UDC 628.1+.3:543.3:615.9 Be~alina van de acute toxiciteit met behulb i ; y\, Water - Determination of acute toxicity with Daphnia magna Onderwerp Deze norm beschrijft een methode voor het vaststellen van de acute toxiciteit van water & behulp van Daphnia magna (een watervlo). De hier beschreven methode betreft aiieen acuut optredende effecten; meer informatie omtrent de giftigheid van stoffen kan worden verkregen in een chronische-toxiciteitrtoets (zie NEN 6502). Dit document mag slechts op een stand-alone PC worden geinstalleerd. Gebruik op een netwerk is alleen. toestaan als een aanvullende licentieovereenkomst voor netwerkgebruik met NEN is afgesloten. This document may only be used on a stand-alone PC. Use in a network is only permitted when a supplementary license agreement for us in a network with NEN has been concluded. Toepassingrgebied De norm is van toepassing op oplossingen in water van stoffen met een bekende samenstelling in een gestandaardiseerd medium. Het toepassingsgebied kan worden uitgebreid tot niet of weinig verdund afvalwater indien de gehalten aan ~a', Kt, cazt, ~g", Cl-, SO,'-, HC03- hiervan bij benadering bekend zijn en dezezo nodig kunnen worden aangepast aan die van het gestandaardiseerde medium. Definities De toisrsntie van Daphnia magna voor de combinatie van ~a+, K', cazt, blgz', Cl-, en HC03- is niet bekend. Indien de gehalten hieraan in afvalwater e.d. veel hoger rijn dan in het gestandaardiseerde medium kan Daphnia magna niet ais proefdier worden gebruikt. LC 50.t van een stof: De concentratie van die stof waarbij 50 %van de daaraan blootgestelde proefdieren na. een blootsteilingsduur t dood zijn. EC 50.t van een stof: De concentratie van die stof waarbij bij 50 % van de daaraan blootgestelde proefdieren na een blootsteilingsduur t een bepaald effect (bijv. onbeweeglijkheid) optreedt. Beginsel Daphnia's zijn gevoelige aquatische toetsorganismen. zowel voor zware metalen als voor pesticiden (zie 9.1 t.m. 9.71. Als maatvoor de acutegiftigheid vaneen in waterte brengenstof wordt desterfte (LC 50.48 h) of de onbeweegiijkheid (EC 50.48 h) van Daphnia magna Straus (Crustacea, Ciadocera) gebruikt. De proefdieren worden hiertoe gedurende 2 dagen in water met verschillende concentraties van de te onderzoeken stof gehouden. De sterfte respectievelijk de onbeweeglijkheid wordt vergeleken met die in een blanco proef. De toets wordt acuut genoemd daar de tijd van blootstelling (48 h) kort is ten opzichte van de generatietijd. Benodigdheden Voldoende (ongeveer 350 stuks per toets) exemplaren dan Daphnia magna, leeftijd jonger dan 24 h, bij voorkeur 16 à 24 h,geboren uit ongeveer 3 weken oude dieren (zie NPR 6503). Proefruimte, temperatuur 19 f 1 OC, niet kritisch. dagelijks gedurende ongeveer 12 h matig verlicht. De verlichting is Bekerglazen van 250 mi en 1000 mi of andere geschikte proefvaten, afgedekt met een horiogegias. Conische kolven van glas met ingeslepen stop, van 1000 ml. Maatpipetten van 1 ml en 10 mi, voigens NEN 1754. Maatcilinders van 25 ml, 100 mi, 250 mi en 1000 mi, volgens NEN 1759. Maatkolven van 100 mi, 250 mi en 1000 mi, voigeris NEN 1750. Pipetteerspuiten met wegwerptips met een vast volume van 25 pi, 100 ril, 250 pi en 1000 p1 ph-meter. Zuurstofmeter. Gestandaardiseerd medium gelijk aan dat gebruikt bij het kweken van de Daphnia's (zie NPR 6503). Glazen buisjes, lengte ongeveer 150 mm, binnenmiddellijn ongeveer 3 mm, voorzien van een speentje. NEN 6501
