Citation for published version (APA): Frederiks, F. (2010). Function and regulation of the histone methyltransferase Dot1

Transcriptie

1 UvA-DARE (Digital Academic Repository) Function and regulation of the histone methyltransferase Dot1 Frederiks, F. Link to publication Citation for published version (APA): Frederiks, F. (2010). Function and regulation of the histone methyltransferase Dot1 General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam ( Download date: 30 Dec 2018

2 Samenvatting Het DNA in de kern van een eukaryote cel gaat interacties aan met een groot aantal verschillende eiwitten. Het DNA eiwit complex dat ontstaat uit deze interacties wordt chromatine genoemd. Chromatine bevat de genetische informatie die de processen in de cel stuurt. De belangrijkste eiwitten in chromatine zijn de histonen, die zorgen voor het inpakken van het DNA. Ongeveer 147 baseparen van de dubbele helix van DNA worden om een octameer van histoneiwitten gewikkeld en vormen zo een nucleosoom, de basiseenheid van chromatine. De structuur van een nucleosoom wordt vaak vergeleken met een draad die rond een spoel gewikkeld is. Eén nucleosoom bevat twee kopieën van elk van de histonen H2A, H2B, H3 en H4. Histonen kunnen veel verschillende post translationele modificaties bevatten, zoals methylering, acetylering en fosforylering. Histonmodificaties beïnvloeden veel van de processen die plaatsvinden op het DNA, zoals transcriptie, DNA reparatie en replicatie. Het onderwerp van dit proefschrift is de methylering van lysine 79 op histon H3 (H3K79) door de histon methyltransferase Dot1. Dot1 is ontdekt in Saccharomyces cerevisiae, waar het betrokken is bij het stilleggen van genen, de respons na DNA schade, het pachyteen checkpoint tijdens meiose en de opbouw van de celwand. Eiwitten homoloog aan gist Dot1 zijn gevonden in een groot aantal verschillende organismen, van de eencellige parasiet Trypanosoma brucei tot mensen. In zoogdieren is Dot1 betrokken bij genrepressie, maar ook bij misplaatste genactivatie in bepaalde vormen van leukemie. Het onderzoek dat beschreven wordt in dit proefschrift had tot doel meer inzicht te krijgen in de functies en de regulatie van Dot1 in gist. In Hoofdstuk 1 wordt een overzicht gegeven van de huidige stand van het onderzoek op dit gebied, met een focus op de openstaande vragen. Verder worden de resultaten van onze experimenten bediscussieerd in de context van de data van andere onderzoekers. In Hoofdstuk 2 richten we ons op de rol van Dot1 in het stilleggen van de telomeren en de stille mating type loci (die het voor een gistcel mogelijk maken om van mating type te wisselen). Dot1 methyleert het overgrote deel van de nucleosomen in gist, maar het niveau van H3K79 methylering in stil chromatine is laag. Waarschijnlijk zorgt dit lage niveau van H3K79 methylering ervoor dat het Sir complex van stilte eiwitten kan binden aan deze delen van het genoom. Als gevolg hiervan wordt het binden van Dot1 aan deze delen voorkomen 173

