DNA-onderzoek van minimale biologische sporen; gevoelige problematiek

Transcriptie

1 PROF. DR. A.D. KLOOSTERMAN EN DRS. A.J. MEULENBROEK * DNA-onderzoek van minimale biologische sporen; gevoelige problematiek Het standaard forensisch DNA-onderzoek is één van de meest onderzochte, robuuste en betrouwbare wetenschappelijke technieken die bij de waarheidsvinding in strafzaken kan worden ingezet. Het onderzoek is gericht op het verkrijgen van een DNA-profiel uit biologisch celmateriaal. DNA-profielen kunnen met elkaar worden vergeleken en daardoor een zeer sterke aanwijzing geven over de herkomst van een biologisch spoor. Nieuwe ontwikkelingen maken het mogelijk om van steeds kleinere hoeveelheden sporenmateriaal een DNA-profiel te verkrijgen. Onder laboratorium - omstandigheden kan tegenwoordig zelfs van één enkele cel een DNA-profiel worden verkregen. Deze extreem gevoelige technieken, de zogenoemde Low Copy Number (LCN) DNA-analyse, worden tegenwoordig ook bij het DNA-onderzoek van minimale biologische sporen ingezet. Minimale biologische sporen betreffen meestal bemonsteringen van mogelijke contactsporen waarin enkele huidcellen aanwezig kunnen zijn. DNA-onderzoek van deze sporen kan van cruciaal belang zijn voor de opsporing en/of de bewijsvoering. Hoewel de LCN DNA-analysemethoden zich in de forensische praktijk inmiddels hebben bewezen, moet men bedacht zijn op een aantal complicerende neveneffecten die inherent zijn aan DNA-onderzoek van zeer kleine hoeveelheden celmateriaal. Met deze neveneffecten moet nadrukkelijk rekening worden gehouden bij het analyseren en interpreteren van de DNA-profielen die van de minimale biologische sporen zijn verkregen. Door het LCN DNA-onderzoek uit te voeren volgens vaststaand protocol, en de analyse en interpretatie te verrichten volgens een alle stappen omvattende leidraad, worden betrouwbare LCN DNA-profielen verkregen voor een objectief vergelijkend DNAonderzoek. Hierbij moet wel worden opgemerkt dat verkregen resultaten van DNA-onderzoek van minimale biologische sporen uitermate complex kunnen zijn en dat hieruit getrokken conclusies bepaald niet altijd eenduidig zijn. Daarom is het essentieel dat het LCN DNA-onderzoek wordt uitgevoerd door een hiervoor geaccrediteerd laboratorium en dat het interpreteren van de LCN DNA-analyseresultaten door ten minste twee gerechtelijke deskundigen, onafhankelijk van elkaar, wordt uitgevoerd. Tot slot is voorzichtigheid geboden bij het interpreteren van de conclusies van het DNA-onderzoek van minimale biologische sporen in de context van het misdrijf. De delictgerelateerdheid van minimale biologische sporen is immers vaak minder duidelijk dan die van gemakkelijk aantoonbare hoeveelheden bloed of sperma. Specificiteit, gevoeligheid en betrouwbaarheid Bij de waarheidsvinding in gewelds- en zedenmisdrijven speelt DNA-onderzoek van biologische sporen zoals bloed, sperma, speeksel, haren en contactsporen een belangrijke rol. Zonder te overdrijven kan worden gesteld dat DNA-onderzoek binnen zeer korte tijd de mogelijkheden van het forensisch onderzoek revolutionair heeft veranderd. Het forensisch DNA-onderzoek heeft zijn opkomst te danken aan drie eigenschappen, die voor elk wetenschappelijk diagnostisch onderzoek van cruciaal belang zijn: specificiteit, gevoeligheid en betrouwbaarheid. Bij DNA-onderzoek staat specificiteit voor de zeldzaamheid van het DNA-profiel en gevoeligheid voor de geringe hoeveelheid biologisch sporenmateriaal (DNA) dat voor het DNA-onderzoek nodig is. De betrouwbaarheid en robuustheid van de gebruikte techniek, apparatuur en reagentia is aangetoond door validatiestudies en uitgebreid kwaliteitsonderzoek bij forensische laboratoria. Het spreekt haast voor zich dat het juist deze drie wapenfeiten van het DNA-onderzoek zijn die binnen en buiten het strafrechtsysteem altijd kritisch zijn gevolgd. Over de zeldzaamheid van DNA-profielen bestaat inmiddels breed gedragen wetenschappelijke consensus 1 : elk volledig DNA-profiel is extreem zeldzaam en komt met een frequentie van minder dan één op één miljard voor. Door deze zeldzaamheid kan aan de hand van een achtergelaten biologisch spoor diegene van wie dit spoor afkomstig is met een hoge mate van zekerheid worden geïdentificeerd. Anderzijds kunnen personen van wie het DNA-profiel niet matcht met dat van het spoor worden uitgesloten als donor van het desbetreffende spoor. Het huidige DNA-onderzoek is buitengewoon gevoelig. In de afgelopen twee decennia is de techniek van forensisch DNA-onderzoek honderd duizend keer gevoeliger geworden. Moest in de beginjaren het spoor nog de grootte hebben van een munt van twee eurocent, tegenwoordig kan uit nauwelijks zichtbare sporen al een DNA-profiel worden verkregen. Ondanks de hoge gevoeligheid blijkt het DNA-onderzoek in de praktijk betrouwbaar en robuust. Daardoor kunnen ook uit kleine biologische sporen reproduceerbare en informatieve DNA-profielen worden verkregen. * Prof. dr. A.D. Kloosterman en drs. A.J. Meulenbroek zijn beiden vaste gerechtelijke deskundige Biologische sporen en DNA-onderzoek bij het Nederlands Forensisch Instituut (NFI). Prof. dr. A.D. Kloosterman is tevens bijzonder hoogleraar Forensische Biologie, Universiteit van Amsterdam. 108

2 Onderzoek van minimale biologische sporen Ondanks dat het standaard DNA-onderzoek zeer gevoelig is, is het niet gevoelig genoeg voor zeer minimale biologische sporen. Dergelijke sporen bevatten slechts een zeer geringe hoeveelheid biologisch sporenmateriaal en daardoor zeer weinig DNA. Vaak gaat het om zogenoemde biologische contactsporen, zoals gebruikssporen, greepsporen of aanraaksporen. Hoewel van deze minuscule hoeveelheden biologisch celmateriaal de exacte aard niet is vast te stellen, gaat het vermoedelijk meestal om huidcellen. 2 Om uit dergelijke sporen een DNA-profiel te verkrijgen kan men de Low Copy Number (LCN) DNA-analysemethoden inzetten. LCN DNA-analyse maakt gebruik van dezelfde technieken en dezelfde DNA-analysesystemen als de standaard DNA-analyse, maar is op een aantal cruciale punten aangepast. De gevoeligheid van de techniek vereist bij het analyseren en het interpreteren van de hiermee verkregen DNA-profielen een andere aanpak dan van DNA-profielen die met de standaard DNA-analyse zijn verkregen. De laatste jaren wordt LCN DNAonderzoek in Nederland bij onderzoek van minimale biologische sporen regelmatig toegepast. Van deze onderzoeken kreeg het onderzoek in de zogenoemde Schiedammer parkmoord veel (media)aandacht. Ook in Engeland werd LCN DNA-onderzoek voorpaginanieuws. Het betrof het DNA-onderzoek van minimale biologische sporen (op onderdelen van explosieven) in de zaak van de bomaanslag van de IRA in 1998 in de Ierse stad Omagh. Was in de Schiedammer parkmoord discussie over de interpretatie van de verkregen DNAprofielen, in de Omagh-zaak werd de wijze van veiligstellen en de betrouwbaarheid van DNA-onderzoek van minimale biologische sporen aangevochten. Beide onderzoeken zijn later door verschillende gerechtelijke DNA-deskundigen van andere, op dit gebied gespecialiseerde en geaccrediteerde laboratoria, onderworpen aan onafhankelijke review studies. 3,4,5,6 Deze studies toonden aan dat zowel in de Schiedammer parkmoord als in de Omagh-zaak het DNA-onderzoek van de minimale biologische sporen volgens de stand der techniek was uitgevoerd. Uit de reviews van de Schiedammer parkmoord kwam wel naar voren dat in DNA-deskundigenrapporten meer informatie over de gehanteerde onderzoeksmethoden en de onderzoeksresultaten diende te worden vermeld. 