UvA-DARE (Digital Academic Repository) A new strategy in root canal therapy: there is a lot going on in endodontic disinfection van der Waal, S.V. Link to publication Citation for published version (APA): van der Waal, S. V. (2015). A new strategy in root canal therapy: there is a lot going on in endodontic disinfection s-hertogenbosch: Boxpress General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: http://uba.uva.nl/en/contact, or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (http://dare.uva.nl) Download date: 30 Jan 2019
Chapter 12 Nederlandse inleiding en samenvatting van A new strategy in root canal therapy: there is a lot going on in endodontic disinfection. Een nieuwe strategie voor de wortelkanaalbehandeling, de endodontische desinfectie is in beweging.
126 Nederlandse inleiding en samenvatting Het doel van het onderzoek was de ontwikkeling van een nieuwe methode voor de desinfectie van geïnfecteerde wortelkanalen. Hiervoor zijn modellen gebruikt die in nieuw zijn in de endodontologie. Om de resultaten van de nieuwe ontwikkeling in een referentiekader te kunnen plaatsen, zijn bestaande wortelkanaaldesinfectantia meegenomen in de testen. Dit leverde nieuwe inzichten op over de werking van de bestaande middelen. Deel 1 van dit proefschrift gaat over de ontwikkeling van de nieuwe methode; deel 2 gaat over nieuwe ontwikkelingen met betrekking tot reeds bestaande middelen zoals natriumhypochloriet (NaOCl) en calciumhydroxide (Ca(OH) 2 ). Een wortelpuntontsteking, parodontitis apicalis, is een ontstekingsreactie op een microbiële infectie van het wortelkanaalstelsel. Genezing van deze ontsteking kan pas plaatsvinden als de infectie is verdwenen en daarom is desinfectie van het wortelkanaalstelsel een belangrijk onderdeel van de wortelkanaalbehandeling. Wanneer de genezing van een wortelpuntontsteking wordt beoordeeld aan de hand van intraorale röntgenfoto s, dan blijkt dat 20 tot 40% van de wortelpuntontstekingen niet geneest na een wortelkanaalbehandeling. Dit heeft een aantal redenen. Het wortelkanaalstelsel is zeer complex van vorm. Tijdens de wortelkanaalbehandeling kan daarom slechts een deel van het kanaalstelsel worden bereikt met instrumenten en desinfecterende middelen. Een andere belangrijke reden is dat bacteriën in een biofilmformatie in het wortelkanaal verblijven. In tegenstelling tot wat vroeger werd gedacht, komen bacteriën niet vaak voor als planktonische, losse, bacteriën, maar in een biofilm. Een biofilm is een cluster van micro-organismen, die zich bij voorkeur verzamelt en hecht op een vochtig oppervlak. In een biofilm zijn de micro-organismen omgeven door een zelf geproduceerde waterige slijmlaag. Een biofilm bestaat slechts voor 1-5% uit micro-organismen en voor het grootste deel, 95-99%, uit slijmmatrix. De samenstelling van een biofilm kan zeer heterogeen zijn met verschillende soorten microorganismen. Bacteriën in een biofilm zijn tot 1000x minder gevoelig voor desinfectie dan planktonische bacteriën. Huidige desinfectiemethoden kunnen een geïnfecteerd wortelkanaalstelsel niet compleet bacterievrij maken. NaOCl is een krachtig oppervlaktedesinfectans met weefseloplossend vermogen. NaOCl dringt echter niet diep door in de anatomische niches. NaOCl is zeer reactief en zodra het in contact komt met organisch materiaal, valt het uiteen. Chloorhexidine (CHX) heeft goede antimicrobiële eigenschappen, maar geen doordringend of weefseloplossend vermogen. CHX heeft wel substantiviteit; het blijft nog enige tijd na aanbrengen werkzaam. Calciumhydroxide wordt ook als wortelkanaaldesinfectans toegepast. De werking berust op de verhoging van de ph in het wortelkanaal. Ca(OH) 2
