8 10,0 9,8 10,0 0,9 1,7 4S17A27K17/08/15 (WB, 3u)

11 De bedrijven die de resultaten van de instrumentele aflezing van de CMT Milk Test interpreteerden, hanteerden hierbij de cutoff CIFwaarde van 4,5, vastgelegd door het ILVOT&V voor microtiterplaten. Melkmonsters die bij instrumentele aflezing een numerieke waarde geven 4,5 worden als positief beschouwd. 3.3 Bespreking Ringmonster A was gedopeerd met 100 ppb sulfadiazine (testgevoeligheid Copan Milk Test Microplate: 70 ppb validatiestudie ILVOT&V). Met uitzondering van labo 12 analyseerden de overige laboratoria dit staal als positief met de CMT Milk Test. Vermits ook door de kitfabrikant voor sulfadiazine een testgevoeligheid van 50 ppb geclaimd bij een vaste incubatieduur van 3 uur [7], wordt het negatieve resultaat van labo 12 beschouwd als een valsnegatief resultaat. Uit de CIFwaarden blijkt evenwel dat dit staal een randgeval betreft. Ringmonster B was gedopeerde rauwe melk met 30 ppb cloxacilline (testgevoeligheid Copan Milk Test Microplate: 25 ppb validatiestudie ILVO T&V) en werd door alle laboratoria unaniem als positief bevonden. Ringmonster C was rauwe melk gedopeerd met 1000 ppb clavulaanzuur en werd door alle labo s als negatief geanalyseerd met de CMT Milk Test Single Test. Met de CMT Milk test Microplate werd dit staal als positief geanalyseerd door ILVOT&V en als negatief door labo 3. Uit de CIFwaarde bekomen door het ILVOT&V blijkt duidelijk dat dit staal een randgeval betreft. Ringmonster D was gedopeerd met 100 ppb cefalexine (testgevoeligheid Copan Milk Test Microplate: 60 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit ringmonster werd unaniem door alle labo s als positief geanalyseerd. Ringmonster E was gedopeerd met 3 ppb benzylpenicilline (testgevoeligheid Copan Milk Test Microplate: 2,5 ppb validatiestudie ILVOT&V) en werd door alle laboratoria unaniem als positief geanalyseerd. Ringmonster F was gedopeerd met 20 ppb cefalonium (testgevoeligheid Copan Milk Test Microplate: 10 ppb validatiestudie ILVOT&V) en werd unaniem door alle laboratoria als positief geanalyseerd. Ringmonster G was remstofvrije melk. Dit staal werd door alle laboratoria unaniem als negatief geanalyseerd. M.a.w. er zijn geen valspositieve resultaten voor dit ringmonster met de CMT Milk Test. Ringmonster H was gedopeerd met 100 ppb chloortetracycline (testgevoeligheid Copan Milk Test Microplate: 500 ppb validatiestudie ILVO T&V) en werd unaniem door alle labo s als negatief geanalyseerd. 3.4 Besluit Met uitzondering van het valsnegatieve resultaat bekomen door labo 12 met de CMT Milk Test voor ringmonster A (100 ppb sulfadiazine) zijn de overige resultaten goed en in overeenstemming met wat men theoretisch (gebaseerd op de testgevoeligheden zoals destijds behaald in de validatiestudie van het ILVOT&V) zou verwachten. Er zijn geen valspositieve resultaten met CMT Milk Test. Zoals verwacht wordt chloortetracyline niet op MRL gedetecteerd met de CMT Milk Test.

12 4 Microbiologische testen in validatie op het ILVOT&V 4.1 Delvotest T (MINI) (flexibele incubatieduur) 4.1.1 Inleiding In het kader van een validatiestudie werd door het ILVOT&V deelgenomen aan dit ringonderzoek met de ampullenversie van de Delvotest T op flexibele incubatieduur (DSM Food Specialties, NL). Nr. labo 4.1.2 Resultaten Visuele aflezing Instrumentele aflezing: Zwaarde interpretatie Lotnummer A B C D E F G H A B C D E F G H vervaldatum (type incubator: BH/WB/O) Delvotest T MINI (flexibele incubatieduur) ILVO T&V 8,42 12,45 5,40 11,25 11,39 11,61 8,10 2,47 14I22B3122/09/2015 (BH, 2u55min) De door het ILVOT&V vooropgestelde cutoff Zwaarde voor de interpretatie van de Delvotest T 5 Pack bedraagt 3,00. Melkmonsters die bij instrumentele aflezing een numerieke waarde geven 3,00 worden als positief beschouwd. 4.1.3 Bespreking Ringmonster A was rauwe melk gedopeerd met 100 ppb sulfadiazine (testgevoeligheid Delvotest T 5 Pack: 35 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit staal werd als positief geanalyseerd met de Delvotest T MINI. Ringmonster B was gedopeerd met 30 ppb cloxacilline (testgevoeligheid Delvotest T MINI: 8 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit staal werd positief bevonden met de Delvotest T MINI. Ringmonster C was gedopeerd met 1000 ppb clavulaanzuur (testgevoeligheid Delvotest T 5 Pack: 900 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit staal werd als negatief gerapporteerd met de Delvotest T MINI. Ringmonster D was gedopeerd met 100 ppb cefalexine (testgevoeligheid Delvotest T 5 Pack: 25 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit staal werd positief bevonden met de Delvotest T MINI. Ringmonster E was gedopeerd met 3 ppb benzylpenicilline (testgevoeligheid Delvotest T (MINI): 1 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit staal werd als positief gerapporteerd met de Delvotest T MINI. Ringmonster F was rauwe melk gedopeerd met 20 ppb cefalonium (testgevoeligheid Delvotest T 5 Pack: 5 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit staal werd als positief gerapporteerd met de Delvotest T MINI.