7,8 De ontstane misvattingen over het LCN DNA-onderzoek en de hierbij verkregen resultaten in de Schiedammer parkmoord en de Omagh-zaak hebben bovendien duidelijk gemaakt dat alle partijen in de strafrechtketen vollediger geïnformeerd moeten worden over DNA-onderzoek van minimale biologische sporen. Deze publicatie wil hieraan een belangrijke bijdrage leveren. De DNA-fingerprint; gevoeligheid: 1000 nanogram (1 microgram) DNA In 1985 beschreef de Britse wetenschapper Sir Alec Jeffreys 9 zijn ontdekking van hypervariabele gebieden in die delen van het DNA die niet coderen voor erfelijke eigenschappen. Deze hypervariabele gebieden bestaan uit zich herhalende, korte stukjes DNA (repeterend DNA). In de hypervariabele gebieden kan het aantal herhalingen van de korte stukjes DNA per individu sterk variëren, met als gevolg dat de lengte van zo n gebied sterk kan verschillen van persoon tot persoon. Op basis hiervan kon Jeffreys nagenoeg individuspecifieke DNA-profielen genereren. Hypervariabele gebieden zijn daarom heel geschikt om biologische sporen naar personen te herleiden. Jeffreys noemde zijn ontdekking de DNA-fingerprint (DNA-vingerafdruk), omdat het bandjespatroon van het DNA-profiel vrijwel individuspecifiek is en wat betreft zeldzaamheid kan wedijveren met de klassieke vingerafdruk. Met de DNA-fingerprintmethode van Jeffreys kon men in één keer een groot aantal hypervariabele gebieden zichtbaar maken. Jeffreys wetenschappelijke doorbraak werd binnen een jaar na de ontdekking al in het forensisch sporenonderzoek geïmplementeerd. 10 Vrijwel direct bewees de nieuwe technologie zijn grote waarde door een cruciale rol te spelen in de oplossing van enkele ernstige misdrijven. 11 DNA-onderzoek was vanaf dat moment niet meer weg te denken in het forensisch onderzoek van biologische sporen. Toch kende de DNA-finger - printmethode drie belangrijke beperkingen. De eerste beperking was dat er relatief veel DNA, en dus sporenmateriaal nodig was om een DNA-finger - print te vervaardigen. Er bleek ongeveer één microgram (een miljoenste gram) DNA nodig voor het verkrijgen van een DNA-fingerprint. De tweede beperking was dat de kwaliteit van het DNA in het spoor zeer goed moest zijn. De condities waaronder de biologische sporen worden aangetroffen, bemonsterd en bewaard zijn daarbij van cruciaal belang. Als het biologische spoor niet onderhevig is geweest aan hoge temperaturen, vocht, direct zonlicht of micro-organismen, dan zal het DNA nauwelijks aan afbraak onderhevig zijn en is succesvol DNA-onderzoek zelfs na zeer veel jaren mogelijk. Is aan de criteria koel, droog en buiten direct zonlicht niet voldaan, dan moet men er rekening mee houden dat DNA kan zijn afgebroken en DNA-onderzoek niet mogelijk is, zelfs als de monsters oorspronkelijk zeer veel DNA bevatten (zoals referentiemonsters genomen van zachte weefseldelen, bijvoorbeeld spierweefsel van waterlijken). Ondanks dat de zeer hoge eisen die in de beginjaren aan de kwaliteit van het DNA werden gesteld niet meer noodzakelijk zijn voor het huidige forensische DNA-onderzoek, zijn de genoemde criteria nog steeds bepalend voor succesvol DNA-onderzoek. De derde beperking was dat de DNA-profielen verkregen met de DNA-fingerprintmethode niet geschikt waren voor opname in een geautomatiseerde DNAdatabank. Het resultaat van de DNA-fingerprintmethode was zichtbaar als een patroon van bandjes. Dit kon niet worden gedigitaliseerd en als zodanig worden opgeslagen. 109

3 Tabel 1. Een overzicht van de hoeveelheid DNA die grofweg in verschillende biologische sporen aanwezig is. Uit deze gegevens wordt duidelijk dat een bloedspoor van ongeveer twee vierkante centimeter voldoende DNA (ongeveer 1000 nanogram) bevat voor het maken van een DNA-fingerprint. Type spoor Hoeveelheid DNA vloeibaar bloed ng / ml bloedspoor ng / cm 2 vloeibaar sperma ng / ml schede-uitstrijkje na gemeenschap ng / uitstrijkje haarwortel van uitgetrokken haar ng / haarwortel haarwortel van uitgevallen haar 1-10 ng / haarwortel vloeibaar speeksel ng / ml monduitstrijkje ng / uitstrijkje sigarettenpeuk 1-25 ng / sigarettenpeuk urine 1-20 ng / ml bot 3-10 ng / mg biologisch contactspoor 0-1 ng / bemonstering één enkele lichaamscel 0,006 ng / cel (6 pg / cel) Verklaring van de eenheden: 1 milligram (1 mg) = één duizendste gram (10-3 gram) 1 microgram (1 μg) = één duizendste milligram (= 10-6 gram) 1 nanogram (1 ng) = één duizendste microgram (= 10-9 gram) 1 picogram (1 pg) = één duizendste nanogram (= gram) 1 milliliter (1 ml) = één duizendste liter (10-3 liter) Tabel 1 illustreert dat alleen bloed- en spermasporen voldoende DNA (ongeveer één microgram, ofwel 1000 nanogram) bevatten voor het maken van een DNA-fingerprint. In de beginjaren van het forensisch DNAonderzoek kwamen daardoor andere biologische sporen, zoals sigarettenpeuken en uitgevallen haren, niet in aanmerking voor een DNA-onderzoek: deze bevatten namelijk onvoldoende DNA. In de jaren na de introductie van de DNA-fingerprint ontwikkelde het forensische DNA-onderzoek zich snel. 12 In 2001 kon het Nederlands Forensisch Instituut (NFI) zelfs van minimale biologische sporen DNA-profielen verkrijgen. RFLP-techniek Bij de RFLP-techniek (restrictie fragment lengte polymorfismen) wordt met speciale enzymen (restrictie-enzymen) eerst het DNA in kleine stukjes geknipt. Doordat de verkregen DNA-fragmenten een zwakke elektrische lading hebben, kunnen ze op grootte worden gescheiden in een gel waarop elektrische spanning staat (gel-electroforese). Hypervariabele gebieden van het DNA worden zichtbaar gemaakt en getypeerd door ze met een speciale marker (probe) te labelen. Het resultaat is een bandjespatroon, vergelijkbaar met de barcodes op producten in de supermarkt. PCR-techniek Bij de PCR-techniek (polymerase chain reaction) wordt het DNA niet in stukken geknipt, maar worden met speciale moleculen (primers) hypervariabele gebieden op het DNA getraceerd. Deze primers binden specifiek aan weerszijden van hypervariabele gebieden, waarna door toevoeging van reagentia en een enzym (DNA-polymerase) het DNA van de desbetreffende hypervariabele gebieden exact wordt gekopieerd (vermeerderd). De vermeerderde hypervariabele gebieden worden vervolgens gescheiden, gedetecteerd en getypeerd in een microkolom waarop elektrische spanning staat (capillaire electroforese). Het resultaat is een piekenpatroon. In tegenstelling tot de RFLP-techniek worden bij de PCR-techniek de te onderzoeken hypervariabele gebieden vermeerderd. Daardoor is voor de PCR-techniek veel minder DNA nodig dan voor de RFLP-techniek. Dit maakt de PCR-techniek veel gevoeliger dan de RFLP-techniek. Bovendien zijn de hypervariabele gebieden die met de PCR-techniek worden onderzocht (de zogenoemde Short Tandem Repeats, afgekort als STRs ) veel korter dan die met de RFLP-techniek worden onderzocht (de zogenoemde Variable Number of Tandem Repeats, afgekort als VNTRs ) en daardoor minder snel onderhevig aan afbraak. Hieroor is de PCR-techniek beter geschikt voor onderzoek van deels afgebroken DNA. 110

4 Tabel 2. De ontwikkeling van forensisch DNA-onderzoek in Nederland. In 1989 werd in Nederland de DNA-fingerprintmethode geïntroduceerd en in strafzaken toegepast. Deze methode was gebaseerd op de zogenoemde restrictie fragment lengte polymorfismen (RFLP)-techniek en het gebruik van een multi locus probe. Op basis van de RFLP-techniek werd in 1990 overgegaan op de zogenoemde single locus probe -methode. Voor de toepassing van de RFLP-techniek was het een vereiste dat het DNA van goede kwaliteit was: zuiver en niet (deels) afgebroken. In 1991 deed in Nederland de PCR-techniek, het specifiek vermeerderen van te onderzoeken gebieden op het DNA, zijn intrede in het forensisch onderzoek. Vanaf 1994 was het mogelijk met de PCR-techniek hypervariabele gebieden bestaande uit zeer korte, zich herhalende, stukjes DNA, de zogenoemde Short Tandem Repeats (STRs) te onderzoeken. Omdat voor de PCR-techniek zeer weinig DNA nodig was, verdrong deze de RFLP-techniek uit de forensische DNA-laboratoria. Wat opvalt is dat in de beginjaren van de toepassing van de PCR-techniek weliswaar de hoeveelheid benodigd DNA veel minder was dan voorheen met de RFLP-techniek, een nadeel was dat de met de PCR-techniek verkregen DNA-profielen veel minder zeldzaam waren. In de loop der jaren konden in het forensisch DNA-onderzoek de DNA-kenmerken van steeds meer loci worden geanalyseerd. Van hoe meer loci de DNA-kenmerken worden bepaald, hoe zeldzamer de frequentie van voorkomen van het volledige DNA-profiel wordt. Sinds 1999 worden in de