Molecular identification and targeting of colorectal cancer stem cells Kemper, K.

Transcriptie

1 UvA-DARE (Digital Academic Repository) Molecular identification and targeting of colorectal cancer stem cells Kemper, K. Link to publication Citation for published version (APA): Kemper, K. (2012). Molecular identification and targeting of colorectal cancer stem cells General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please send a message to: UBAcoach or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam ( Download date: 02 jan. 2017

2 Chapter 9 Nederlandse samenvatting De darm Een belangrijk onderdeel van het menselijk lichaam is het maag-darmstelsel. Dit zorgt voor de vertering en opname van belangrijke voedingstoffen van ingenomen voedsel. In de dunne darm vindt het belangrijkste deel van deze spijsvertering en opname van vrijgekomen bruikbare stoffen plaats. Hierna zorgt de dikke darm voor de onttrekking van zout en water uit de onverteerbare resten, dat dan indikt tot wat later de ontlasting wordt. De wand van zowel de dunne als de dikke darm is hevig geplooid en bestaat uit instulpingen en uitstulpingen, genaamd crypten en villi. In zowel de crypten als de villi zitten verschillende typen gespecialiseerde cellen die werkzaam zijn in de spijsvertering. Zo zijn er slijmproducerende cellen (slijmbekercellen), voedselopnemende cellen (enterocyten) en hormoonproducerende cellen (enteroendocrience cellen). Iedere drie tot zeven dagen vernieuwt deze hele rij met gespecialiseerde cellen zich. Om de oude cellen te vervangen, moeten nieuwe cellen worden aangemaakt. Deze worden gefabriceerd door een type ongespecialiseerde cellen, de stamcellen, die zich onder in de crypt bevinden. Door deling worden meer cellen aangemaakt die zich vervolgens, door een proces dat differentiatie wordt genoemd, zich specialiseren in één van de hierboven genoemde celtypen en zich omhoog bewegen richting de top van de villus. Dit hele proces van celdeling, differentiatie en uiteindelijk celdood is strak geregeld. Ontregeling van één van deze processen leidt vaak tot kanker. Kankerstamcellen in darmkanker Dikke darmkanker, ook wel colonkanker genoemd, staat in de top vijf van de meest voorkomende kanker in Nederland, zowel bij mannen als bij vrouwen. Zoals hierboven beschreven voor de gezonde darm, lijkt het er op dat cellen in een dikke darmtumor ook niet allemaal hetzelfde zijn: sommigen lijken meer op een stamcel, terwijl anderen meer gespecialiseerd zijn. Uit deze observering is het idee ontstaan dat tumoren ook een hiërarchie hebben, waarbij de stamcelachtige cellen zorgen voor de aanmaak van de nieuwe cellen. Hierdoor zijn zij waarschijnlijk verantwoordelijk voor tumorinitiatie, -groei en -uitzaaiing. Deze cellen worden daarom kankerstamcellen of tumorinitiërende cellen genoemd. Belangrijk is om deze cellen te kunnen identificeren en te onderzoeken hoe ze functioneren, zodat we later eventueel specifieke therapieën kunnen ontwikkelen om deze cellen aan te pakken. 174