Nederlandse inleiding en samenvatting 127 werkt traag en daarom wordt het gedurende dagen tot weken ingesloten in het wortelkanaal. Het gebitselement wordt in de tussentijd tijdelijk afgesloten. We beginnen nu echter te begrijpen dat Ca(OH) 2 minder goed werkt op biofilms dan werd gedacht. Toch wordt Ca(OH) 2 wereldwijd nog heel veel toegepast. Een goed werkend wortelkanaaldesinfectans moet enig doordringend vermogen hebben om ook de diepere delen van het wortelkanaalstelsel en de biofilms te bereiken. Verder moet het veilig zijn voor de omringende weefsels van een gebitselement, maar ook voor het totale menselijk lichaam. Diffusie is een fysische wet, waarbij moleculen in een vloeistof zich verplaatsen van een gebied met hoge concentratie naar een gebied met een lagere concentratie. Denk aan een druppel inkt in een glas water. Osmose is een proces op basis van diffusie waarbij alleen kleine moleculen zich door de openingen van een halfdoorlatend membraan kunnen verplaatsen van een gebied van een lagere concentratie opgeloste moleculen naar een gebied met een hogere concentratie opgeloste moleculen. Een hoge concentratie aan de ene zijde van het membraan trekt dus kleine moleculen (water) aan waardoor de concentratie aan die ene zijde wordt verlaagd. Bacteriële celmembranen zijn halfdoorlatend en dus zal een hoge concentratie van bijvoorbeeld zouten aan de buitenkant van de bacterie, het water dat zich in de bacterie bevindt, aantrekken. Dit resulteert in metabolische stress, groeiremming en uiteindelijk celdood. Een voorbeeld van de dergelijke antimicrobiële werking door osmose is het pekelen van vis of groente. In theorie zou een hypertoon antimicrobieel middel, wanneer aangebracht in een hoofdwortelkanaal, een effect kunnen hebben op het gebied achter het hoofdwortelkanaal. Diffusie en osmose treden namelijk op tot een evenwicht in een bepaald systeem is bereikt. Een dergelijk systeem zou een wortelkanaalstelsel kunnen zijn. Dat bacteriën kunnen worden gedood door de toepassing van zout waardoor de omgeving van de bacteriën hypertoon wordt is al eerder aangetoond, maar of bacteriën in een bestaande biofilm kunnen worden geïnactiveerd door middel van een hypertoon medium was nog niet bekend. In hoofdstuk 2 werd onderzocht of biofilms kunnen worden geïnactiveerd door deze alleen bloot te stellen aan een hypertone omgeving. Daartoe werden biofilms gekweekt van twee soorten bacteriën: Enterococcus faecalis en Pseudomonas aeruginosa. E. faecalis wordt aangetroffen in reeds endodontisch behandelde elementen en kan een hoge ph goed verdragen. P. aeruginosa komt ook voor in het wortelkanaal maar is vooral berucht vanwege de slijmvormende eigenschappen, snelle groei en daarmee samengaande hoge virulentie. Deze, tweesoortige biofilms werden gekweekt op dekglaasjes gedurende 96 u en vervolgens ondergedompeld in eenmedium waaraan natriumchloride (NaCl) of Ca(OH) 2 was toegevoegd. Het NaCl-medium had een hoge osmotische waarde, het 12
128 Nederlandse inleiding en samenvatting Ca(OH) 2 medium had een hoge ph (± 12.5). De controlegroep bestond uit biofilms in neutraal groeimedium. De media werden dagelijks ververst. Na 24, 48, 72 of 168 u werd de hoeveelheid bacteriën in de biofilms bepaald. De controlebiofilms bevatten 500 miljoen tot een miljard cellen per biofilm. De conclusies van dit experiment waren, dat hyperosmose bacteriën in een biofilm kan afdoden. Volledige eliminatie duurde echter 168 h. Ca(OH) 2 had in dit model onvoldoende antibacteriële werking. Bovendien, resulteerde de toepassing van Ca(OH) 2 in het ontstaan van een dichte neerslag in de biofilms. Omdat desinfectie met NaCl een langdurige proces bleek te zijn, werd in een volgende studie, hoofdstuk 3, onderzocht hoe de inactivatie van de biofilmbacteriën kon worden versneld. Hyperosmose is slechts een enkele bacteriële stressfactor. De vraag was of het mogelijk zou zijn om sneller te desinfecteren door meerdere