standaard DNA-analyse tien loci geanalyseerd en wordt bovendien een kenmerk onderzocht dat het geslacht vaststelt. De frequentie van voorkomen van een volledig DNA-profiel gebaseerd op deze tien hypervariabele loci is altijd kleiner dan één op één miljard. In 2001 werd de LCN DNA-analysemethode, in 1999 door het Engelse Forensic Science Service ontwikkeld, voor het eerst in Nederland toegepast. Jaar Methode Zeldzaamheidswaarde Hoeveelheid DNA Aantal cellen Type cellen DNA-profiel in bemonstering RFLP-techniek (zie kader p. 110) 1989 multi locus kleiner dan 1 op 1000 ng bloed/sperma probe (DNA fingerprint) (een miljard) single 1 op ng bloed/sperma locus probes PCR-techniek (zie kader p. 110) locus: D1S80 1 op 10 1 ng 170 bloed/sperma/ speeksel/haren locus: 1 op 10 1 ng 170 bloed/sperma/ HLA DQA1 speeksel/haren loci: 1 op ng 170 bloed/sperma/ HLA DQ1 en speeksel/haren Polymarker loci (STR): 1 op ng 170 bloed/sperma/ QUAD speeksel/haren loci (STR): 1 op ng 170 bloed/sperma/ SGM speeksel/haren loci (STR): kleiner dan 1 op 1 ng 170 bloed/sperma/ SGM Plus speeksel/haren/ (een miljard) biologische contactsporen 2001 LCN DNA (STR): kleiner dan 1 op 6-50 pg 1-10 minimale SGM Plus biologische (een miljard) sporen De ontwikkeling van het forensisch DNA-onderzoek in Nederland is samengevat in tabel 2. De DNA-vermeerderingsmethode; gevoeligheid: 1 nanogram DNA De oplossing voor het probleem van de relatief grote hoeveelheid celmateriaal die nodig is voor het verkrijgen van een DNA-fingerprint diende zich al vrij snel aan met de baanbrekende ontdekking van de Amerikaan Kary Mullis. 13 Hij beschreef in 1986 een methode om met behulp van een bepaald enzym (DNA-polymerase) in een reageerbuis specifieke stukken van het DNA heel selectief te vermeerderen. Met deze techniek kan men een zeer groot aantal exacte kopieën maken van elke gewenste plaats op het DNA. Op deze manier wordt voldoende materiaal verkregen voor analyse van 111

5 de desbetreffende stukjes DNA, zelfs als het uitgangsmateriaal weinig DNA bevat. Deze DNA-vermeerderingsmethode, waarvoor Mullis later de Nobelprijs kreeg, wordt de Polymerase Chain Reaction ( polymerase kettingreactie ) genoemd en afgekort als PCR. De nieuwe technologie zorgde voor een ware revolutie binnen het moleculair biologisch onderzoek. Omdat met de PCR-techniek uit slechts een geringe hoeveelheid celmateriaal voldoende DNA wordt verkregen voor analyse, was dit ook van grote waarde voor de forensische praktijk. Een ander voordeel van de PCR-techniek is dat ook DNA kan worden onderzocht dat deels is afgebroken. Dit is van belang bij onderzoek van sporen van slechte kwaliteit en oud biologisch materiaal. Door de gevoeligheid van de PCR-techniek resteert er ook bijna altijd voldoende DNA voor eventueel DNAcontraonderzoek. Dit was van belang omdat in de DNAwetgeving die op 1 september 1994 in Nederland in werking is getreden, het recht op een DNA-contraonderzoek was geregeld. Hierdoor werd het NFI eraan gehouden om bij het DNA-onderzoek zo mogelijk voldoende DNA-materiaal voor een contraonderzoek te bewaren. Ook de wens een DNA-databank met DNA-profielen op te zetten kon met de PCR-technologie worden gerealiseerd, omdat de met de PCR-techniek verkregen DNAprofielen zijn te digitaliseren. Na enkele jaren waren gestandaardiseerde, betrouwbare en robuuste DNAanalysemethoden ontwikkeld, gebaseerd op enerzijds het onderzoek van hypervariabele gebieden op het DNA, en anderzijds op de PCR-techniek. Doordat internationaal beschikbare onderzoekssets beschikbaar kwamen, kon de technologie uniform en wereldwijd worden ingezet. Loci en DNA-kenmerken Met het huidige standaard forensisch DNA-onderzoek worden altijd dezelfde, speciaal hiervoor geselecteerde, hypervariabele gebieden op het DNA onderzocht. Hiertoe wordt het DNA van deze hypervariabele gebieden eerst vermeerderd met de PCR-techniek, zodat voldoende DNA wordt verkregen voor analyse. Een hypervariabel gebied wordt gekenmerkt door het aantal keer dat het repeterende stukje DNA voorkomt. Dit noemt men het DNA-kenmerk van het hypervariabele gebied en wordt cijfermatig weergegeven. Het cijfer staat voor het aantal keer dat het repeterende stukje DNA voorkomt. De plaats van een hypervariabel gebied op het DNA wordt aangeduid als locus (meervoud loci ). Elk locus heeft twee DNA-kenmerken: de een is overgeërfd van de vader, de ander van de moeder. Onderzoek van een locus resulteert dus in twee DNA-kenmerken, weergegeven met twee cijfers. Deze cijfers verschillen als van de vader en van de moeder een ander DNA-kenmerk is overgeërfd (bijvoorbeeld 6/8), of de cijfers zijn gelijk als van de vader en de moeder hetzelfde DNAkenmerk is overgeërfd (bijvoorbeeld 7/7). Na PCR worden de vermeerderde stukjes DNA van de onderzochte loci van elkaar gescheiden door zogenoemde capillaire electroforese, zodat ze kunnen worden geanalyseerd. Het resultaat van een DNA-onderzoek wordt weergegeven als een piekenpatroon, waarbij elke piek een DNA-kenmerk representeert en wordt gekenmerkt met een cijfer. DNA-databank De combinatie van de cijfers van de pieken, de DNAkenmerken, van het DNA-profiel wordt als code opgeslagen in de DNA-databank. De DNA-databank vergelijkt de cijfercombinatie met die van al de andere in de DNA-databank opgenomen cijfercombinaties van DNA-profielen. Als gevolg van de standaardisering en de schaalvergroting van het forensisch DNA-onderzoek is het aantal DNA-profielen in de Nederlandse DNAdatabank voor strafzaken explosief toegenomen. De DNA-databank is daardoor inmiddels een zeer belangrijk opsporingsmiddel geworden. Actuele aantallen in de Nederlandse DNA-databank voor strafzaken opgenomen DNA-profielen van sporen en personen (verdachten, veroordeelden en overleden slachtoffers van niet opgeloste misdrijven) zijn te vinden op de website < Wereldwijd maken alle forensische laboratoria gebruik van commercieel verkrijgbare DNA-analysesystemen. De belangrijkste producenten zijn Applied Biosystems en Promega. Deze DNA-analysesystemen onderzoeken grotendeels dezelfde loci op het DNA. Door de wereldwijde standaardisering van het forensisch DNA-onderzoek en de DNA-analysesystemen is het mogelijk om DNA-profielen tussen verschillende landen uit te wisselen. In Europa is afgesproken dat ongeacht welke DNA-analysesystemen worden gebruikt, in ieder geval de zeven zogenoemde core loci worden onderzocht. De zeven loci van deze Europese Standaardset (ESS) hebben de volgende codes: D3S1358, VWA, D8S1179, D21S11, D18S51, TH01 en FGA. Op 20 mei 2008 is voor Nederland het Verdrag van Prüm 14 in werking getreden. Dit betekent dat er sindsdien een verdragsrechtelijke basis is voor het vergelijken van DNA-profielen in de Nederlandse DNA-databank voor strafzaken met DNA-profielen in DNA-databanken van een aantal andere Europese landen. SGM-Plus DNA-analysesysteem Onder standaardomstandigheden hebben de huidige commercieel verkrijgbare DNA-analysesystemen een gevoeligheid van minder dan één nanogram (een duizendste microgram) DNA. In de praktijk kan onder standaardomstandigheden zelfs uit 0,2 nanogram DNA (ongeveer 35 wangslijmvliescellen) een DNA-profiel worden verkregen. Hiermee is de standaardmethode meer dan duizend keer gevoeliger dan de DNA-fingerprintmethode. Dit betekent in de forensische praktijk dat de meeste biologische sporen voldoende DNA bevatten voor het vervaardigen van een DNA-profiel (zie tabel 1). Bovendien blijft er vrijwel altijd voldoende DNA beschikbaar voor een contraonderzoek. 112