3 Nederlandse samenvatting In Hoofdstuk 1 wordt een introductie gegeven over het identificeren van kankerstamcellen in dikke darmkanker. Dit wordt gedaan met behulp van zogenaamde markers. Markers zijn eiwitten die tot expressie komen op de buitenkant van de cel, waardoor ze kunnen worden gebruikt als een soort vlaggetje dat aangeeft wat voor type cel het is. Naast uitleg over het gebruik van verschillende markers, wordt in dit hoofdstuk ook de optie besproken om deze markers te gebruiken voor therapie. Hoofdstuk 2 focust meer op de daadwerkelijke kankerstamcellen uit de dikke darmtumoren en laat zien dat deze ook gekweekt kunnen worden. Dit betekent dat ze in leven kunnen worden gehouden buiten het menselijk lichaam. Hiervoor worden tumorcellen, geïsoleerd uit dikke darmtumoren, in speciale petrischaaltjes geplaatst en gevoed met specifiek medium. Hierdoor overleven specifiek de kankerstamcellen en groeien deze uit als ronde bollen gevormd uit meerdere cellen, ook wel sferoïden genoemd. Deze sferoïden kunnen vervolgens worden gedifferentieerd in gespecialiseerde celtypes. Dit kweken van cellen wordt in vitro werk genoemd. Sferoïden in kweek brengen vele kankerstamcelmarkers tot expressie, zoals CD24, CD29, CD44, CD133, CD166 en Lgr5. Tevens is slechts één cel uit de sferoïdenkweek genoeg om een tumor te vormen in muizen (dit wordt in vivo werk genoemd), die dan weer dezelfde hiërarchie (met stamcellen en gedifferentieerde cellen) laat zien als de tumoren die uit patiënten worden geanalyseerd. Een sferoïdenkweek is dus een mooie manier om kankerstamcellen in het lab te kunnen bestuderen. CD133 is een marker voor dikke darmkankerstamcellen In Hoofdstuk 3, 4 en 5 wordt meer ingegaan op één van de kankerstamcelmarkers, namelijk een eiwit genaamd CD133 (mens) of prominin-1 (muis). In hoofdstuk 3 wordt de expressie van verschillende varianten van dit eiwit, zogenoemde knipvarianten bestudeerd in diverse weefsels van muizen. Het blijkt dat elk weefsel veel verschillende CD133 varianten tot expressie brengt, maar dat in het oog er één specifieke variant is die ook nog specifiek gereguleerd lijkt te worden. Dit zou kunnen verklaren dat muizen die het CD133 gen missen of mensen die een mutatie in dit gen hebben, last hebben van blindheid. Hoofdstuk 4 beschrijft de aanwezigheid van CD133 op dikke darmkankerstamcellen en gedifferentieerde tumorcellen. Verrassend genoeg vinden we dat deze kankerstamcelmarker zowel door de stamcel als door de gedifferentieerde cellen in de tumor tot expressie worden gebracht. Het enige verschil is dat het eiwit net iets groter is in de kankerstamcellen. Dit grootteverschil wordt veroorzaakt door een verschil in de hoeveelheid suikerketens die aan het CD133 eiwit vastzitten, een 9 175

4 Chapter 9 proces dat glycosylatie wordt genoemd. Het glycosylatieverschil zorgt ervoor dat antilichamen, die worden gebruikt voor de herkenning van CD133, wel CD133 op kankerstamcellen kunnen herkennen, maar niet het kleinere (met minder suikerketens) CD133 dat tot expressie wordt gebracht op de gedifferentieerde tumorcellen. Deze vinding is van belang voor het onderzoek dat wordt gedaan met behulp van deze marker: binnen de biomedische wetenschap is er namelijk discussie over het gebruik van CD133 als marker. Wij laten in dit hoofdstuk zien dat CD133 prima kan worden gebruikt als kankerstamcelmarker, indien de correcte methode wordt gebruikt. Naast het gebruik als marker voor kankerstamcellen, wordt CD133 ook vaak gebruikt voor het maken van een inschatting van de prognose van patiënten met dikke darmkanker. Hoofdstuk 5 laat zien dat de hoeveelheid RNA expressie van CD133 in een groep van dikke darmkankerpatiënten kan voorspellen of een patiënt na chirurgische verwijdering van de tumor uiteindelijk weer de kanker terug zal krijgen. Hoge RNA expressie van CD133 voorspelt dat de patiënt meer kans heeft op teruggroei of uitzaaiing van de tumor. Het is opmerkelijk dat hoge RNA expressie van andere kankerstamcelmarkers, zoals CD24, CD29, CD44, CD166 en Lgr5, geen voorspellende waarde heeft. Hierdoor is het onwaarschijnlijk dat hoge CD133 RNA expressie daadwerkelijk aangeeft dat er meer kankerstamcellen in een tumor zitten. In dit hoofdstuk laten we zien dat CD133 expressie wordt gereguleerd door een signaaltransductieroute (het doorgeven van signalen door middel van eiwitten) genaamd de Ras-Raf-MEK-ERK route. Belangrijke genen in deze signaaltransductieroute zijn K-Ras en B-Raf. Deze genen zijn vaak gemuteerd in dikke darmkanker, waardoor de activiteit van signalering omhoog gaat. Tumoren met een mutatie in één van deze genen of met verhoogde activiteit van de Ras-Raf-MEK-ERK route hebben ook een hogere CD133 expressie. Hiermee tonen we aan dat RNA expressie van CD133 in een tumor de activiteit van deze signaaltransductieroute aangeeft en niet de hoeveelheid kankerstamcellen in een tumor. Lgr5 is nieuwe marker voor dikke darmkankerstamcellen Zoals hierboven beschreven zitten er nogal wat haken en ogen aan de CD133 marker. De functie van dit eiwit is nog niet bekend en het is onduidelijk waarom CD133 op dikke darmkankercellen tot expressie komt. Het zou beter zijn om een marker te gebruiken waarvan daadwerkelijk de functie in kankerstamcellen bekend is. Het eiwit Lgr5 zou een mooie functionele marker kunnen zijn. Lgr5 speelt een grote rol in de Wnt signaaltransductieroute, die van belang is bij het behouden van normale stamcellen in de darm. 176