Uitvoering Voorbereidingen Oplosbaarheid De oplosbaarheid van de te onderzoeken stof in water dient vó6r de proef te worden vastgesteld. In het geval van vloeistoffen of afvalwater dienen de mengbaarheid met water en de stabiliteit van de resulterende verdunde oplossingen te worden nagegaan. Indien vaar het doseren een ander oplosmiddel dan water wordt gebruikt, moet de gebruikte hoeveelheid van dit oplosmiddel niet giftig zijn voor de Daphnia's. niet snel afbreken en mengbaar zijn met water. Tertiair butanol, dimethylsulfoxide (DMSO) en aceton in een verdunning 1 :lo4 zijn bruikbaar. ede van de proefvaten Gebruik bekerglazen van 250 ml of ander geschikt gibswerk, afgedekt met een horlogeglas (5.3). Indien uit oriënterend onderzoek is gebleken, dat de te toetsen stof vluchtig is, met water codestiileert of aan glas adsorbeert, en in alle gevallen waarbij hierover onvoldoende gegevens bekend zijn, zijn extra, voorzorgen nodig. Toets vluchtige of codestillerende stoffen in gesloten en bijna geheel gevulde conische kolven van 1000 ml (5.4). Adsorberende stoffen moeten worden getoetst in glaswerk met een groot volume ten opzichte van het oppervlak bijv. in,bekerglazen (5.3) of in conische kolven van 1 i, afgedekt met een horlogeglas. Breng dit glaswerk tevoren door omspoelen met de te gebiuiken oplossing van de te onderzoeken stof in evenwicht. Bereiden van de oplossingen met de gewenste concentraties Goed in water oplosbare stoffen Maak van goed In water oplosbare stoffen stamoplossingen In gedestilleerd water die 103 maal zo sterk zijn als de in de toets gewenste concentraties. Beieid de juiste concentraties in de proefvaten door verdunning met gestandaardiseerd medium (5.1 1 ). Slecht in water oplosbare stoffen Maak van slecht in water oplosbare stoffen, indien mogelijk, stamoplossingen in een organisch oplosmiddel (zie&l.?), die 1v maal zo sterk zijn als de in de toets gewenste concentraties. Bereid de juiste concentraties in de proefvaten door verdunning met gestandaardiseerd medium (5.1 l), waarbij de oplosbaarheid van de toetsverbinding in dit medium nietmag worden overschreden. 6.1.3.3 Niet voldoende in water oplosbare zuivere stoffen Bereid van zuivere stoffen, w'aarvoor een analyse bekend is en die niet voldoende in water oplosbaar zijn voor het werken via stamoplossingen, de in de toets gewenste concentraties direct in gestandaardiseerd medium (5.1 1 ). Het juiste gehalte van de oplossingen moet dan analytisch worden bepaald. 6.1.3.4 Afvalwater Meet van reeds verdunde oplossingen in water, zoals afvalwater, het gehalte aan de ionen genoemd onder 2 en bovendien de ph, het zuurstofgehalte en het biochemisch zuurstofverbruik (BZV). Tijdens de toxiciteitstoets mag het zuurstofgehalte niet lager dan 6,O mg/l worden. Indien het zuurstofgehalte enlof de BZV aanwijzingen geven dat dit kan voorkomen belucht dan de te toetsen oplossingen v66r en tijdens de toets zodanig dat het zuurstofgehalte gedurende de toets boven de 6.0 mg11 blijft. Bedenk dat vluchtige stoffen door het beluchten kunnen verdwijnen en dat afbreekbare stoffen kunnen veranderen en verdwijnen. Indien de ph ernstig afwijkt van die van het gestandaardiseerde medium, toets het afvalwater dan wel en niet geneutraliseerd. Indien het afvalwater vaste bestanddelen bevat, toets het dan wel en niet gefiltreerd. Indien de gehalten aan de ionen genoemd onder 2 veel lager zijn dan die van het gestandaardiseerde medium, pas die gehalten dan aan aan die van het gestandaardiseerde medium en toets het afvalwater zowel met ais zonder deze toevoegingen. Indien de gehalten aan de ionen genoemd onder 2 veel hoger zijn dan die van het gestandaardiseerde medium, kan Daphnia magna niet worden gebruikt (zie opmerking onder punt 2). 6.4.1 Keuze van de te toetsen concentraties De te toetsen concentraties resp. verdunningen dienen een meetkundige reeks te vormen, waarvan de grootte van de rede afhangt van de gewenste nauwkeurigheid. en van geschikte concentratiereeksen zijn gegeven in de tabel.