6 Figuur 1. Het SGM-Plus DNA-profiel van een vrouwelijke medewerker van het NFI. Het bovenste piekenpatroon geeft (van links naar rechts) de DNA-kenmerken weer van de loci (hypervariabele gebieden) met de codes D3S1358, VWA, D16S539 en D2S1338; het middelste piekenpatroon geeft (van links naar rechts) het geslacht (met sex-specifieke locus amelogenine ) weer en de DNA-kenmerken van de loci met de codes D8S1179, D21S11 en D18S51; het onderste piekenpatroon geeft (van links naar rechts) de DNA-kenmerken weer van de loci met de codes D19S433, TH01 en FGA. Het sex-specifieke locus amelogenine bevindt zich op de geslachtschromosomen X en Y. Hiermee kan worden vastgesteld of het DNA-profiel toebehoort aan een man (XY) dan wel een vrouw (XX). Dat dit DNA-profiel toebehoort aan een vrouw blijkt uit het feit dat alleen een piek voor X aanwezig is en geen piek voor Y. Elk locus heeft twee DNA-kenmerken. Deze kunnen verschillen of gelijk zijn. Verschillen de DNA-kenmerken dan zijn voor dat locus twee pieken zichtbaar; zijn ze gelijk dan is één (hoge) piek zichtbaar. Voor zowel locus TH01 als locus FGA is één (hoge) piek zichtbaar. Deze loci hebben dus elk twee dezelfde DNA-kenmerken, respectievelijk 9.3/9.3 en 22/22. Deze persoon is voor deze loci homozygoot. De overige loci geven steeds twee pieken, dus twee verschillende DNA-kenmerken te zien. Voor deze loci is deze persoon dan heterozygoot. Het SGM-Plus DNA-analysesysteem bevat de zeven Europese core loci, de Europese standaardset: D3S1358, VWA, D8S1179, D21S11, D18S51, TH01 en FGA. Elk geaccrediteerd forensisch DNA-laboratorium in Europa betrekt deze loci bij het DNA-onderzoek. Deze core loci zijn ook als zodanig door Interpol aangemerkt en worden bovendien in de Verenigde Staten en in Canada standaard getypeerd. Dit maakt het mogelijk om DNA-profielen van sporen en personen van onopgeloste misdrijven wereldwijd te vergelijken. In de tabel onder de figuur staat de cijfercode (de DNA-kenmerken) van dit DNA-profiel. Deze code van twintig cijfers plus de code voor het geslacht (in dit geval XX) wordt opgenomen in de Nederlandse DNA-databank voor strafzaken. De DNA-databank vergelijkt de cijfercombinatie met die van al de andere in de DNA-databank opgenomen cijfercombinaties van de DNA-profielen van sporen en personen. N.B. De hoogte van de pieken is een maat voor de hoeveelheid celmateriaal (DNA) met het desbetreffende DNA-kenmerk. Dit wordt uitgedrukt in zogenoemde relatieve fluorescentie units (rfu s) op de schaal rechts van het piekenprofiel. Bij een DNA-profiel van één persoon zullen de twee pieken per locus ongeveer even hoog zijn. Locus Amel D3S1358 VWA D16S539 D2S1338 D8S1179 D21S11 D18S51 D19S433 TH01 FGA DNA-kenmerken X/X 16/17 16/17 11/14 17/25 8/14 29/ /17 13/16 9.3/9.3 22/22 Figuur 1 toont het DNA-profiel van een referentiemonster wangslijmvlies van een vrouwelijke medewerker van het NFI. Dit DNA-profiel is verkregen met het standaard door het NFI gebruikte SGM-Plus DNA-analysesysteem (van producent Applied Biosystems). Dit DNAanalysesysteem bepaalt van tien loci de DNA-kenmerken. Bovendien stelt het SGM-Plus DNA-analysesysteem het geslacht vast. Zijn van al de tien onderzochte loci de DNA-kenmerken bepaald, dan is een volledig DNA-profiel verkregen. Elk volledig DNA-profiel (van tien loci en dus twintig DNA-kenmerken) heeft een frequentie van voorkomen die altijd kleiner is dan één op één miljard. Ofwel, de kans dat een willekeurig gekozen persoon hetzelfde volledige DNA-profiel heeft, is kleiner dan één op één miljard, met uitzondering van aan elkaar verwante personen. De kans dat een verwant persoon hetzelfde volledige DNA-profiel heeft is veel minder klein. 15 Indien het onderzoek dit vereist kan het aantal te onderzoeken loci worden uitgebreid door ook gebruik 113

7 te maken van andere DNA-analysesystemen. Dit is het geval bij DNA-verwantschapsonderzoek voor het identificeren van onbekende overleden personen of voor het opsporen van vermiste personen. Hierbij worden standaard de DNA-kenmerken van nog vijf loci bepaald, zodat op basis van in totaal vijftien loci (dus dertig DNA-kenmerken) een uitspraak wordt gedaan in een DNA-verwantschapsonderzoek. Maar ook wanneer DNA-onderzoek van sporen met het SGM-Plus DNAanalysesysteem slechts van enkele loci DNA-kenmerken oplevert, kan het zinvol zijn met een ander DNAanalysesysteem te proberen van meer loci de DNAkenmerken te bepalen. Low Copy Number (LCN) DNA-analyse; gevoeligheid: 0,01 nanogram DNA Vanaf het moment dat de PCR-techniek in het forensisch onderzoek werd toegepast is er gezocht naar technische mogelijkheden om van de kleinst mogelijke hoeveelheid DNA een DNA-profiel te verkrijgen. In de praktijk is dit de hoeveelheid DNA van één enkele lichaamscel. Deze hoeveelheid is precies bekend en bedraagt 6 picogram DNA, ofwel 0,006 nanogram DNA (ongeveer één honderdduizendste microgram DNA). De ontwikkeling van een dergelijk gevoelige analysemethode zou grote nieuwe mogelijkheden kunnen bieden voor het forensisch DNA-onderzoek van met name minimale biologische sporen, zoals minieme biologische contactsporen. Daarom doet het NFI samen met buitenlandse forensische collega-instituten wetenschappelijk onderzoek naar de verdere ontwikkeling van methoden om van minimale biologische sporen bruikbare en betrouwbare DNA-profielen te verkrijgen. 16 Zo heeft het NFI onder meer onderzoek gedaan naar de mogelijkheid om van één enkele cel een DNA-profiel te genereren. 17 Deze experimenten zijn van groot belang geweest om niet alleen de gevoeligheid maar ook de complicerende neveneffecten van de zeer gevoelige DNA-analysemethoden te onderzoeken. Enkele resultaten van de één-celexperimenten komen aan de orde in de paragraaf Complicerende neveneffecten van LCN DNA-analyse (zie p. 115). Methoden voor LCN DNA-analyse 18 Voor DNA-onderzoek van minimale biologische sporen zijn zeer gevoelige onderzoeksmethoden ontwikkeld. Deze zogenoemde Low Copy Number (LCN) DNA-analysemethoden zijn gericht op het verhogen van de gevoeligheid van de analyse van de te onderzoeken loci. Low Copy Number betekent dat met deze methoden slechts een geringe hoeveelheid DNA (minder dan 0,2 nanogram, dus minder dan 35 cellen) nodig is voor het verkrijgen van een DNA-profiel. Met de LCN DNAanalysemethoden kunnen DNA-kenmerken zichtbaar worden gemaakt die niet of nauwelijks zichtbaar zijn in de DNA-profielen die zijn verkregen met het standaard DNA-onderzoek. LCN DNA-analyse maakt gebruik van dezelfde technieken en dezelfde DNA-analysesystemen als de standaard DNA-analyse. Dit betekent dat dezelfde loci worden onderzocht. Hierdoor kunnen de DNA-profielen die zijn verkregen met de LCN DNA-analysemethoden worden vergeleken met de DNA-profielen die zijn verkregen met de standaard DNA-analysemethode. LCN DNA-analyse kan in grote lijnen op twee verschillende manieren worden uitgevoerd. De hoeveelheid en de kwaliteit van het DNA en het resultaat van het in eerste instantie uitgevoerde standaard DNA-onderzoek zijn bepalend voor de keuze van de methode. LCN DNA-analysemethode met extra vermeerderingsstappen De eerste LCN DNA-analysemethode maakt gebruik van extra vermeerderingsstappen van het DNA. In plaats van de standaard 28 vermeerderingsstappen, is het aantal vermeerderingsstappen uitgebreid tot 34. De essentie van de LCN DNA-analyse met extra vermeerderingsstappen is dat hiermee meer kopieën kunnen worden verkregen van het DNA van de te onderzoeken loci dan bij het standaard DNA-onderzoek. Hoe meer kopieën uiteindelijk zijn verkregen, hoe beter de DNA-kenmerken van de loci zijn te analyseren. Deze methode is ontwikkeld door de Britse Forensic Science Service en wordt door hen sinds 1999 toegepast. In Nederland is de LCN DNA-analysemethode met extra vermeerderingsstappen in 2001 voor het eerst toegepast. LCN DNA-analysemethode met gevoeligere detectie De tweede LCN DNA-analysemethode kent geen extra vermeerderingsstappen, maar hier wordt de hoge gevoeligheid bereikt door extra gevoelige detectie van de DNA-kenmerken van de onderzochte loci. De detectie van het vermeerderde DNA, dat is verkregen met de standaard 28 vermeerderingsstappen, is bij deze methode extra gevoelig door aanpassingen in de zogenoemde capillaire electroforese. Tijdens de capillaire electroforese wordt in een microkolom waarop elektrische spanning staat, het vermeerderde DNA van de verschillende hypervariabele gebieden gescheiden, gedetecteerd en getypeerd. In de standaard DNA-analysemethode wordt op deze manier een bepaalde hoeveelheid van het vermeerderde DNA geanalyseerd. Door nu de elektrische spanning op de microkolom tijdelijk te vergroten wordt een grotere hoeveelheid van het vermeerderde DNA op de microkolom gebracht en geanalyseerd. Dit verhoogt de gevoeligheid van de detectie, waardoor zwak aanwezige DNA-kenmerken beter zichtbaar worden. 19 De gevoeligere detectie kan ook worden bereikt met de zogenoemde clean up -procedure. Hierbij wordt na de 28 vermeerderingsstappen het verkregen, vermeerderde DNA gezuiverd en geconcentreerd en pas daarna op de microkolom geplaatst voor standaard capillaire electroforese. 114