13 Ringmonster G was remstofvrije melk. Dit staal werd als negatief geanalyseerd met de Delvotest T MINI. M.a.w. er zijn geen valspositieve resultaten voor dit ringmonster. Ringmonster H was gedopeerd met 100 ppb chloortetracycline (testgevoeligheid Delvotest T 5 Pack: 80 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit staal werd als positief gerapporteerd met de Delvotest T MINI. 4.1.4 Besluit Algemeen werden met de Delvotest T (MINI) op flexibele incubatieduur goede resultaten bekomen en zijn de resultaten in overeenstemming met wat men theoretisch (gebaseerd op de testgevoeligheden zoals behaald in de validatiestudies van het ILVOT&V) zou verwachten. Er waren geen valspositieve resultaten met de Delvotest T (MINI) op flexibele incubatieduur.

14 4.2 Eclipse Farm 3G 4.2.1 Inleiding In het kader van een validatiestudie werd door het ILVOT&V aan dit ringonderzoek ook deelgenomen met de Eclipse Farm 3G met ereader (Zeulab S.L., ES). Bij de Eclipse Farm 3G worden de ampullen geïncubeerd in een kleine blockheater bij 65 C die terzelfdertijd fungeert als reader (flexibele incubatieduur van 2u15 à 2u45 bepaald door de ereader op basis van de omslag van het blanco controlemonster). Eén zuivelbedrijf nam deel met de Eclipse Farm 3G. Merk op dat dit bedrijf gebruik maakte van een ereader van de generatie met cutoff op 58. 4.2.2 Resultaten Visuele aflezing Instrumentele aflezing: readerwaarde interpretatie Lotnummer vervaldatum A B C D E F G H A B C D E F G H Type reader incubatieduur Nr. labo Eclipse Farm 3G ILVO T&V 80 8 * * 62 45 109 Melkmonsters die bij instrumentele aflezing een numerieke waarde geven cutoff worden als positief beschouwd. *: randgeval 61 31 52 87 95 34 75 99 53 35 4.2.3 Bespreking 69 59 1403270127/03/2015 ereader 163 min (RUN 1) cutoff: 56 1403270127/03/2015 ereader 150 min (RUN 2) cutoff: 56 1406200111220/06/2015 ereader 155 min cutoff: 58 Ringmonster A was gedopeerd met 100 ppb sulfadiazine (testgevoeligheid Eclipse Farm 3G: 100 ppb validatiestudie ILVOT&V) en werd door beide laboratoria als positief geanalyseerd. Ringmonster B was gedopeerd met 30 ppb cloxacilline (testgevoeligheid Eclipse Farm 3G: 40 ppb). Dit ringmonster, dat dus zowel een negatief als een positief resultaat kan geven, werd door het ILVOT&V als negatief geanalyseerd en door labo 8 als randgeval positief. Uit de readerwaarde van labo 8 blijkt duidelijk dat dit staal een randgeval betreft. Door Zeulab wordt voor cloxacilline een testgevoeligheid van 30 ppb geclaimd met de e reader [8]. Vermits deze gevoeligheid niet werd gehaald tijdens de validatiestudie van het ILVOT&V wordt dit negatieve resultaat niet beschouwd als een valsnegatief resultaat.

15 Ringmonster C was gedopeerd met 1000 ppb clavulaanzuur en werd door beide laboratoria als negatief geanalyseerd. Ringmonster D was rauwe melk gedopeerd met 100 ppb cefalexine (testgevoeligheid Eclipse Farm 3G: 100 ppb validatiestudie ILVOT&V) en werd door beide laboratoria als positief geanalyseerd. Ringmonster E was gedopeerd met 3 ppb benzylpenicilline (testgevoeligheid Eclipse Farm 3G: 4 ppb validatiestudie ILVOT&V) en kan dus zowel een negatief als een positief resultaat geven. Dit ringmonster werd door ILVOT&V als negatief geanalyseerd en door labo 8 als positief. Door Zeulab wordt voor benzylpenicilline een testgevoeligheid van 2 à 3 ppb geclaimd met de ereader [8]. Vermits de exacte gevoeligheid niet werd bepaald tijdens de validatiestudie van het ILVOT&V wordt dit negatieve resultaat niet beschouwd als een valsnegatief resultaat. Ringmonster F was rauwe melk gedopeerd met 20 ppb cefalonium (testgevoeligheid Eclipse Farm 3G: 20 ppb) en werd door beide laboratoria als positief geanalyseerd. Ringmonster G was remstofvrije melk. Dit staal werd door beide laboratoria als negatief geanalyseerd met de Eclipse Farm 3G. M.a.w. er zijn geen valspositieve resultaten voor dit ringmonster. Ringmonster H, gedopeerd met 100 ppb chloortetracycline (testgevoeligheid Eclipse Farm 3G: 200 ppb), werd door beide laboratoria als (randgeval) positief gerapporteerd. 4.2.4 Besluit Algemeen werden met de Eclipse Farm 3G goede resultaten bekomen en zijn de resultaten in overeenstemming met de testgevoeligheden die tijdens de validatiestudie op het ILVOT&V behaald werden. Cloxacilline en benzylpenicilline worden minder gevoelig opgespoord dan geclaimd wordt door Zeulab S.L.. Cloxacilline wordt niet altijd op MRL opgespoord met de Eclipse Farm 3G. Er waren geen valspositieve resultaten met de Eclipse Farm 3G.

16 5 Charm MRL Test, Charm MRLBL3 Test en Charm MRLBL1 Test 5.1 Inleiding Vijf bedrijven namen deel met de klassieke Charm MRL Test (8 minuten), één bedrijf nam deel met de Charm MRLBL3 Test (3 minuten) en één bedrijf nam deel met Charm MRLBL1 Test (1 minuut) (Charm Sciences Inc.). Qua uitvoering verschillen deze drie testen in een verschillende incubatieduur hetgeen ook resulteert in andere testgevoeligheden. Aan de deelnemers werd gevraagd om het type reader en de waarde van de reader op de bijhorende fiche te noteren, alsmede het lotnummer en de vervaldatum van de kit. Tevens werd aan de deelnemers gevraagd om de dipsticks visueel af te lezen. Labo 9 las de resultaten enkel visueel af. 5.2 Resultaten Nr. labo Visuele aflezing Instrumentele aflezing: numerieke waarde resultaat Lotnummer vervaldatum I J K L M N O P I J K L M N O P (Type reader) Charm MRL Test ILVOT&V 801 198 3209 1859 1751 1692 4766 1343 (B)085(192 H07) 02/2015 (Rosa Reader) 3 257 634 2619 1428 1596 889 4492 1915 (B)085(192 H07) 02/2015 (Rosa Reader) 4 1512 1018 1091 1930 1353 1578 3577 1446 085 03/2015 (?) 9 L085 01/2015 18 1236 581 2933 2259 2055 1277 3890 2198 085 31/10/2014 (EZ Reader) 23 1156 0204 3015 2333 1826 1203 3893 2378 085 02/2015 (Rosa Pearl Reader) Charm MRLBL3 Test ILVOT&V 1613 2643 788 2004 2788 314 3561 1150 (B)004(087C05EZ) 02/2015 (Rosa Pearl Reader) 2 600 1843 2238 2830 1623 1717 2843 2348 004 02/2015 (Rosa Pearl Reader)