3 en blijft het methyleringsniveau laag. Met behulp van een genoom omvattende screen hebben we aangetoond dat cellen die zowel Dot1 als Sir1 (een bekend stilte eiwit) missen een groot defect hebben in het stilleggen van het stille mating type locus HML. Dit fenotype van stillegging, evenals een verminderde stillegging van de telomeren, had Dot1 gemeen met het NatA acetyltransferase complex, dat het stilte eiwit Sir3 acetyleert. Ook mutaties in de N terminus van Sir3 resulteerden in dezelfde fenotypes van stillegging. Vervolgexperimenten lieten zien dat deze drie factoren een gemeenschappelijk proces beïnvloedden: bij afwezigheid van elk van de factoren verloor Sir3 de specifieke binding aan stil chromatine en raakte het herverdeeld over het genoom. Onze resultaten en die van anderen suggereren dat Dot1 en Sir3 beide binden aan het deel van het nucleosoom rond H3K79 en dat acetylering van de N terminus van Sir3 de specifieke binding van Sir3 aan ongemethyleerd H3K79 bepaalt. Dot1 is verantwoordelijk voor mono, di en trimethylering van H3K79. In Hoofdstuk 3 laten we zien dat Dot1 H3K79 methyleert via een distributief of hitand run mechanisme, zowel in vitro als in vivo. Na elke methyleringsronde dissocieert het enzym van het lysine substraat, wat tot gevolg heeft dat de activiteit van Dot1 de verhouding tussen de verschillende methyleringstoestanden van H3K79 bepaalt. Dit resultaat heeft ons geholpen bij het begrijpen van de regulatie van Dot1 door een andere histonmodificatie, ubiquitinering van histon H2B. Bij afwezigheid van deze modificatie verdwijnt de trimethylering van H3K79 en is het niveau van dimethylering verlaagd. Het is lang onduidelijk geweest of deze vermindering van H3K79 methylering het resultaat was van specifieke regulatie van de hogere methyleringstoestanden door H2B ubiquitinering. Wij vermoedden dat de regulatie wellicht a specifiek is, aangezien dit methyleringspatroon ook past bij een verlaging van de algehele activiteit van Dot1. Dit bleek inderdaad het geval: als katalytisch verzwakte mutanten van Dot1, die slechts mono en dimethylering genereren, tot expressie gebracht werden in cellen zonder geübiquitineerd H2B, leidde dit tot het verlies van alle H3K79 methylering (Hoofdstukken 3 en 4). Dit betekent dat ook monomethylering van H3K79 gereguleerd wordt door H2B ubiquitinering. Het lijkt daarom waarschijnlijk dat ubiquitinering van H2B de algemene activiteit van Dot1 stimuleert. Het distributieve mechanisme van methylering suggereert dat Dot1 geen specifieke methyleringstoestand van een bepaalde lysine kan genereren. Deze gemethyleerde lysine kan immers altijd een substraat zijn voor verdere methylering. Dit doet vermoeden dat, in tegenstelling tot wat is aangetoond voor een aantal andere gemethyleerde lysines, de verschillende methylerings 174

4 Samenvatting toestanden van H3K79 misschien geen specifieke functies hebben. Inderdaad hebben wij gevonden dat het totale niveau van H3K79 methylering en niet een specifieke methyleringstoestand bepalend is voor de sterkte van telomere stillegging (Hoofdstuk 3). Om meer inzicht te krijgen in de methylering van H3K79 door Dot1 besloten we om een systeembiologische aanpak te gebruiken. Met behulp van de kwantitatieve proteomics data die we in onze eerdere experimenten hadden verkregen, stelden we een wiskundig model op om de dynamiek van in vivo H3K79 methylering te simuleren. Dit model suggereerde dat de snelheidsconstanten voor alle H3K79 methyleringsreacties verlaagd waren in cellen zonder H2B ubiquitinering, zoals ook werd voorspeld door onze experimentele data (Hoofdstuk 4). Verder voorspelden de simulaties dat het patroon van H3K79 methylering voortdurend verandert tijdens de celcyclus en geen steady state bereikt. In plaats daarvan accumuleert H3K79 methylering op histonen als ze ouder worden, wat suggereert dat de modificatie fungeert als een epigenetische klok, die de tijd meet die verstreken is sinds de de depositie van nieuwe histonen, die plaatsvindt tijdens replicatie en ook gedurende de rest van de celcyclus. We hebben dit idee ook experimenteel onderbouwd door het opzuiveren van oude en nieuw gesynthetiseerde histonen, waarbij aangetoond werd dat de oude histonen relatief meer getrimethyleerd H3K79 bevatten. In tegenstelling tot gist en zoogdieren heeft Trypanosoma brucei twee Dot1 eiwitten, genaamd DOT1A en DOT1B. De methylering van H3K76 (de T. brucei homoloog van H3K79) door deze enzymen is celcyclus gereguleerd. Om verschillende redenen is het lastig om de activiteit van deze enzymen in T. brucei of in vitro te bestuderen. Daarom hebben we een heteroloog expressiesysteem in gist ontwikkeld (Hoofdstuk 5). Expressie van beide enzymen afzonderlijk liet zien dat ze een verschillende activiteit hebben: DOT1A genereert vooral dimethylering van H3K79, terwijl DOT1B voornamelijk trimethyleert en daarbij geen eerdere dimethylering door DOT1A nodig heeft. Ook vonden we dat de activiteit van DOT1A en DOT1B niet gereguleerd werd door de staart van histon H4, dit in tegenstelling tot de activiteit van gist Dot1. Verder stimuleerde geübiquitineerd H2B wel de activiteit van DOT1A, maar niet die van DOT1B. Deze resultaten helpen bij het verklaren van de manier waarop de activiteit van DOT1A en DOT1B gereguleerd wordt gedurende de celcyclus in T. brucei. Detectie van gist Dot1 met behulp van immunoblots laat zien dat er twee Dot1 eiwitten zijn, die een klein verschil in grootte hebben. Met behulp van mutagenese experimenten hebben we aangetoond dat deze twee isovormen verschillende translatieproducten zijn, die het resultaat zijn van leaky scanning 175