8 DNA-kwantificering Van belang bij LCN DNA-analyse is dat op voorhand de hoeveelheid DNA in de te onderzoeken bemonstering is vastgesteld. Door deze zogenoemde DNA-kwantificering kan men een betere inschatting maken welke LCN DNA-analysemethode moet worden ingezet. Bovendien voorkomt het dat met de LCN DNA-analyse met extra vermeerderingsstappen een te grote hoeveelheid vermeerderd DNA wordt verkregen. Dergelijke overamplificatie resulteert in onbruikbare resultaten van het DNA-onderzoek. Voor het vaststellen van de hoeveelheid DNA bestaat tegenwoordig een zeer gevoelige test. Hierdoor gaat de DNA-kwantificering niet of nauwelijks ten koste van de minieme hoeveelheid celmateriaal in het minimale biologische spoor. Het bepalen van de hoeveelheid DNA in de bemonstering gebeurt met de zogenoemde real time PCR DNA-kwantificering. LCN DNA-analyse geen standaardonderzoek Zowel de LCN DNA-analyse met extra vermeerderingsstappen, als de LCN DNA-analyse met gevoeliger detectie hebben complicerende neveneffecten. Deze neveneffecten spelen een belangrijke rol bij het interpreteren van de met de LCN DNA-analyse verkregen DNAprofielen en kunnen van invloed zijn op de betrouwbaarheid hiervan. Om deze reden wordt LCN DNA-analyse niet standaard toegepast, maar alleen als aanvulling op eerder uitgevoerd standaard DNA-onderzoek van minimale biologische sporen. Als er in de te onderzoeken bemonstering voldoende DNA aanwezig is voor de standaard DNA-analysemethode, zal onderzoek met de LCN DNA-analysemethoden in de regel geen aanvullende informatie opleveren en zelfs tot onbruikbare analyseresultaten kunnen leiden. Bij de LCN DNA-analysemethode met extra vermeerderingsstappen zal dit leiden tot een dermate grote hoeveelheid vermeerderd DNA (de al genoemde overamplificatie ), dat dit problemen oplevert bij de analyse. Anderzijds zal bij de LCN DNA-analysemethode met gevoeliger detectie dermate veel DNA op de microkolom worden gebracht dat de capaciteit van de microkolom wordt overschreden, hetgeen eveneens problemen oplevert bij de analyse. Complicerende neveneffecten van LCN DNA-analyse Door de zeer hoge gevoeligheid van de LCN DNA-analysemethoden kunnen een aantal neveneffecten die inherent zijn aan forensisch DNA-onderzoek van minimale biologische sporen zich gaan manifesteren. Enerzijds kunnen met de LCN DNA-analyse meer DNA-kenmerken (beter) zichtbaar worden gemaakt, waardoor het DNA-profiel meer informatie bevat. Anderzijds zijn de resultaten vaak minder goed reproduceerbaar. De verminderde reproduceerbaarheid is het gevolg van drie verschillende complicerende neveneffecten die bij LCN DNA-analyse kunnen optreden: allele dropin, allele drop-out en prominent aanwezige stotterpieken. Allele drop-in heeft betrekking op de aanwezigheid van zeer minieme hoeveelheden DNA uit de om- geving van het stuk van overtuiging of de bemonstering ervan. Allele drop-out en prominent aanwezige stotterpieken betreffen artefacten die bij de vermeerdering van het DNA een rol spelen. De neveneffecten van de LCN DNA-analyse zijn inzichtelijk gemaakt in de eerdergenoemde één-celexperimenten. Om het DNA-onderzoek van minimale biologische sporen en de complicerende neveneffecten te doorgronden worden enkele resultaten van de één-celexperimenten uiteengezet. Voor deze experimenten is gebruikgemaakt van celmateriaal van een vrouwelijke medewerker van het NFI. Haar volledige DNA-profiel van tien loci is verkregen uit een referentiemonster wangslijmvlies en weergegeven in figuur 1 (zie p. 113). De bovenste rij pieken in dit volledige DNA-profiel representeren de DNA-kenmerken van de loci met de codes D3S1358, VWA, D16S539 en D2S1338. Dit piekenpatroon is ook weergegeven in de bovenste rij van figuur 2 (zie p. 116). Voor de één-celexperimenten zijn (witte) bloedcellen gebruikt. Het middelste piekenpatroon en het onderste piekenpatroon in figuur 2 representeren de resultaten van één-celexperimenten. Bij één-celexperimenten is telkens getracht uit een enkele cel een DNA-profiel te verkrijgen met de LCN DNA-analysemethode met extra vermeerderingsstappen (34 vermeerderingsstappen). Het middelste piekenpatroon is het DNA-analyseresultaat van het eerste één-celexperiment. Het onderste piekenpatroon is het DNA-analyseresultaat van het tweede één-celexperiment. Allele drop-out Het belangrijkste complicerende neveneffect van de LCN DNA-analysemethoden wordt uit de DNA-profielen meteen duidelijk. De juiste typering voor locus D3S1358 (de twee linker pieken van het bovenste piekenpatroon, figuur 2) is 16/17. Bij het eerste één celexperiment (middelste piekenpatroon, figuur 2) is voor dit locus slechts één piek zichtbaar, en dit zou ten onrechte getypeerd kunnen worden als 16/16, twee keer DNA-kenmerk 16. Het DNA-kenmerk 17 is hier niet zichtbaar. Blijkbaar is DNA-kenmerk 17 niet vermeerderd waardoor dit wegvalt in het DNA-profiel. In vakjargon heet dit allele drop-out (zie kader Allele drop-out ). Bij het tweede één-celexperiment (onderste piekenpatroon, figuur 2) wordt onder precies dezelfde omstandigheden wel de correcte typering voor locus D3S1358 verkregen, namelijk 16/17. Allele drop-out wordt in het eerste één-celexperiment ook waargenomen voor het derde locus (D16S539). Hier is in het verkregen DNA-profiel DNA-kenmerk 11 niet zichtbaar en blijkbaar niet vermeerderd tijdens de LCN DNA-analyse. Ook hier zou ten onrechte het locus getypeerd kunnen worden als 14/14, dus twee keer DNA-kenmerk 14. Bij het tweede één-celexperiment (onderste piekenpatroon, figuur 2) wordt onder precies dezelfde omstan- 115

9 Figuur 2. Één-celexperimenten. 1. De juiste typering van de DNA-kenmerken van de loci D3S1358, VWA, D16S539 en D2S1338 van de vrouwelijke medewerker van het NFI is weergegeven in het bovenste piekenpatroon. De cijfers onder de pieken staan voor de typeringen van de DNA-kenmerken van de vier verschillende loci (zie ook het bovenste piekenpatroon in het volledige DNA-profiel van figuur 1). 2. Het middelste piekenpatroon geeft de resultaten weer van de loci D3S1358, VWA, D16S539 en D2S1338 in het eerste één-celexperiment. In de met cirkels omgeven loci is zichtbaar dat allele drop-out heeft plaatsgevonden van DNA-kenmerk 17 van locus D3S1358 en van DNA-kenmerk 11 van locus D16S Het onderste piekenpatroon geeft de resultaten weer van de loci D3S1358, VWA, D16S539 en D2S1338 in het tweede één-celexperiment. Hoewel hier geen allele drop-out heeft plaatsgevonden is er bij het vierde locus (D2S1338) wel sprake van een sterke onbalans in de hoogte van de pieken (zie omcirkelde pieken). In feite heeft hier net geen drop-out plaatsgevonden van DNA-kenmerk 25. Bij LCN DNA-analyse moet men alert zijn op dit voor DNA-onderzoek van minimale biologische sporen karakteristieke fenomeen. Referentiemonster 1 e één-celexperiment 2 e één-celexperiment digheden wel de correcte typering voor locus D16S539 verkregen, namelijk 11/14. Hoewel allele drop-out voor de vier loci bij het tweede één-celexperiment niet is waargenomen, is daar met name bij het vierde locus (D2S1338) wel sprake van een sterke onbalans in de hoogte van de twee pieken. Normaliter zouden deze ongeveer van gelijke hoogte moeten zijn. De piek die DNA-kenmerk 25 representeert is echter zeer veel lager dan de piek die DNA-kenmerk 17 representeert. Allele drop-in In de één-celexperimenten werd ook een ander complicerend neveneffect van DNA-onderzoek van minimale biologische sporen waargenomen. Bij locus D8S1179 was naast allele drop-out, ook sprake van zogenoemd allele drop-in. Dit is weergegeven in figuur 3 (zie p. 117). De