17 Nr. labo Visuele aflezing Instrumentele aflezing: numerieke waarde resultaat Lotnummer vervaldatum I J K L M N O P I J K L M N O P (Type reader) Charm MRLBL1 Test ILVOT&V 1023 1718 978 656 868 555 2221 323 (B)005(161EE07EZ) 12/2014 (EZ Reader) 8 * 437 1039 1730 1461 591 904 2023 1505 (B)005(187II05EZ) 04/2015 (EZ Reader) De door de fabrikant ingestelde cutoff waarde bedraagt 0000 bij de Rosa (Pearl) Reader en de EZ Reader. Melkmonsters die bij instrumentele aflezing een numerieke waarde geven gelegen boven deze cutoff waarde (> 0000) worden als positief beschouwd. *: randgeval 5.3 Bespreking Ringmonster I was een rauw melkmonster gedopeerd met 3 ppb benzylpenicilline (testgevoeligheid Charm MRL Test en Charm MRLBL1 Test: 2 ppb resp. Charm MRLBL3 Test: 3 ppb validatiestudies ILVOT&V). Alle laboratoria analyseerden dit ringmonster als positief met de Charm MRL Test en de Charm MRLBL3 Test. Met de Charm MRLBL1 Test werd door het ILVOT&V een positief resultaat bekomen; labo 8 analyseerde dit staal als (randgeval) negatief. Vermits ook door Charm Sciences een testgevoeligheid van 2 à 3 ppb geclaimd wordt met de Charm MRLBL1 Test voor benzylpenicilline [9], wordt het negatieve resultaat van labo 8 beschouwd als een valsnegatief resultaat. Ringmonster J bevatte 30 ppb cloxacilline (testgevoeligheid Charm MRL(BL3) Test: 25 ppb resp. Charm MRLBL1 Test: 16 ppb validatiestudies ILVOT&V). Met de Charm MRL Test analyseerden het ILVOT&V en labo s 3, 4 en 18 dit ringmonster als positief; labo s 9 en 23 analyseerden dit staal als (randgeval) negatief. Vermits door Charm Sciences slechts een testgevoeligheid van 25 à 35 ppb geclaimd wordt met de Charm MRL Test voor cloxacilline [10], worden deze negatieve resultaten niet beschouwd als valsnegatieve resultaten. Met de Charm MRLBL3 Test werd dit staal door het ILVOT&V en labo 2 als positief geanalyseerd. Met de Charm MRLBL1 Test werd dit staal door het ILVOT&V en labo 8 als positief geanalyseerd. Ringmonster K was gedopeerd met 100 ppb cefalexine, een cefalosporine dat gevoelig opgespoord wordt met de Charm MRL Test (testgevoeligheid Charm MRL Test: 15 ppb validatiestudie ILVOT&V) doch niet gevoelig met de Charm MRLBL3 Test en de Charm MRLBL1 Test (testgevoeligheid Charm MRLBL3 Test: 1250 ppb resp. Charm MRLBL1 Test: 1750 ppb validatiestudies ILVOT&V). Alle laboratoria analyseerden dit ringmonster als positief met de Charm MRL Test. Met de Charm MRLBL3 Test en de Charm MRLBL 1 Test werd dit ringmonster door alle laboratoria als negatief geanalyseerd. Ringmonster L bevatte 200 ppb streptomycine en 10 ppb chloortetracycline, antibiotica die niet met de Charm MRL testen wordt opgespoord. Dit ringmonster werd door alle laboratoria unaniem als negatief geanalyseerd met de Charm MRL testen, m.a.w. er zijn geen valspositieve resultaten voor dit ringmonster.

18 Ringmonster M was gedopeerd met 4 ppb benzylpenicilline en werd door alle laboratoria als positief geanalyseerd met de Charm MRL testen. Benzylpenicilline wordt gedetecteerd vanaf 2 ppb met de Charm MRL Test en de Charm MRLBL1 Test en vanaf 3 ppb met de Charm MRLBL3 Test (validatiestudies ILVOT&V). Ringmonster N was gedopeerd met 1000 ppb clavulaanzuur, een ßetalactamaseremmer die als kruisreactie op MRL opgespoord wordt met de Charm MRL Test doch niet met de Charm MRLBL3 Test en de Charm MRLBL1 Test. Alle laboratoria analyseerden dit ringmonster als positief met de Charm MRL Test. Met de Charm MRLBL3 Test en de Charm MRLBL1 Test werd dit ringmonster door alle laboratoria als negatief geanalyseerd. Ringmonster O was gedopeerd met 20 ppb cefalonium (testgevoeligheid Charm MRL Test: 3 ppb resp. Charm MRLBL3 Test: 12 ppb resp. Charm MRLBL1 Test: 9 ppb validatiestudies ILVOT&V). Dit ringmonster werd door alle laboratoria unaniem als positief geanalyseerd. Ringmonster P was remstofvrije melk en werd door alle laboratoria unaniem als negatief geanalyseerd met de Charm MRL testen, m.a.w. er zijn geen valspositieve resultaten voor dit ringmonster. 5.4 Besluit Algemeen werden goede resultaten bekomen met de Charm MRL Test en de Charm MRLBL3 Test en zijn deze resultaten in overeenstemming met wat men theoretisch (gebaseerd op de testgevoeligheden zoals destijds behaald in de validatiestudies van het ILVOT&V) zou verwachten. Er waren geen valspositieve resultaten met de Charm MRL Test en de Charm MRLBL3 Test. Met uitzondering van het valsnegatieve resultaat bekomen door labo 8 met de Charm MRLBL1 Test voor ringmonster I (3 ppb benzylpenicilline) zijn de resultaten goed en in overeenstemming met wat men theoretisch (gebaseerd op de testgevoeligheden zoals destijds behaald in de validatiestudie van het ILVOT&V) zou verwachten. Er waren geen valspositieve resultaten met de Charm MRLBL1 Test. Merk op de cefalexine en clavulaanzuur niet op MRL opgespoord worden met de Charm MRLBL3 Test en de Charm MRLBL1 Test doch wel met de klassieke Charm MRL Test. Merk op dat cloxacilline niet steeds op MRL wordt opgespoord met de Charm MRL Test.