stressfactoren te combineren? Het toepassen van meerdere stressfactoren tegelijkertijd om bacteriegroei te remmen heet de multiple-hurdle strategie. Dit principe wordt reeds toegepast in de levensmiddelenindustrie om vers bereide producten langer te conserveren, terwijl de kwaliteit van het product hoog blijft. Dit wordt bereikt door een product bijvoorbeeld licht te verhitten, mild te zouten, de ph iets te verlagen of een beetje conserveringsmiddel toe te voegen. Dit zijn voorbeelden van milde behandelingen die per stuk geen afdoende bescherming bieden, maar wanneer gelijktijdig toegepast bacteriegroei voorkomen. Hoewel veel literatuur bestaat over het effect van deze strategie op de remming van bacteriegroei, was deze strategie was nog niet eerder toegepast om een bestaande biofilm af te doden. In een volgend experiment, werd een groep zouten van organische zuren geselecteerd op basis van oplosbaarheid in water, conserverende eigenschappen en veiligheid (generally recognized as safe (GRAS), door de Amerikaanse Food and Drug Administration of door de Europese Unie in het geval van E-nummers. Beide predicaten geven aan dat het gaat om stoffen die zijn goedgekeurd als voedingsadditief voor menselijke consumptie). De toegepaste hurdles waren hyperosmose, zwakzuurstress en de remmende werking van de organisch anionen. Om dit te testen zijn biofilms van E. faecalis gedurende 1 of 2 uur behandeld met verschillende oplossingen. Een combinatie van kaliumsorbaat en NaCl elimineerde biofilms van ongeveer 100 miljoen bacteriën binnen 1 uur. Deze combinatie wordt vanaf nu de aangepaste zoutoplossing (MSS) genoemd. In hoofdstuk 4 werd de veiligheid van MSS getest op fibroblasten afkomstig van humaan parodontaal ligament. De conclusies waren dat MSS na een aanvankelijke lichte irritatie de cellen intact liet. Dit in tegenstelling tot NaOCl wat bij een vergelijkbare concentratie onmiddellijk de cellen inactiveerde. Verder werd onderzocht of dentine een remmende effect heeft op de werking van MSS. Het bleek dat dentine de werking van
Nederlandse inleiding en samenvatting 129 MSS niet beïnvloedde. Ook werden gedurende 4,5 weken biofilms gekweekt van micro-organismen die waren geïsoleerd uit geïnfecteerde wortelkanalen. De werking van MSS werd getest op deze complexe en oudere biofilms. Hier zagen we dat MSS net zo effectief was in het doden van biofilmbacteriën als 2% NaOCl. Om effectief bacteriedodend te zijn bij een complexe wortelstructuur zou MSS ook op afstand middels diffusie moeten werken en deze werking is beschreven in hoofdstuk 5. Voor deze studie zijn de wortels van geëxtraheerde gebitselementen gebruikt. Deze zijn na preparatie, geautoclaveerd en vervolgens geïnoculeerd met E. faecalis. Na drie weken groei, zijn de wortels op drie verschillende wijzen behandeld, met alleen NaOCl irrigatie, NaOCl irrigatie en applicatie van MSS gedurende een week of NaOCl irrigatie en applicatie van Ca(OH) 2 gedurende een week. Na de neutralisatie van de behandelingen zijn monsters van de wortelkanalen genomen. Vervolgens zijn de wortelkanalen gevuld met groeimedium en opnieuw geïncubeerd bij 37 o C gedurende een week. Na deze week is onderzocht in hoeveel wortelkanalen hergroei van de bacteriën is opgetreden. Hergroei trad op in 64% van de NaOCl groep, 26% van de MSS groep en 68% van de Ca(OH) 2 groep. Dit verschil was statistisch significant (P = 0.009). Onze conclusie is dat MSS bacteriën in de onregelmatigheden van het wortelkanaal kan elimineren. Desinfectie met Ca(OH) 2 kon hergroei van bacteriën niet voorkomen. Natriumhypochloriet is een instabiele oplossing. In voorgaande experimenten is NaOCl gebruikt om biofilms geheel af te doden. In sommige gevallen lukte dat echter niet. Na iodometrische titratie van de gebruikte NaOCl-oplossingen, bleek toen dat