DNA-kenmerken van de medewerkster van het NFI zijn voor dit locus getypeerd als 8/14 (zie de bovenste pieken in figuur 3). In het eerste één-celexperiment worden deze DNA-kenmerken correct getypeerd als 8/14. Echter, in het tweede één-celexperiment wordt dit locus getypeerd als 9/14. DNA-kenmerk 8 is niet zichtbaar als gevolg van allele drop-out, en daarnaast is er een piek op de positie van DNA-kenmerk 9. Deze piek is het gevolg van het neveneffect allele drop-in (zie kader Allele drop-in ). Allele drop-out Als er slechts zeer weinig celmateriaal is, zoals in het één-celexperiment slechts één enkele cel, kan het gebeuren dat tijdens de PCR-reactie niet beide DNA-kenmerken van een bepaald locus worden vermeerderd, maar slechts één van de twee, of soms zelfs geen van beide. Hoewel dit effect mede door het toeval wordt bepaald (het zogenoemde stochastisch effect ) neemt de kans dat allele drop-out optreedt toe als de DNA-concentratie (hoeveelheid celmateriaal, en dus DNA) afneemt. Als allele drop-out optreedt, heeft dit tot gevolg dat van een locus slechts één piek of helemaal geen piek zichtbaar is in het DNA-profiel. Als geen van beide DNA-kenmerken van een locus zichtbaar zijn in het DNA-profiel spreekt men van locus drop-out. De mogelijkheid van allele drop-out is inherent aan alle typen DNA-onderzoek waarbij slechts een zeer geringe hoeveelheid DNA in het uitgangsmateriaal aanwezig is. 116

10 Allele drop-in Bij het interpreteren van LCN DNA-profielen moet men alert zijn op de aanwezigheid van extra pieken die niet toebehoren aan het DNA van het celmateriaal van het spoor. Een dergelijke extra piek geeft een DNA-kenmerk weer van een minimale hoeveelheid DNA die vanuit de omgeving op het spoor of het stuk van overtuiging of in het DNA-extract is terechtgekomen. Het betreft doorgaans DNA van een fragment van een enkele cel, en bevat daardoor slechts een fragment van het totale DNA. Door de hoge gevoeligheid van de LCN DNA-analyse kan ook een DNA-kenmerk van het celfragment worden vermeerderd. Het gevolg is dat een of meerdere DNAkenmerken van een dergelijk celfragment uit de omgeving in het LCN DNA-profiel aanwezig kunnen zijn. Het optreden van dergelijke extra pieken noemt men in vakjargon allele drop-in. Allele drop-in doet zich in de praktijk vooral voor bij LCN DNA-analyses met extra vermeerderingstappen. Bij het standaard DNA-onderzoek van sporen met voldoende DNA is de kans op dit neveneffect zeer veel kleiner, omdat de hoeveelheid DNA van een celfragment of enkele cellen uit de omgeving van het spoor in het niet valt bij de hoeveelheid DNA van het spoor zelf. Hierdoor zal het effect van eventuele allele drop-in niet zichtbaar zijn in het DNA-profiel dat is verkregen met standaard DNA-onderzoek. Prominent aanwezige stotterpieken Stotterpieken, ook wel voorpieken genoemd, kunnen prominent in het LCN DNA-profiel aanwezig zijn. Stotterpieken in het DNA-profiel representeren geen DNA-kenmerken, maar zijn het gevolg van artefacten die inherent zijn aan de DNA-vermeerdering. Stotterpieken liggen over het algemeen één positie voor de pieken van de werkelijke DNA-kenmerken. DNA-profielen verkregen met standaard DNA-onderzoek bevatten ook stotterpieken, maar deze zijn dan veel lager. Daardoor zijn stotterpieken in de regel goed te onderscheiden van pieken die toebehoren aan DNA-kenmerken. Echter, bij LCN DNA-analyse kunnen deze stotterpieken zo hoog worden dat ze veel moeilijker zijn te onderscheiden van de pieken van DNA-kenmerken. Prominent aanwezige stotterpieken komen vooral voor bij LCN DNA-analyses met extra vermeerderingsstappen. Stotterpieken Naast allele drop-in en allele drop-out is er nog een ander complicerend neveneffect, de zogenoemde stotterpiek. Dit neveneffect is inherent aan de DNA-vermeerderingstechniek en is in het onderste piekenpatroon van figuur 3 zichtbaar. Het piekje (aangegeven met een pijl) voorafgaand aan DNA-kenmerk 14 en op de positie van DNA-kenmerk 13, representeert niet daadwerkelijk DNA-kenmerk 13. Deze piek is een stotterpiek. In figuur 1, waar het DNA-profiel onder standaardomstandigheden is verkregen, zijn ook stotterpieken aanwezig (telkens een positie voor de piek van een DNA-kenmerk). In DNA-profielen die zijn verkregen met standaard DNA-onderzoek zijn stotterpieken goed te onderscheiden van de pieken die toebehoren aan de echte DNA-kenmerken. Echter bij LCN DNA-analyse kunnen deze stotterpieken prominent aanwezig zijn. Deze prominent aanwezige stotterpieken kunnen daardoor moeilijker te onderscheiden zijn van de pieken die daadwerkelijk DNA-kenmerken representeren. Stochastisch proces Het optreden van de neveneffecten allele drop-out en allele drop-in tijdens DNA-onderzoek van minimale Figuur 3. Één-celexperimenten (vervolg). 1. De juiste typering van de DNA-kenmerken van het locus D8S1179 (8/14) van de vrouwelijke medewerker van het NFI (verkregen uit het referentiemonster wangslijmvlies) is weergegeven in de bovenste pieken. De cijfers onder de pieken staan voor de typering van de DNA-kenmerken van het locus D8S1179 (zie ook de twee pieken rechts naast de piek voor X in de tweede rij pieken in het volledige DNA-profiel van figuur 1). 2. De middelste pieken geven het resultaat weer van het eerste één-celexperiment. Het resultaat is gelijk aan dat van het referentiemonster wangslijmvlies. 3. De onderste pieken geven het resultaat weer van het tweede één-celexperiment. DNA-kenmerk 8 is niet zichtbaar als gevolg van allele drop-out, en daarnaast is er een piek zichtbaar op de positie van DNA-kenmerk 9. Deze piek is het gevolg van allele drop-in. Referentiemonster 1 e één-celexperiment 2 e één-celexperiment 117

11 biologische sporen kan als een stochastisch proces worden beschouwd: ze treden op met een bepaalde kans. De kans waarmee deze effecten optreden is onder andere afhankelijk van de hoeveelheid en de kwaliteit van het DNA in de bemonstering. Zo is bij een geringe hoeveelheid DNA de kans op allele dropout groter dan bij een grotere hoeveelheid DNA. Immers, als er maar zeer weinig DNA aanwezig is, kan in het begin van de vermeerderingsreactie de geringe hoeveelheid DNA van een van de DNA-kenmerken van een locus worden gemist en daardoor niet gekopieerd. Wordt het DNA van een van de DNA-kenmerken van een locus bij de eerste vermeerderingsstap gemist, dan leidt dit veelal tot allele drop-out: er is in het verkregen DNA-profiel geen piek van het desbetreffende DNA-kenmerk te zien (zie locus D3S1358 en locus D16S539 bij het eerste één-celexperiment, figuur 2). Wordt echter in latere vermeerderingsstappen het DNA van het DNA-kenmerk nu wel meegenomen dan zal het DNA-kenmerk als lage piek in het DNA-profiel zichtbaar zijn. Het is immers pas in een later stadium meegegaan in het vermeerderingsproces en dus in veel kleinere hoeveelheid gekopieerd. Het resultaat is grote onbalans in de pieken van het desbetreffende locus (zie locus D2S1338 bij het tweede één-celexperiment, figuur 2). Dergelijke resultaten maken interpretatie van DNA-profielen lastig: ondanks het enorme verschil in hoogte, behoren de pieken toe aan DNA dat afkomstig is van dezelfde donor (men spreekt van heterozygote onbalans ). Hoewel met de huidige DNA-kwantificeringsmethode de concentratie DNA in bemonsteringen van sporen goed kan worden vastgesteld, is het niet mogelijk exact, op de picogram nauwkeurig, vast te stellen hoeveel DNA zich in het minimale biologische spoor bevindt. Hierdoor is de kans op het optreden van de neveneffecten allele drop-out (of grote onbalans in de pieken van hetzelfde locus) en allele drop-in niet nauwkeurig uit het resultaat van de DNA-kwantificering te bepalen. Ook de kwaliteit van het DNA in de bemonstering is van invloed op het stochastisch proces en daarmee op het resultaat van het DNA-onderzoek. Verschillende stoffen, zoals kleurstoffen en organisch materiaal, kunnen remmend en storend werken op de vermeerderingsreactie. Men spreekt van inhibitie en de stoffen die dit veroorzaken worden aangeduid als inhibitiefactoren. Als inhibitie mogelijk de oorzaak is waardoor er geen of een niet voor vergelijkend DNA-onderzoek geschikt DNA-profiel is verkregen, kan men proberen de invloed van de inhibitiefactoren te verminderen. Dit kan door het te onderzoeken DNA te verdunnen en daardoor de concentratie van de inhibitiefactoren te verlagen. 