19 6 SNAP ßLactam ST 6.1 Inleiding Tien bedrijven namen deel met de SNAP (ßlactam) ST (Idexx Laboratories Inc.). De SNAP ST (Simplified Technology) is een eenvoudigere en verbeterde versie van de SNAP. Eenvoudiger omdat de incubatie bij kamertemperatuur plaatsvindt (geen incubator meer vereist) en verbeterd omdat er meer penicillines op MRL en meerdere cefalosporines dichter bij MRL gedetecteerd worden. Aan de deelnemers werd gevraagd om de cartouches zowel visueel als met de reader af te lezen en, waar van toepassing, de waarde van de reader op de bijhorende fiche te noteren, alsmede het lotnummer en de vervaldatum van de kit. Labo 13 las de resultaten enkel visueel af. Labo 13 was vergeten om reagentia vloeistof toe te voegen (?) voor ringmonsters O en P. Niettegenstaande er in de epjes voldoende ringmonster beschikbaar was voor een heranalyse, werd deze niet uitgevoerd. Bijgevolg werden voor ringmonsters O en P geen resultaten gerapporteerd door labo 13.

6.2 Resultaten Nr. labo Visuele aflezing Instrumentele aflezing: ratio resultaat I J K L M N O P I J K L M N O P Lotnummer vervaldatum SNAP ßLactam ST ILVOT&V 1,32 4,55 0,74 0,70 1,37 >5,0 1,22 0,71 BK172 24/04/2015 Idexx Snapshot DSR 5 1,56 >5,0 0,53 0,61 1,51 >5,0 1,13 0,68 DK880 30/05/2015 Idexx Snapshot DSR 7 2,13 >5,0 0,60 0,67 2,75 >5,0 >5,0 0,71 BK172 24/04/2015 Snapshot 10 1,19 >5,0 0,68 0,62 1,44 >5,0 1,25 0,60 DK880 30/05/2015 Idexx Snapshot DSR 11 1,49 >5,0 0,52 0,59 2,43 >5,0 1,33 0,60 BK172 24/04/2015 Snapshot Reader 12 1,14 >5,0 0,67 0,63 1,52 >5,0 1,12 0,63 EK737 14/07/2015 SNAPSHOT DSR 13 MJ745 18/02/2015 14 2,70 >5,0 0,68 0,63 4,07 >5,0 >5,0 0,73 DK950 18/06/2015 Snapshot DSR 15 3,06 >5,0 0,66 0,56 1,71 >5,0 1,54 0,49 BK172 24/04/2015 IDEXX SNAPshot DSR 17 3,28 >5,0 0,46 0,55 3,08 >5,0 2,29 0,50 GK236 05/08/2015 IDEXX SNAPshot DSR 981338100 21 1,17 3,93 0,71 0,83 2,16 6,31 1,19 0,78 EK737 14/07/2015 Idexx SNAPSHOT De door de fabrikant ingestelde cutoff waarde bedraagt 1,05 bij de Snapshot Reader. Melkmonsters die bij instrumentele aflezing een ratio geven gelegen boven deze cutoff waarde (> 1,05) worden als positief beschouwd. 6.3 Bespreking Ringmonster I was gedopeerd met 3 ppb benzylpenicilline (testgevoeligheid SNAP ST: 3 ppb validatiestudie ILVOT&V). Alle laboratoria gaven dit staal als positief door met de SNAP ST. Ringmonster J bevatte 30 ppb cloxacilline (testgevoeligheid SNAP ST: 5 ppb validatiestudies ILVOT&V). Door alle labo s werd een positief resultaat bekomen voor dit ringmonster met de SNAP ST. 20

21 Ringmonster K was gedopeerd met 100 ppb cefalexine, een cefalosporine dat niet gevoelig wordt opgespoord met de SNAP ST (testgevoeligheid SNAP ST: > 7500 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit staal werd door alle laboratoria unaniem als negatief geanalyseerd met de SNAP ST. Ringmonster L was gedopeerd met 200 ppb streptomycine en 10 ppb chloortetracycline, een combinatie van antibiotica die niet met de SNAP ST wordt opgespoord. Dit staal werd door alle laboratoria unaniem als negatief geanalyseerd met de SNAP ST, m.a.w. er zijn geen valspositieve resultaten voor dit ringmonster. Ringmonster M was een rauw melkmonster gedopeerd met 4 ppb benzylpenicilline (testgevoeligheid SNAP ST: 3 ppb validatiestudie ILVO T&V). Alle laboratoria gaven dit staal als positief door met de SNAP ST. Ringmonster N bevatte 1000 ppb clavulaanzuur, een ßlactamaseremmer die als kruisreactie vanaf 100 ppb gedetecteerd wordt met de SNAP ST (validatiestudie ILVOT&V). Door alle labo s werd een positief resultaat bekomen voor dit ringmonster met de SNAP ST. Ringmonster O was gedopeerd met 20 ppb cefalonium (testgevoeligheid SNAP ST: 20 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit ringmonster werd door alle laboratoria als positief geanalyseerd met de SNAP ST. Merk op dat door labo s 7 en 14 (te) hoge ratio s bekomen worden voor dit ringmonster. Ringmonster P was remstofvrije melk en werd door alle laboratoria unaniem als negatief geanalyseerd met de SNAP ST, m.a.w. er zijn geen valspositieve resultaten voor dit ringmonster. 6.4 Besluit Algemeen werden goede resultaten bekomen met de SNAP ST en zijn deze resultaten in overeenstemming met wat men theoretisch (gebaseerd op de testgevoeligheden zoals destijds behaald in de validatiestudies van het ILVOT&V) zou verwachten. Merk op dat cefalexine niet op MRL gedetecteerd wordt met de SNAP ST. Er waren geen valspositieve resultaten met de SNAP ST.