5 Nederlandse samenvatting In hoofdstuk 6 wordt aangetoond dat Lgr5 als marker kan worden gebruikt voor dikke darmkankerstamcellen. Met speciaal hiervoor ontwikkelde antilichamen kunnen tumorcellen worden herkend die ongedifferentieerd zijn en als sferoïden kunnen worden gekweekt. Deze sferoïdenkweken verliezen Lgr5 als ze zich differentiëren, wat een kenmerk is van een kankerstamcelmarker. Tevens zijn de Lgr5-positieve tumorcellen beter in tumoren vormen in vergelijking tot de Lgr5-negatieve (gedifferentieerde) tumorcellen, als ze geïnjecteerd worden in muizen. Deze selectie voor de tumorcellen die daadwerkelijk verantwoordelijk zijn voor de tumorgroei, is één van de belangrijkste eigenschappen die een kankerstamcelmarker moet hebben. Kortom, Lgr5 kan worden gebruikt voor het identificeren van dikke darmkankerstamcellen. Doden van kankerstamcellen met induceerbaar caspase-9 Om kanker in patiënten te behandelen wordt vaak chemo- of radiotherapie gebruikt, waardoor celdood wordt geïnduceerd in tumorcellen. Deze vorm van celdood, genaamd apoptosis, is een proces dat verloopt volgens een nauw gecontroleerde reeks van stappen waarbij verschillende eiwitten een rol spelen. De eiwitten die uiteindelijk verantwoordelijk zijn voor de uitvoering van celdood zijn de caspases. Dit zijn enzymen die zorgen voor het afbreken van DNA en eiwitten in de cel, zodat deze netjes wordt opgeruimd. Caspase-9 is één van de enzymen die zich helemaal onderin deze kettingreactie bevindt. Door het fysiek dicht bijeenkomen van twee caspase-9 moleculen, worden deze geactiveerd en kunnen zij hun werk doen. Recentelijk is een induceerbaar caspase-9 systeem ontwikkeld, waarbij het caspase-9 molecuul is gefuseerd met een domein wat een chemische stof, genaamd dimerizeerder, kan binden. Eén dimerizeerder molecuul bindt dan twee caspase-9 moleculen, waardoor deze worden geactiveerd. Van kankerstamcellen is het bekend dat ze resistent zijn tegen gewone chemotherapie. In hoofdstuk 7 laten we zien dat deze kankerstamcellen wel gedood worden door het induceerbare caspase-9 systeem. Toevoeging van dimerizer aan kankerstamcellen, die de induceerbare caspase-9 tot expressie brengen, zorgt voor snelle inductie van celdood in kweek (in vitro). Wanneer deze kankerstamcellen worden ingespoten in muizen, krijgen die tumoren. Behandeling met de dimerizer induceert dan een afname van de tumorgrootte of remt volledig de uitgroei van tumoren, afhankelijk van het tijdstip en frequentie van behandeling. Helaas kunnen we dit induceerbaar caspase-9 systeem niet als therapie in mensen gebruiken, omdat dit construct eerst tot expressie moet worden gebracht in tumorcellen. Deze vorm van genetische modificatie in de mens is niet wenselijk. Wel 9 177

6 Chapter 9 zou het caspase-9 systeem een mooi gereedschap zijn in het onderzoek naar de rol van kankerstamcellen in groeiende tumor in muizen. Door de induceerbare caspase-9 onder de regulatie van een kankerstamcelmarker te plaatsen, zou het specifiek in kankerstamcellen tot expressie kunnen worden gebracht. Behandeling van muizen met dimerizer zou dan specifiek de kankerstamcellen doden, waardoor het effect van hun aanwezigheid op tumorgroei en de interactie met de tumoromgeving kunnen worden bestudeerd. Over dit onderwerp bestaan nog veel wetenschappelijke vragen waar het caspase-9 systeem meer duidelijkheid zou kunnen geven. 178