20 Ondanks dat het verdunnen ook de concentratie DNA verlaagt, kunnen hierdoor informatieve DNA-profielen worden verkregen. Ook de clean up - procedure is een optie om de inhibitiefactoren te verminderen en daardoor inhibitie zo veel als mogelijk te voorkomen. Analyseren, interpreteren en vergelijken van DNA-profielen Het analyseren en interpreteren van DNA-profielen verloopt volgens verschillende stappen. 21,22 Als uit het celmateriaal in de bemonstering van een biologisch spoor een DNA-profiel (piekenpatroon) is verkregen, dan worden eerst alle DNA-kenmerken in het DNA-profiel benoemd. De analyse, het benoemen van de waargenomen pieken in het DNA-profiel, gebeurt bij het NFI door DNA-onderzoekers op het DNA-laboratorium. Zij beoordelen of de waargenomen pieken daadwerkelijk DNA-kenmerken representeren. Hiervoor maken zij gebruik van een daarvoor ontwikkeld en internationaal gebruikt expertsysteem. De software van dit expertsysteem bevat de criteria en de randvoorwaarden op basis waarvan de pieken in het DNA-profiel automatisch worden benoemd. Daarna analyseren de DNAonderzoekers nogmaals de verkregen resultaten aan de hand van een vaste leidraad van criteria. Nadat het verkregen DNA-profiel is geanalyseerd en voldoet aan de binnen het NFI gehanteerde kwaliteitscriteria gaat het piekenprofiel naar de gerechtelijke deskundige. De gerechtelijke deskundige interpreteert het DNA-profiel. Hierbij komen onder meer de volgende vragen aan de orde: Is het een enkelvoudig DNAprofiel of een DNA-mengprofiel? Als het een DNAmengprofiel betreft, is er dan een DNA-hoofdprofiel en/of een DNA-nevenprofiel af te leiden? Kan er sprake zijn van allele drop-in, allele drop-out of prominent aanwezige stotterpieken? Zijn de zwak aanwezige DNA-kenmerken voldoende reproduceerbaar? Pas nadat het DNA-profiel is geïnterpreteerd, vindt het vergelijkend DNA-onderzoek met DNA-profielen van andere sporen of van referentiemateriaal van verdachten, slachtoffers of andere betrokkenen plaats. Door de analyse te scheiden van de interpretatie wordt voorkomen dat kennis van de DNA-profielen van bepaalde personen het interpreteren van het DNA-profiel van het spoor beïnvloedt. Binnen een zaak vergelijkt de gerechtelijke deskundige de DNA-profielen aan de hand van de pieken en de bij de pieken behorende cijfers. Zijn deze voor het DNAprofiel van het spoor en het DNA-profiel van het referentiemonster van (bijvoorbeeld) de verdachte gelijk, dan is er sprake van een match: het spoor kan van de verdachte afkomstig zijn. De bewijswaarde van de match is gecorreleerd aan de zeldzaamheid van het DNA-profiel. De zeldzaamheidswaarde wordt door de deskundige berekend. Verschillen de pieken en bijbehorende cijfers tussen het DNA-profiel van het spoor en het DNA-profiel van het referentiemonster, dan is er geen match: de verdachte is niet de donor van het spoor. Interpreteren van DNA-profielen van minimale biologische sporen Bij het interpreteren van DNA-profielen van minimale biologische sporen moet de gerechtelijke deskundige bedacht zijn op de complicerende neveneffecten. Deze 118

12 neveneffecten moeten eerst zijn onderkend voordat een betrouwbaar vergelijkend DNA-onderzoek kan plaatsvinden. In DNA-profielen van minimale biologische sporen kunnen door allele drop-out pieken ontbreken, door allele drop-in extra pieken aanwezig zijn, en daarnaast stotterpieken prominent aanwezig zijn. Als bijvoorbeeld door allele drop-out een piek afwezig is en daardoor een DNA-kenmerk niet wordt waargenomen in het DNA-profiel van een spoor, zou dit kunnen resulteren in de conclusie dat het DNA-profiel van een persoon niet matcht met dat van dit spoor, terwijl dit zonder de allele drop-out wel het geval zou zijn. Anderzijds kunnen door allele drop-in pieken aanwezig zijn die DNA-kenmerken representeren die niet direct aan de bemonstering toebehoren. Door deze extra pieken kan het DNA-profiel van een persoon matchen met dat van het spoor, terwijl dit zonder de allele drop-in niet het geval zou zijn. Hetzelfde geldt voor prominent aanwezige stotterpieken. De gerechtelijke deskundige moet zeker zijn dat een waargenomen piek daadwerkelijk een DNA-kenmerk representeert en geen stotterpiek is. Om die reden wordt bij LCN DNA-analyse het DNAonderzoek ten minste twee keer herhaald. Volgens vaststaand protocol worden minimaal drie monsters genomen van het geïsoleerde DNA (het DNA-extract). Al deze monsters worden vervolgens afzonderlijk en onafhankelijk van elkaar onderworpen aan een LCN DNA-analyse. Op deze manier is vast te stellen of een waargenomen piek in een LCN DNA-profiel reproduceerbaar is en een betrouwbaar DNA-kenmerk representeert dan wel het gevolg kan zijn van een van de complicerende neveneffecten. Het uiteindelijk verkregen LCN DNA-profiel bestaat uit DNA-kenmerken die reproduceerbaar aanwezig zijn. Alleen DNA-kenmerken die reproduceerbaar aanwezig zijn in de verkregen DNA-profielen worden bij het vergelijkend DNAonderzoek betrokken. Leidraad Voor het interpreteren van DNA-profielen van minimale biologische sporen bestaat nog geen expertsysteem waarin softwarematig de criteria en randvoorwaarden voor dergelijke DNA-profielen zijn gedefinieerd. Het probleem is dat het nog ontbreekt aan een internationaal wetenschappelijk gedragen model waarmee de kans op allele drop-out, allele drop-in en prominent aanwezige stotterpieken in DNA-profielen van minimale biologische sporen kan worden geschat. Maar ook als dergelijke software beschikbaar komt blijft de expertise van de deskundige van cruciaal belang bij het interpreteren en vergelijken van de LCN DNA-profielen. In de internationale wetenschappelijke forensische gemeenschap is veel aandacht voor de gevoelige problematiek van het DNA-onderzoek van minimale biologische sporen Internationale uitwisseling van ervaring met LCN DNA-analyse moet resulteren in (internationale) richtlijnen voor het uitvoeren, het analyseren en het interpreteren van DNA-onderzoek van minimale biologische sporen. Door hierin te participeren draagt het NFI bij aan een beter begrip van LCN DNA-analyse. De gerechtelijke deskundigen van het NFI werken overeenkomstig een leidraad, zodat uiteindelijk met betrouwbare LCN DNA-profielen een objectief vergelijkend DNA-onderzoek kan worden uitgevoerd. De leidraad bevat de volgende hoofdlijnen: 1. de registratie van de DNA-kenmerken die reproduceerbaar aanwezig zijn. Dit gebeurt aan de hand van alle DNA-profielen die bij het LCN DNA-onderzoek van de desbetreffende bemonstering zijn verkregen; 2. het vaststellen van het (minimum) aantal donoren dat DNA heeft bijgedragen aan het spoor aan de hand van de reproduceerbaar aanwezige DNA-kenmerken; 3. de registratie van de loci waar mogelijk sprake is van allele drop-out: welke DNA-kenmerken zijn mogelijk door stochastisch effect niet zichtbaar?; 4. de registratie van de loci waar mogelijk sprake is van allele drop-in: welke DNA-kenmerken behoren niet direct toe aan de bemonstering, maar mogelijk aan DNA uit de omgeving?; 5. de registratie van loci waar mogelijk prominent aanwezige stotterpieken aanwezig zijn: welke pieken zijn mogelijk stotterpieken?; 6. het op basis van bovenstaande interpretatie vaststellen van het LCN DNA-profiel : de DNA-kenmerken hiervan zijn gebaseerd op reproduceerbaar aanwezige pieken, niet zijnde stotterpieken; 7. het schriftelijk vastleggen in het zaakdossier van de resultaten van de interpretatie en eventuele bijzonderheden. Hierdoor is alle informatie beschikbaar voor een eventuele second opinion en review ; 8. het vergelijken van het LCN DNA-profiel met andere DNA-profielen. Het aan de hand van het vergelijkend DNA-onderzoek vaststellen of er wel of geen match is; of anders, of het LCN DNA-profiel wel of geen aanwijzing geeft op de aanwezigheid van celmateriaal van een bepaalde persoon in het minimale biologische spoor; 9. een onafhankelijke, tweede interpretatie van de LCN DNA-analyseresultaten en het vergelijkend DNA-on - derzoek door een andere gerechtelijke deskundige. In de praktijk blijkt dat vooral bij de beoordeling van complexe LCN DNA-profielen van mengsporen de deskundige een aantal subjectieve afwegingen moet maken. Dit komt onder andere doordat bij dergelijke complexe LCN DNA-profielen de gerechtelijke deskundige vaak geen zekerheid heeft over het aantal donoren dat aan het spoor heeft bijgedragen. Hoewel hij bij het interpreteren rekening houdt met de mogelijkheid van allele drop-out, allele drop-in en prominent aanwezige stotterpieken, heeft hij niet altijd zekerheid of deze neveneffecten zich daadwerkelijk hebben voorgedaan. Als de oordelen van de twee gerechtelijke deskundigen 119