22 Nr. labo 7 βetas.t.a.r. Combo (v1.0) 7.1 Inleiding Twee zuivelbedrijven namen deel met de ßetas.t.a.r. Combo (v1.0) (Neogen Corporation). Met de ßetas.t.a.r. Combo (v1.0) worden gelijktijdig ßlactam antibiotica en tetracyclines opgespoord. Ook bij de ßetas.t.a.r. Combo bestaan twee types reagentia: de ßetas.t.a.r. Combo (v1.0) met een testduur van 5 minuten (2 3) en de ßetas.t.a.r. Combo 3.0 met een testduur van 3 minuten (1 2). Merk op dat enkel de ßetas.t.a.r. Combo (v1.0) vermeld is op de lijst van de door het FAVV erkende sneltesten. Aan de deelnemers werd gevraagd om de dipsticks visueel af te lezen en, waar van toepassing, de waarde van de reader op de bijhorende fiche te noteren, alsmede het lotnummer en de vervaldatum van de kit. Labo 16 las de resultaten af met de Accuscan Pro Reader doch rapporteerde geen instrumentele waarden; labo 19 las de resultaten enkel visueel af. Labo 16 rapporteerde enkel de ßlactam resultaten; labo 19 rapporteerde zowel resultaten voor ßlactam als voor tetracyclines. 7.2 Resultaten Instrumentele aflezing: ratio resultaat ßlactam Tetracyclines I J K L M N O P I J K L M N O P ßetas.t.a.r. Combo (v1.0) ILVO T&V 0,032 VISPOS 16 VISPOS 0,004 VISPOS VISPOS 4,759 9,364 0,002 VISPOS VISPOS 1,725 0,003 VISPOS VISPOS 6,913 4,125 3,511 4,309 1,960 4,326 5,641 3,090 5,496 Lotnummer vervaldatum Type reader 40214 14/02/2015 (Reveal AccuScan III) 40812 12/08/2015 (Accuscan Pro) 19 VISPOS VISPOS VISPOS * 40715H 15/07/2015 De door de fabrikant ingestelde cutoff waarde bedraagt 1,000 bij de AccuScan III Reader. Melkmonsters die bij instrumentele aflezing een ratio kleiner of gelijk aan deze cutoff waarde ( 1,000) geven, worden als positief beschouwd. VISPOS: visuele aflezing positief; : visuele aflezing negatief.

7.3 Bespreking Volgende verbindingen met volgende testgevoeligheden worden onder meer op het ßlactam kanaal van de ßetas.t.a.r. Combo (v1.0) opgespoord: 4 ppb voor benzylpenicilline, 10 ppb voor cloxacilline, 700 ppb voor cefalexine en 5 ppb voor cefalonium (validatiestudie ILVOT&V). Ringmonster I, belast met 3 ppb benzylpenicilline, kan zowel negatief als positief tekenen met de ßetas.t.a.r. Combo (v1.0). Dit monster werd door ILVO T&V en labo 16 als positief geanalyseerd voor ßlactam. Labo 19 rapporteerde dit ringmonster als negatief voor ßlactam. Ringmonster J, belast met 30 ppb cloxacilline, werd door alle laboratoria als positief geanalyseerd voor ßlactam. Ringmonster K, belast met 100 ppb cefalexine, werd door alle laboratoria als negatief geanalyseerd voor ßlactam. Ringmonsters L, N & P, die geen ßlactamantibiotica bevatten, werden door alle laboratoria als negatief geanalyseerd. Er zijn dus geen valspositieve resultaten voor deze ringmonsters op het ßlactamkanaal. Ringmonster M, belast met 4 ppb benzylpenicilline, werd door alle laboratoria als positief geanalyseerd voor ßlactam. Ringmonster O, belast met 20 ppb cefalonium, werd door alle laboratoria als positief geanalyseerd voor ßlactam. Het tetracycline kanaal van de ßetas.t.a.r. Combo (v1.0) is verantwoordelijk voor de detectie van de tetracyclines. Labo 16 gaf geen interpretatie van de tetracyclineresultaten. Voor chloortetracycline is de testgevoeligheid van de ßetas.t.a.r. Combo (v1.0) 100 ppb (validatiestudie ILVOT&V). Ringmonsters I, J, K, M, N, O en P die geen tetracyclines bevatten, werden door het ILVOT&V en labo 19 als negatief geanalyseerd voor tetracyclines. Er zijn dus geen valspositieve resultaten voor deze ringmonsters. Merk op dat door labo 19 voor ringmonster J, belast met 30 ppb cloxacilline, een randgeval negatief resultaat bekomen wordt. Ringmonster L, belast met een lage concentratie aan chloortetracycline, nl. 10 ppb chloortetracycline, werd door ILVOT&V en door labo 19 als negatief geanalyseerd voor tetracyclines. 7.4 Besluit Algemeen werden met de ßetas.t.a.r. Combo (v1.0) goede resultaten bekomen en zijn deze resultaten in overeenstemming met wat men theoretisch (gebaseerd op de testgevoeligheden zoals destijds behaald in de validatiestudie van het ILVOT&V) zou verwachten. Er waren geen valspositieve resultaten met de ßetas.t.a.r. Combo (v1.0). Merk op dat cefalexine niet op MRL wordt opgespoord met de ßetas.t.a.r. Combo (v1.0). 23