de concentratie op de verpakking van NaOCl soms niet overeenkomt met de werkelijke gemeten concentratie. Een volgende studie werd opgezet (hoofdstuk 6) waarin de kwaliteit van NaOCl-oplossingen bedoeld voor wortelkanaalirrigatie in de tandheelkundige praktijk werd onderzocht. Tandartsen werd gevraagd om een monster van de door hen in hun praktijk gebruikte NaOCl oplossing. Ook hebben we een vragenlijst laten invullen met vragen over de concentratie van het geleverde monster, de bron van de NaOCl, of NaOCl was verdund en waarmee, hoe oud de NaOCl was en hoe het was bewaard. In het laboratorium werd de hoeveelheid vrij chloor van de monsters bepaald en de ph werd gemeten. Na de analyse werden de participerende tandartsen op de hoogte gebracht van de uitkomst van hun eigen monster. De conclusies waren dat er gemiddeld een afname van vrij chloor was van 27%. Achttien procent van de monsters bevatte onbedoeld minder dan 1% NaOCl, de werkzame grens voor effectieve irrigatie, en de gemeten NaOCl afkomstig van supermarkt of drogist week het meeste af van de verwachting, gemiddeld 50% minder vrij chloor dan werd verwacht. Uit de correlatieberekeningen bleek dat een lage ph 12
130 Nederlandse inleiding en samenvatting was geassocieerd met een groter verschil in concentratie. Ook leek het uit te maken of er wel of niet in de praktijk werd verdund. Omdat er meer werd verdund in de huishoudbleek-groep, was deze correlatie echter niet betrouwbaar. Omdat in deze studieopzet geen baselinemetingen zijn gedaan konden geen uitspraken worden gedaan over de oorzaken van de gevonden discrepantie tussen de gewenste concentratie vrij chloor en de uiteindelijk gemeten concentratie. In hoofdstuk 7 werd daarom uitgezocht of de correlaties uit de vorige studie ook een causaal verband hadden. Natriumhypochloriet werd gekocht bij tandheelkundige leveranciers (vijf merken) en supermarkten/drogist (vijf merken). Van ieder merk werden 3 flessen met bij voorkeur verschillende batchnummers aangeschaft. Deze NaOCl s werden geanalyseerd op de hoeveelheid vrij chloor en de ph. Acht van de NaOCl-oplossingen werden vervolgens verdund met kraanwater of gedemineraliseerd water en bewaard bij kamertemperatuur of gekoeld in het donker gedurende 5 maanden. Deze oplossingen zijn geanalyseerd meteen na het verdunnen, na 2 weken en na 5 maanden. Hieruit bleek dat huishoudbleken conform de informatie op de verpakking <5% vrij chloor bevatten en dat de [NaOCl] varieerde van 1.7% tot 3.3%. Professioneel NaOCl was meer accuraat hoewel soms meer en soms minder vrij chloor werd gemeten. Na 5 maanden was er een afname van vrij chloor van gemiddeld 5.4% in zowel huishoud al professionele NaOCl. Verdunnen, bewaartemperatuur en de ph hadden geen effect op de veroudering van de oplossingen. We concludeerden dat beide bronnen voldoende vrij chloor bevatten voor adequate endodontische desinfectie, maar dat huishoudbleek door de onvoorspelbaarheid van de concentratie minder geschikt is voor wortelkanaalirrigatie. NaOCl kan in een gesloten fles in the donker tot 5 maanden worden bewaard. Tot slot is in de laatste twee hoofdstukken van dit proefschrift een aantal eigenschappen van Ca(OH) 2 beschreven. Calcium komt vrij wanneer Ca(OH) 2 in oplossing gaat. Ca 2+ is een dubbel geladen kation en het stimuleert de productie van extracellulaire polymere sachariden (EPS) en alginaten: het slijm van een biofilm. Calcium bindt sterk aan het negatief geladen EPS en zorgt voor stevige dwarsverbindingen tussen de polymeerketens. Door calcium nemen dus zowel het volume als de viscositeit van een biofilm toe. Calcium hecht ook aan de negatief geladen bacteriële celwand en kan de hechting van bacteriën aan oppervlakken of aan elkaar faciliteren. In een alkalische omgeving wordt de binding van calcium aan EPS extra gestimuleerd. In theorie zou de toepassing van Ca(OH) 2, de inactivatie van bacteriën kunnen belemmeren. In hoofdstuk 8 werd onderzocht of de blootstelling aan Ca(OH) 2 een effect had op de gevoeligheid voor NaOCl-desinfectie van bacteriën in biofilms. Daartoe werden biofilms gekweekt van acht verschillende stammen van Enterococcus faecalis bacteriën. Het bleek dat de bacteriën na een voorbehandeling met