Tabel - Geschikte concentratiereeksen voor toxiciteitstoetsen concentratiereeks (bijv. in rng/l) 1,o 10 enz. rede 10 doel eerste indruk omtrent toxiciteit 1,O 3.2 10 enz. globale toxiciteitstoets 1 1.0 1.8 3.2 5,6 l0 enz. 1 $?Ö = 1.78 1 routinetoxiciteitstoets I Stel in een oriënterende toets (zie de tabel) vast in welke decade van concentratie de te meten effecten liggen. Kies op grond van de gegevens uit deze voorproef voor de uiteindelijke toets 5 of meer concentraties met een onderlinge factor van l,78 of kleiner. 6.1.5 Blanco's Voeg aan elke concentratiereeks een blanco toe (gestandaardiseerd medium zonder toetsverbinding) en indien een ander oplosmiddel dan gedestilleerd water is gebruikt, tevens een afzonderlijke blanco met dit oplosmiddel in dezelfde verdunning als in de toets is gebruikt. 6.1.6 Duplicerhg Voer de gehele toets ten minste in tweevoud uit. 6.1.7 Controles Meet van het gestandaardiseerde medium voor het gebruik de ph en het zuurstofgehalte. Breng zo nodig de ph op 8,4 i 0.1 en het zuurstofgehalte op 8,9 f 0,4 mg/l, beide door beluchten. 6.2 De eigenlijke toets fl = 3,16 1,O 1,3 1.8 2,4 3,2 4,2 5,6 7,4 10 enz. fl = 1.33 nauwkeurige toxiciteitstoets Zet in de proefruimte (5.2) voldoende bekerglazen of conische kolven gereed (aantal, soort en afdichting gekozen volgens de overwegingen van 6.1.Z). Codeer deze met ten minste de toetsverbinding en de concentratie. Vul ze, bij een dosering van de toetsverbinding via stamoplossingen, voor ongeveer een derde met gestandaardiseerd medium met een temperatuur van ongeveer 19 'C. Doseer de toetsverbinding. Doseer, indien het oplosmiddel van de stamoplossing gedestilleerd water is, 1 ml of 0,25 ml, voor een eindvolume van resp. 1 I of 250 ml; is het oplosmiddel van de stamoplossing een organisch oplosmiddel, doseer dan 100 pl of 25 p1 voor een eindvolume van 1 I of 250 ml. Vul met gestandaardiseerd medium aan tot 1 I of 250 ml. Indien geen stamoplossingen worden gebruikt, moet het gekozen glaswerk tot het gewenste volume met de tevoren bereide oplossingen in gestandaardiseerd medium worden gevuld. Maak van afvalwater na goed mengen geschikte verdunningen met gestandaardiseerd medium. Vul hiermee het gekozen glaswerk tot het juiste volume of bereid de verdunningen direct in het gekozen glaswerk. Controleer van de blanco en van de meest geconcentreerde oplossing de ph en het zuurstofgehalte. Controie van de verdunningen verdient tevens aanbeveling aangezien het kan voorkomen dat de zuurstofconcentrstie van de verdunningen sneller zakt dan in de hoogste concentratie. Indien deze grootheden onderling niet gelijk zijn, controleer dan ook de andere oplossingen. Breng zo nodig het zuurstofgehalte op 8.9 i O P mg/l en, indien gewenst, de ph op 8,4 + 0.1. Bedenk hierbij, dat de ph van de oplossing zowel de conditie van de Daphnia's als de giftigheid van de toetsverbinding kan beïnvloeden. Let bij neutraliseren van sterk zuur of basisch afvalwater op het zoutgehalte van de resulterende oplossing. Noteer de resultaten van deze metingen. Noteer of het zuurstofgehalte en/of de ph werden bijgesteld. Neem, zo mogelijk en indien gewenst, monsters ter bepaling van de gehalten van de toetsverbinding in de verschillende oplossingen. Deze monsterneming mag het eindvolume niet teveel beïnvloeden. Indien voor analyse meer dan 10 % van het volume nodig is, moeten tevoren grotere hoeveelheden van de oplossingen worden bereid. Tel in elk proefvat 25 exemplaren van Daphnia magna uit. Zuig deze hiertoe op uit sen voorraad, in overzichtelijke aantallen, met behulp van de glazen buis (5.12). Laat ze onder het vloeistofoppervlak los in de proefvaten. Vermijd contaminatie. Werk hiertoe van lage naar hoge concentratie, begin bij de blanco's en zorg voor evenveel voorraadvaten met Daphnia's als er stoffen worden getoetst. Tijdens de proef mag niet worden belucht en niet worden gevoerd. Tel en verwijder de dode Daphnia's na 24 en 48 h.