13 die onafhankelijk van elkaar de resultaten van het LCN DNA-onderzoek hebben geïnterpreteerd overeenstemmen, wordt aan de hand daarvan een deskundigenrapport opgemaakt. Zijn de twee gerechtelijke deskundigen het niet met elkaar eens, dan wordt het voorgelegd aan een derde gerechtelijke deskundige. Blijft over de interpretatie van de DNA-profielen van het minimale biologische spoor en het vergelijkend DNA-onderzoek een verschil van inzicht bestaan, dan wordt dit kenbaar gemaakt in het deskundigenrapport. Delictgerelateerd Naast grote zorgvuldigheid bij het analyseren van de DNA-profielen van minimale biologische sporen is voorzichtigheid geboden bij de interpretatie van de resultaten in de context van het delict. Van minimale biologische sporen, die vrijwel altijd zonder optische instrumenten onzichtbaar zijn en waarvan bovendien veelal de aard van het celmateriaal in het laboratorium niet is te bepalen, is over het algemeen moeilijk vast te stellen of er een relatie met het delict is. Bovendien kan in de meeste gevallen geen uitspraak worden gedaan over wanneer en hoe het minimale biologische spoor op het bemonsterde stuk van overtuiging is terechtgekomen. Er is vaak meer dan één scenario te bedenken hoe iemands DNA op een plaats delict of op een stuk van overtuiging terecht kan zijn gekomen. Een minimaal en meestal onzichtbaar biologisch spoor kan al enige tijd voor het delict op het onderzochte materiaal zijn achtergebleven. Ook direct na het delict, of zelfs tijdens het delict kan DNA van iemand die niets met het misdrijf te maken heeft op een plaats delict of op een stuk van overtuiging terechtkomen, bijvoorbeeld bij hulpverlening aan het slachtoffer. Ook enige tijd na het delict kan DNA van niet bij het misdrijf betrokken personen achterblijven op het sporenmateriaal, bijvoorbeeld van degene die het delict ontdekt, of in geval van contaminatie bij het bewaren van het desbetreffende in beslag genomen voorwerp. Bovendien moet men bij minimale biologische sporen ook nadrukkelijk de mogelijkheid beschouwen dat deze sporen door indirecte overdracht op het stuk van overtuiging terecht kunnen zijn gekomen. Hierbij is het spoor via een andere persoon op het onderzochte object terechtgekomen. Door een en ander levert een LCN DNA-profiel van een minimaal biologisch spoor in de criminalistische context van een zaak meestal minder informatie op dan een DNA-profiel van bijvoorbeeld een bloedspoor of een spermaspoor dat onder standaardomstandigheden is onderzocht. Het vaststellen van de delictgerelateerdheid van bloed of sperma is over het algemeen eenvoudiger dan dat van minimale biologische sporen. Daarom is het van het grootste belang dat de resultaten van het DNA-onderzoek van minimale biologische sporen worden beschouwd in de context van alle andere informatie in de zaak en dat hierbij met verschillende scenario s rekening wordt gehouden. Referenties 1 Sjerps, M. & Kloosterman, A.D. (2005), De bewijswaarde van forensisch DNA-onderzoek, in: M.J. Sjerps & J.A. Coster van Voorhout (red.), Het onzekere bewijs, Deventer: Kluwer, Meulenbroek, A.J. (2008), Forensisch onderzoek en bewijswaarde van biologische contactsporen, De Essenties van forensisch DNAonderzoek, versie 4, Brontekst 4. 3 Posthumus, F. (2005), Evaluatieonderzoek in de Schiedammer parkmoord. 4 Broeders, A.P.A. (2008), Low Copy Number DNA in Engeland en Wales: weer terug van even weggeweest, Expertise & Recht 1(3): Review of the use of low Copy Number DNA analysis in current cases: CPS statement, 14 January 2008 < 6 Caddy, B., Taylor, G.R. & Linacre A.M.T. (2008), A review of the science of Low template DNA analysis, < 7 Posthumus, F. (2005), Evaluatieonderzoek in de Schiedammer parkmoord. Hoofdstuk 13. Belangrijkste aanbevelingen. 8 Muller, E.R. & Otto, C.N.T. (2008), Schiedammer Parkmoord, in: A.P.A. Broeders & E.R. Muller (red.), Forensische wetenschap, Deventer: Kluwer, Jeffreys, A.J., Wilson V. & Thein S.L. (1985), Hypervariable minisatellite regions in human DNA, Nature 314, Gill, P., Jeffreys, A.J. & Werrett, D.J. (1985), Forensic application of DNA fingerprints, Nature 318, Wambaugh, J. (1989), The blooding, Bantam Books. (Nederlandse vertaling: Het Bloedspoor, Baarn: Bosch & Keuning 1989, 1e druk. 12 Kloosterman, A.D. (2002), The development and implementation of forensic DNA typing in the Netherlands. Chapter 12: Efficacy and limits of genotyping low copy number (LCN) DNA samples by multiplex PCR of STR loci. 13 Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G. & Erlich, H. (1986), Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 51, Verdrag tussen het Koninkrijk België, de Bondsrepubliek Duitsland, het Koninkrijk Spanje, de Republiek Frankrijk, het Groothertogdom Luxemburg, het Koninkrijk der Nederlanden en de Republiek Oostenrijk inzake de intensivering van de grensoverschrijdende samenwerking, in het bijzonder ter bestrijding van het terrorisme, de grensoverschrijdende criminaliteit en de illegale migratie, Prüm, 27 mei 2005, Trb. 2005, Kloosterman, A.D. (2002), The development and implementation of forensic DNA typing in the Netherlands. Chapter 1: General Introduction. 16 Whitaker, J.P., Cotton, E.A. & Gill P. (2001), A comparison of the characteristics of profiles produced with the AMPFlSTR SGM Plus multiplex system for both standard and low copy number (LCN) STR DNA analysis, Forensic Science International 123, Kloosterman, A.D., Kersbergen, P. (2003), Efficacy and limits of genotyping low copy number (LCN) DNA samples by multiplex PCR of STR loci, J Soc Biol. 197(4), Meulenbroek, A.J. (2008), Interpretatie van DNA-bewijs II; onvolledige DNA-profielen, DNA-mengprofielen en DNA-profielen van minimale sporen, De Essenties van forensisch DNA-onderzoek, versie 4, Brontekst Westen, T., Benschop, C., Nagel, J.H.A. & Sijen, T. (2008), Increased Capillary Electrophoresis Injection Settings as an Efficient approach to Increase the Sensitivity of STR Typing, Submitted to the Journal of Forensic Sciences. 20 Caddy, B., Taylor, G.R. & Linacre, A.M.T. (2008), A review of the science of Low template DNA analysis, < 21 Clayton, T.M. & Gill, P. (1998), The steps in the interpretation of mixtures, Forensic Science International. 22 Meulenbroek, A.J. (2008), Interpretatie van DNA-bewijs II; onvolledige DNA-profielen, DNA-mengprofielen en DNA-profielen van minimale sporen, De Essenties van forensisch DNA-onderzoek, versie 4, Brontekst Whitaker, J., Cotton, E. & Gill, P. (2001), A comparison of the characteristics of profiles produced with the AMPFISTR SGM Plus multiplex system for both standard and low copy number (LCN) STR DNA analysis, Forensic Science International 123(2-2): Gill, P. et al. (2000), An investigation of the rigor of interpretation rules for STRs derived from less than 100 pg of DNA, Forensic Science International, 112(1), Gill, P. et al. (2006), DNA commission of the International Society of Forensic Genetics: Recommendations on the interpretation of mixtures, Forensic Science International 160(2-3), Gill, P. et al. (2008), National recommendations of the Technical UK DNA working group on mixture interpretation for the NDNAD and for court going purposes, Forensic Science International, 2(1),