24 8 Betaxpress Milk MRL (KIT044) 8.1 Inleiding Twee zuivelbedrijven namen deel met de Betaxpress Milk, een sneltest van Unisensor s.a. voor de snelle (3 minuten) detectie van ßlactam antibiotica in melk. Aan de deelnemers werd gevraagd om de dipsticks visueel af te lezen en, waar van toepassing, de waarde van de reader op de bijhorende fiche te noteren, alsmede het lotnummer en de vervaldatum van de kit. Met de Readsensor van het ILVOT&V werden voor alle ringmonsters ratio s bekomen. De reader van labo 6 gaf echter geen ratio s voor ringmonsters J, M en O; de reader van labo 22 gaf als ratio <1,2 voor deze ringmonsters. Mogelijks beschikt het ILVOT&V over een ander type reader. Dit zal nagevraagd worden bij de kitfabrikant. 8.2 Resultaten Nr. labo Visuele aflezing Instrumentele aflezing: ratio resultaat Lotnr. vervaldatum I J K L M N O P I J K L M N O P (Type reader) ILVOT&V 0,50 0,00 1,83 1,89 0,09 1,60 0,08 1,62 14072E24/02/2015 Readsensor 6 0,0 1,6 1,8 1,2 1,7??? 22 0,0 < 1,2 2,0 3,0 <1,2 2,5 <1,2 3,1 14203C01/07/2014 Heat Sensor (=incubator!) De door de fabrikant ingestelde cutoff waarde bedraagt 1,10 bij de ReadSensor. Melkmonsters die bij instrumentele aflezing een ratio geven gelegen kleiner dan of gelijk aan deze cutoff waarde ( 1,10) worden als positief beschouwd. 8.3 Bespreking Ringmonster I was gedopeerd met 3 ppb benzylpenicilline (testgevoeligheid Betaxpress Milk: 2 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit ringmonster werd door alle labo s als positief gerapporteerd. Ringmonster J was gedopeerd met 30 ppb cloxacilline (testgevoeligheid Betaxpress Milk: 9 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit ringmonster werd door alle labo s als positief geanalyseerd. Ringmonster K bevatte 100 ppb cefalexine (testgevoeligheid Betaxpress Milk: 900 ppb validatiestudie ILVOT&V) en werd door alle labo s als negatief geanalyseerd.

25 Ringmonster L bevatte 200 ppb streptomycine en 10 ppb chloortetracycline, een combinatie van antibiotica die niet met de Betaxpress Milk wordt opgespoord. Dit ringmonster werd door alle labo s als negatief geanalyseerd, m.a.w. er zijn geen valspositieve resultaten voor dit ringmonster. Ringmonster M was een rauw melkmonster gedopeerd met 4 ppb benzylpenicilline (testgevoeligheid Betaxpress Milk: 2 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit staal werd door alle labo s als positief gerapporteerd. Ringmonster N bevatte 1000 ppb clavulaanzuur, een ßlactamaseremmer die niet gevoelig wordt opgespoord met de Betaxpress Milk. Dit ringmonster werd door alle labo s als negatief geanalyseerd. Ringmonster O bevatte 20 ppb cefalonium (testgevoeligheid Betaxpress Milk: 2 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit ringmonster werd door alle laboratoria als positief geanalyseerd. Ringmonster P was remstofvrije melk. Dit ringmonster werd door alle labo s als negatief geanalyseerd, m.a.w. er zijn geen valspositieve resultaten voor dit blanco ringmonster. 8.4 Besluit Algemeen werden goede resultaten bekomen met de Betaxpress Milk en zijn deze resultaten in overeenstemming met wat men theoretisch (gebaseerd op de testgevoeligheden zoals destijds behaald in de validatiestudie van het ILVOT&V) zou verwachten. Labo 6 nam opnieuw niet de moeite om het lotnummer & de vervaldatum van de gebruikte reagentia en het type reader te vermelden. Merk op dat cefalexine niet op MRL gedetecteerd wordt met de Betaxpress Milk. Er waren geen valspositieve resultaten met de Betaxpress Milk.

26 9 ßetas.t.a.r. 9.1 Inleiding Eén bedrijf nam nog deel met de ßetas.t.a.r. (Neogen Corporation), een ßlactam sneltest die niet vermeld is op de lijst van de door het FAVV erkende sneltesten. Aan de deelnemers werd gevraagd om de dipsticks visueel af te lezen en, waar van toepassing, de waarde van de reader op de bijhorende fiche te noteren, alsmede het lotnummer en de vervaldatum van de kit. 9.2 Resultaten Nr. labo Visuele aflezing Instrumentele aflezing: ratio resultaat Lotnr. vervaldatum I J K L M N O P I J K L M N O P (Type reader) ILVOT&V * 0,005 0,005 6,185 6,399 0,002 1,304 0,002 6,859 40617 17/06/2015 Accuscan III 20 * 40506E06/05/2015 De door de fabrikant ingestelde cutoff waarde bedraagt 1,000 bij de AccuScan III Reader. Melkmonsters die bij instrumentele aflezing een ratio kleiner of gelijk aan deze cutoff waarde ( 1,000) geven, worden als positief beschouwd. *: randgeval 9.3 Bespreking Ringmonster I was gedopeerd met 3 ppb benzylpenicilline (testgevoeligheid ßetas.t.a.r.: 3 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit ringmonster werd door beide labo s als positief gerapporteerd. Ringmonster J was gedopeerd met 30 ppb cloxacilline (testgevoeligheid ßetas.t.a.r.: 6 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit ringmonster werd door beide labo s als positief geanalyseerd. Ringmonster K bevatte 100 ppb cefalexine (testgevoeligheid ßetas.t.a.r.: > 1000 ppb validatiestudie ILVOT&V). ILVOT&V rapporteerde dit staal als negatief; labo 20 rapporteerde dit staal als positief. Merk op dat door het ILVOT&V duidelijk een negatieve ratio (6,185) bekomen wordt. Vermits ook door Neogen Corporation bevestigd wordt dat cefalexine niet op MRL wordt opgespoord met de ßetas.t.a.r., wordt het positieve resultaat van labo 20 beschouwd als een valspositief resultaat. Ringmonster L bevatte 200 ppb streptomycine en 10 ppb chloortetracycline, een combinatie van antibiotica die niet met de ßetas.t.a.r. wordt opgespoord. Dit ringmonster werd door beide labo s als negatief geanalyseerd, m.a.w. er zijn geen valspositieve resultaten voor dit ringmonster.