Noteer alle afwijkingen van normaal gedrag, zo mogelijk ook met de aantallen van dergelijke Daphnia's. Tel na 48 hde dode of onbeweeglijke en ook de zich normaal gedragende Daphnia's en controleer of het totale aantal klopt. Controleer na 48 h de ph van de blanco en van de meest geconcentreerde oplossing; indien deze grootheden onderling niet gelijk zijn, controleer dan ook de andere oplossingen. Controleer na 48 h het zuurstofgehalte van alle toetsoplossingen. Bepaal na 48 h de gehalten aan toetsverbinding, indien er geanalyseerd was op t = 0. Herhaal de gehele toets om de reproduceerbaarheid vast te stellen. 7 Weergave van de resultaten Tabelleer voor elke waarnemingstijd voor de blanco's en voor alle getoetste oplossingen, de sterfte (of onbeweeglijkheid) in %, afzonderlijk voor beide toetsreeksen. Vermeld in deze tabel tevens de gemeten ph-waarden en zuurstofgehalten. Geef de werkelijke concentraties van de toetsverbinding aan, indien de oplossingen daarop zijn geanalyseerd, zowel voor t = O als voor t = 48 h. Bepaal de LC 50.48 h als volgt: Corrigeer de bepaalde sterfte voor de blanco sterfte volgens: waarin: p' is de gecorrigeerde sterfte, in %; p is de bepaalde sterfte, in %; c is de sterfte in de blanco, in %. Zet voor t = 48 h de concentratie van de toetsverbinding (C) uit tegen de bijbehorendep' op logaritmisch waarschijnlijkheidspapier (zie de figuur). Trek een zo goed mogelijk bij de punten passende rechte en lees uit deze grafiek de concentratie af, waarbij 50 %sterfte zou zijn opgetreden (de LC 50.48 h). Vermeld bij de tabel voor beide toetsreeksen de LC 50.48 h en desgewenst de gemiddelde waarde. Geef aan of deze waarden al dan niet zijn gecorrigeerd voor de gehalten die bepaald zijn. Indien andere effecten dan sterfte werden gemeten, bijv. onbeweeglijkheid, bepaal dan volgens dezelfde procedure de EC 50.48 h en geef daarbij de aard van het effect aan.
Bestelformulier Stuur naar: NEN Standards Products & Services t.a.v. afdeling Klantenservice Antwoordnummer 10214 2600 WB Delft NEN Standards Products & Services Postbus 5059 2600 GB Delft Vlinderweg 6 2623 AX Delft Ja, ik bestel ex. NEN 6501:1980 nl Water - Bepaling van de acute toxiciteit met behulp van Daphnia magna 24.00 T (015) 2 690 390 F (015) 2 690 271 www.nen.nl/normshop Wilt u deze norm in PDF-formaat? Deze bestelt u eenvoudig via www.nen.nl/normshop Gratis e-mailnieuwsbrieven Wilt u op de hoogte blijven van de laatste ontwikkelingen op het gebied van normen, normalisatie en regelgeving? Neem dan een gratis abonnement op een van onze e-mailnieuwsbrieven. www.nen.nl/nieuwsbrieven Gegevens Bedrijf / Instelling T.a.v. O M O V E-mail Klantnummer NEN Uw ordernummer BTW nummer Postbus / Adres Postcode Plaats Telefoon Fax Factuuradres (indien dit afwijkt van bovenstaand adres) Postbus / Adres Postcode Plaats Datum Handtekening Retourneren Fax: 015 2 690 271 E-mail: klantenservice@nen.nl Post: NEN Standards Products & Services, t.a.v. afdeling Klantenservice Antwoordnummer 10214, 2600 WB Delft (geen postzegel nodig). Voorwaarden De prijzen zijn geldig tot 31 december 2018, tenzij anders aangegeven. Alle prijzen zijn excl. btw, verzend- en handelingskosten en onder voorbehoud bij o.m. ISO- en IEC-normen. Bestelt u via de normshop een pdf, dan betaalt u geen handeling en verzendkosten. Meer informatie: telefoon 015 2 690 391, dagelijks van 8.30 tot 17.00 uur. Wijzigingen en typefouten in teksten en prijsinformatie voorbehouden. U kunt onze algemene voorwaarden terugvinden op: www.nen.nl/leveringsvoorwaarden. LEREN, WERKEN EN GROEIEN MET NEN preview - 2018