Nederlandse inleiding en samenvatting 131 Ca(OH) 2 over het algemeen even gevoelig waren voor NaOCl als ervoor. Een stam bleek minder gevoelig te zijn geworden. Er was een verschil in gevoeligheid tussen de verschillende soorten E. faecalis. Uit klinische gerandomiseerde studies met controlegroepen is al gebleken, dat Ca(OH) 2 de genezing van parodontitis apicalis niet stimuleert. Ook, is niet bewezen dat na irrigatie met NaOCl, Ca(OH) 2 het aantal bacteriën in een wortelkanaal extra reduceert. Sommige bacteriesoorten kunnen overleven in een alkalische omgeving. Dit kan leiden tot een verschuiving van bacteriepopulaties in een biofilm waarbij de meest resistente soorten achterblijven. In hoofdstuk 9 is onderzocht welk effect Ca(OH) 2 heeft op de samenstelling van in-vitro gekweekte biofilms. Ook is onderzocht of de hoeveelheid E. faecalis in gemengde biofilms veranderde na een behandeling met Ca(OH) 2. Eerst zijn tweesoortige biofilms gekweekt van Enterococcus faecalis en Pseudomonas aeruginosa. Vervolgens is een deel van deze biofilms behandeld met Ca(OH) 2. Na een herstelperiode van 16 uur zijn de biofilms behandeld met NaOCl of chlorhexidine in verschillende concentraties. We zagen dat P. aeruginosa gevoeliger was voor Ca(OH) 2 dan E. faecalis en dat er dus een verschuiving in de biofilm optrad ten gunste van E. faecalis. Bovendien maakte Ca(OH) 2 P. aeruginosa ook gevoeliger voor desinfectie met NaOCl. E. faecalis herstelde sneller van een Ca(OH) 2 behandeling dan P. aeruginosa. In de bacteriepopulaties die voor een vervolgexperiment uit geïnfecteerde wortelkanalen waren geïsoleerd, kon geen E. faecalis worden aangetoond met behulp van de kwantitatieve PCR-methode. Na afloop van het experiment echter, bleken 5 van de 6 isolaten toch E. faecalis te bevatten. Er kon niet worden bewezen dat na Ca(OH) 2, de proportie E. faecalis in een biofilm toeneemt. De totale hoeveelheid bacteriën nam af door Ca(OH) 2 waardoor naar alle waarschijnlijkheid de toch al kleine hoeveelheden E. faecalis onder de detectiegrens terechtkwamen. Algemene conclusies van dit proefschrift: Een in dit proefschrift beschreven zoutoplossing is een veilig en veelbelovend middel bij de behandeling van wortelkanaalinfecties. De effectiviteit moet uiteindelijk klinisch worden getest, nadat een goede toepassing en plek in het reinigingsprotocol zijn gevonden. De concentratie natriumhypochloriet kan behoorlijk verschillen met de informatie op de verpakking. De huishoudbleken bevatten overeenkomstig het etiket allemaal <5% vrij chloor, maar de uiteindelijke concentraties variëren sterk per merk. Zolang in de praktijk niet getest kan worden hoeveel vrij chloor een NaOCl oplossing bevat, is het advies om professionele NaOCl aan te schaffen van ten minste 2%. Calciumhydroxide kan bacteriën in biofilms niet elimineren, noch het gehele wortelkanaalstelsel desinfecteren. Bij het gebruik van Ca(OH) 2 in vitro ontstaat een neerslag in de biofilm en op het substraat. Door 12
132 Nederlandse inleiding en samenvatting het gebruik van Ca(OH) 2 worden bacteriën over het algemeen niet resistenter tegen desinfectie met NaOCl. Er treedt een verschuiving op in de samenstelling van complexe biofilms waarschijnlijk in de richting van de snel herstellende bacteriesoorten zoals E. faecalis. In primaire endodontische infecties komt E. faecalis veelvuldig voor, zij het in zeer lage hoeveelheden.