27 Ringmonster M was een rauw melkmonster gedopeerd met 4 ppb benzylpenicilline (testgevoeligheid ßetas.t.a.r.: 3 ppb validatiestudie ILVO T&V). Dit staal werd door beide labo s als positief gerapporteerd. Ringmonster N bevatte 1000 ppb clavulaanzuur, een ßlactamaseremmer die als kruisreactie wordt opgespoord met de ßetas.t.a.r.. Dit ringmonster werd door ILVOT&V als randgeval negatief geanalyseerd en door labo 20 als randgeval positief. Ringmonster O bevatte 20 ppb cefalonium (testgevoeligheid ßetas.t.a.r.: 4 ppb validatiestudie ILVOT&V). Dit ringmonster werd door beide laboratoria als positief geanalyseerd. Ringmonster P was remstofvrije melk. Dit ringmonster werd door beide labo s als negatief geanalyseerd, m.a.w. er zijn geen valspositieve resultaten voor dit blanco ringmonster. 9.4 Besluit Met uitzondering van het valspositieve resultaat bekomen door labo 20 voor het monster gedopeerd met 100 ppb cefalexine (ringmonster K) werden goede resultaten bekomen met de ßetas.t.a.r. en zijn de resultaten in overeenstemming met wat men theoretisch (gebaseerd op de testgevoeligheden zoals destijds behaald in de validatiestudie van het ILVOT&V) zou verwachten. Merk op dat cefalexine niet op MRL gedetecteerd wordt met de ßetas.t.a.r.. Merk op dat de ßetas.t.a.r. niet meer door het FAVV erkend is voor ingangscontrole.

28 Nr. labo ILVO T&V 10 Charm Quad Test (sneltest in validatie op het ILVOT&V) 10.1 Inleiding In het kader van een validatiestudie werd door het ILVOT&V ook deelgenomen aan dit ringonderzoek met de Charm Quad Test (Charm Sciences Inc.). Deze sneltest met 4 teststreepjes werd speciaal ontwikkeld voor de controle van export van de melk naar de Russische Federatie waarbij specifieke eisen opgelegd worden voor (de) penicilline(s) (4 ppb), de groep van de tetracyclines (10 ppb), chlooramphenicol (0,3 ppb) en streptomycine (200 ppb). 10.2 Inleiding Instrumentele aflezing: ratio resultaat Lotnummer I J K L M N O P I J K L M N O P vervaldatum Type reader Charm Quad Test BETALACTAM STREPTO B005 001 814 801 1138 460 576 932 822 1869 1899 1867 480 1999 950 1854 1645 01EZ sept 2014 VISPOS VISPOS VISPOS VISPOS EZ Reader 46 619 594 97 475 CAP 589 641 677 477 1685 TETRA De door de fabrikant ingestelde cutoff waarde bedraagt 0000 bij de EZ Reader. Melkmonsters die bij instrumentele aflezing een numerieke waarde geven gelegen boven deze cutoff waarde (> 0000) worden als positief beschouwd. VISPOS: visuele aflezing positief; : visuele aflezing negatief. 10.3 Bespreking Volgende verbindingen met volgende testgevoeligheden worden onder meer op het ßlactam kanaal van de Charm Quad Test opgespoord: 4 ppb voor benzylpenicilline, 25 ppb voor cloxacilline, 1500 ppb voor cefalexine en 10 ppb voor cefalonium (validatiestudie ILVOT&V). Ringmonster I, belast met 3 ppb benzylpenicilline werd als (randgeval) negatief geanalyseerd voor ßlactam. Ringmonster J, belast met 30 ppb cloxacilline werd als positief geanalyseerd voor ßlactam. Ringmonster K, belast met 100 ppb cefalexine werd als negatief geanalyseerd voor ßlactam. 1319 1818 761 VISPOS 1276 1765 1582 1546

29 Ringmonsters L, N & P, die geen ßlactamantibiotica bevatten, werden als negatief geanalyseerd voor ßlactam. Er zijn dus geen valspositieve resultaten voor deze ringmonsters op het ßlactam kanaal. Ringmonster M, belast met 4 ppb benzylpenicilline werd als positief geanalyseerd voor ßlactam. Ringmonster O, belast met 20 ppb cefalonium werd als positief geanalyseerd voor ßlactam. Op het tetracycline kanaal van de Charm Quad Test wordt de groep van de tetracyclines gedetecteerd. Voor chloortetracycline werd tijdens de validatiestudie van het ILVOT&V een testgevoeligheid van 4 ppb bekomen met de Charm Quad Test. Ringmonsters I, J, K, M, N, O en P die geen tetracyclines bevatten, werden als negatief geanalyseerd voor tetracyclines. Er zijn dus geen valspositieve resultaten voor deze ringmonsters op het tetracyclinekanaal. Ringmonster L, belast met 10 ppb chloortetracycline (in combinatie met 200 ppb streptomycine), werd als positief geanalyseerd voor tetracyclines. Op het chlooramphenicol kanaal van de Charm Quad Test wordt chlooramphenicol opgespoord. Voor chlooramphenicol werd met de Charm Quad Test een testgevoeligheid van 0,3 ppb bekomen (validatiestudie ILVOT&V). Ringmonsters I, J, K, L, M, N, O en P die geen chlooramphenicol bevatten, werden als negatief geanalyseerd voor chlooramphenicol. Er zijn dus geen valspositieve resultaten voor deze ringmonsters op het chlooramphenicolkanaal. Op het streptomycine kanaal van de Charm Quad Test worden streptomycine en dihydrostreptomycine gedetecteerd. Voor streptomycine werd tijdens de validatiestudie van het ILVOT&V een testgevoeligheid van 70 ppb bekomen met de Charm Quad Test. Ringmonsters I, J, K, M, N, O en P die geen streptomycines bevatten, werden als negatief geanalyseerd voor streptomycines. Er zijn dus geen valspositieve resultaten voor deze ringmonsters op het streptomycinekanaal. Ringmonster L, belast met 200 ppb streptomycine (in combinatie met 10 ppb chloortetracycline) werd als positief geanalyseerd op dit kanaal. 10.4 Besluit Algemeen werden met de Charm Quad Test goede resultaten bekomen en zijn deze resultaten in overeenstemming met de testgevoeligheden die tijdens de validatiestudie van het ILVOT&V behaald werden. Er waren geen valspositieve resultaten met de Charm Quad Test.