5 door het ribosoom (Hoofdstuk 6). Bij leaky scanning begint het ribosoom niet altijd de translatie bij het eerste start codon dat het tegenkomt op het mrna: regelmatig slaat het dit eerste start codon over en begint de translatie bij het volgende benedenstroomse start codon. In het geval van Dot1 worden zowel AUG1 als AUG17 gebruikt voor translatie initiatie. De oorzaken van leaky scanning worden nog niet goed begrepen, maar het meest gebruikte model zegt dat de directe context van het start codon (Kozak sequentie) en/of sequenties bovenstrooms bepalend zijn voor de efficiëntie van translatie initiatie. Wij vonden een alternatief mechanisme: de leaky scanning van het Dot1 transcript wordt bepaald door de verder benedenstrooms gelegen coderende sequentie van het gen. Expressie van elk van beide Dot1 isovormen afzonderlijk liet zien dat ze allebei in staat waren een normaal niveau van H3K79 methylering te genereren. Als gevolg hiervan had de expressie van slechts één van de isovormen geen effect op het stilleggen van de telomeren of op het DNA schade checkpoint in G1/S, twee processen die afhankelijk zijn van een normaal niveau van H3K79 methylering. Expressie van alleen de korte isovorm van Dot1 zorgde echter wel voor een verandering in de weerstand van de cellen tegen de chitine bindende stof Calcofluor White, een indicatie van een defect in de opbouw van de celwand. Bovendien vonden we dat overexpressie van Dot1 resulteerde in duidelijke veranderingen in de celwand, wat de rol van Dot1 in dit proces onderstreepte. Hoofdstuk 7 ten slotte richt zich op de rol van Dot1 in het UVgeïnduceerde DNA schade checkpoint. Een aantal onderzoeksgroepen heeft gerapporteerd dat methylering van H3K79 noodzakelijk is voor juiste activatie van het centrale checkpoint kinase Rad53 na UV schade in G1/S. Wij vonden echter dat dit effect deels afhankelijk is van de achtergrond van de giststam die gebruikt wordt voor de experimenten. In de W303 achtergrond, die werd gebruikt door de andere groepen, was de functie van Dot1 redundant met die van het DNAreparatie eiwit Rad5. Afwezigheid van beide eiwitten zorgde voor een sterkere reductie in de activatie van het checkpoint dan afwezigheid van slechts een van beide. Deze redundantie vonden we echter niet in de S288C stamachtergrond. Het lijkt daarom waarschijnlijk dat er andere factoren zijn die samenwerken met Dot1 in de DNA schade respons in deze achtergrond. Ten slotte vonden we dat inductie van UV schade geen verandering teweeg brengt in het globale niveau van H3K79 methylering, wat suggereert dat dit niveau niet de beperkende factor is in de activatie van het checkpoint. Samenvattend heeft ons onderzoek nieuwe inzichten opgeleverd in het mechanisme, de regulatie en de functies van H3K79 methylering in gist. Studies 176

6 Samenvatting als de onze dragen bij aan onze fundamentele kennis van de functies van chromatine in gistcellen, maar ook aan ons begrip van de manieren waarop de regulatie van de activiteit van Dot1 mis kan gaan in leukemie bij mensen. 177