30 11 Algemeen besluit Volgende afwijkingen werden in het kader van dit ringonderzoek vastgesteld en vereisen opvolging en/of correctie door het betreffende labo: het tweemaal laten verloren gaan van de ringmonsters door labo 4 het niet doorgeven van de gehanteerde incubatieduur en temperatuur van de Delvotest SPNT ampullen door labo 4 het niet doorgeven van de gehanteerde incubatieduur van de Delvotest SPNT ampullen door labo 18 de valsnegatieve resultaten bekomen door labo s 6 en 17 voor ringmonster A (100 ppb sulfadiazine) met de Delvotest T ampullen het opnieuw niet doorgeven van het lotnummer & de vervaldatum van de gebruikte Delvotest T ampullen, alsook van de gehanteerde incubatieduur en temperatuur door labo 6. het valsnegatieve resultaat bekomen door labo 12 voor ringmonster A (100 ppb sulfadiazine) met de CMT Milk Test ampullen het valsnegatieve resultaat bekomen door labo 8 voor ringmonster I (3 ppb benzylpenicilline) met de Charm MRLBL1 Test het opnieuw niet doorgeven van het lotnummer & de vervaldatum van de gebruikte Betaxpress Milk reagentia, alsook van het type reader door labo 6 het valspositieve resultaat bekomen door labo 20 voor ringmonster K (100 ppb cefalexine) met de ßetas.t.a.r. N.a.v. de afwijkingen vastgesteld bij het vorige ringonderzoek werden enkel corrigerende acties ondernomen door labo 2 (labo 18 in het vorige ringonderzoek) die in vergelijking met het ILVOT&V lagere ratio s bekwam met de Rosa Pearl Reader voor de Charm MRLBL3 Test. Labo 20 (ook labo 20 in het vorige ringonderzoek) nam contact op met het ILVOT&V doch in overleg werd beslist dat corrigerende acties weinig zinvol waren. Vaststellingen die door het ILVOT&V werden opgevolgd en nog verder dienen opgevolgd te worden: De omslagtijd van de Delvotest T ampullen dient verder opgevolgd te worden. De data tonen duidelijk aan dat de interne kwaliteitscontrole bij DSM Food Specialties faalt. Als advies kan gegeven worden dat de Delvotest T ampullen steeds op controletijd dienen afgelezen te worden daar zowel trage als snelle loten op de markt zijn gebracht en er derhalve geen vaste afleestijd kan geadviseerd worden. Voor een aflezing op controletijd dient evenwel gebruik gemaakt te worden van controlemonsters! Vaststellingen die door het ILVOT&V verder dienen opgevolgd te worden: Vermits de Readsensors van labo s 6 en 22 niet altijd ratio s genereren voor de Betaxpress Milk dient bij Unisensor nagevraagd te worden of deze labo s over een ander type Readsensor beschikken dan de reader die op het ILVOT&V gebruikt wordt.

31 12 Referenties [1] Dictionnaire des Médicaments Vétérinaires et de Produits de Santé Animale commercialisés en Belgique (2006). Publication sous la direction éditoriale de S. Petit. Les éditions du Point Vétérinaire (MaisonsAlfort, FR). [2] Commission Regulation (EU) No. 37/2010 of 22 December 2009 on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue limits in foodstuffs of animal origin. Official Journal of the European Union (20.1.2010), L 15/1L 15/72. [3] Bijsluiter Delvotest SP NT (642). [4] Bijsluiter Delvotest T (664). [5] Technical Bulletin Delvotest SPNT (2011). [6] Technical Bulletin Delvotest T (2012). [7] Bijsluiter CMT Milk Test (43A). [8] Gevoeligheden Eclipse Farm 3G van Zeulab S.L. (2014). [9] Operator s manual: Charm MRL Betalactam One Minute Test for Raw Commingled Cow Milk (16Jul2014). [10] Actual situation & compilation of commercial available screening methods for the detection of inhibitors/antibiotics residues in milk. JeanMarc Diserens et al.. IDFJAT organic contaminants and veterinary residues. Draft, May 2009. Validatierapporten ILVOT&V.

32 13 Bijlagen Bijlage 1: universele codering individuele M en Smonsters A M 7 9 20 26 36 46 50 62 66 78 83 91 99 111 118 125 129 142 150 158 B M 5 15 19 30 37 48 52 59 70 74 82 95 102 107 120 127 135 140 146 155 C M 4 11 23 32 38 42 49 63 67 76 88 89 97 106 115 124 130 137 148 159 D M 8 16 17 28 33 47 51 58 72 79 85 90 101 109 119 123 133 139 149 157 E M 6 12 24 29 39 41 56 64 69 80 86 94 103 108 113 128 131 141 151 160 F M 2 10 22 27 35 43 54 60 65 73 84 93 104 112 114 122 134 144 147 154 G M 1 14 21 25 40 45 53 61 71 77 81 96 98 105 116 121 132 143 152 153 H M 3 13 18 31 34 44 55 57 68 75 87 92 100 110 117 126 136 138 145 156 I S 8 11 17 25 37 42 53 63 65 74 82 95 98 109 119 125 133 143 147 153 161 175 184 187 J S 4 12 24 27 35 47 54 58 66 77 87 94 99 107 115 121 135 140 151 159 162 171 181 191 K S 2 15 20 28 39 41 55 61 71 79 86 90 97 112 118 122 132 137 150 156 165 174 177 185 L S 6 13 18 31 36 45 49 57 70 80 83 96 104 108 120 128 131 138 148 160 167 169 180 192 M S 7 16 21 32 40 44 51 60 72 75 88 92 100 110 114 124 134 139 145 158 163 176 182 186 N S 5 9 19 26 33 48 52 59 67 73 84 91 103 111 116 127 130 142 152 157 168 173 178 189 O S 3 14 23 30 38 43 56 64 69 76 85 89 101 105 113 123 129 141 149 154 166 172 179 190 P S 1 10 22 29 34 46 50 62 68 78 81 93 102 106 117 126 136 144 146 155 164 170 183 188