Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine

Transcriptie

1 Faculteit Mens en Welzijn Campus Vesalius Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine CHARLOTTE DEPOVER Academiejaar Biomedische laboratoriumtechnologie Medische laboratoriumtechnologie Promotor: Apr. Biol. Joseph Rafael Co-promotor: Dr. Els Van Mechelen Dr. Leen Puimège Keramiekstraat Gent tel fax

2

3 Faculteit Mens en Welzijn Campus Vesalius Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine CHARLOTTE DEPOVER Academiejaar Biomedische laboratoriumtechnologie Medische laboratoriumtechnologie Promotor: Apr. Biol. Joseph Rafael Co-promotor: Dr. Els Van Mechelen Dr. Leen Puimège Keramiekstraat Gent tel fax

4 Woord vooraf Deze thesis vormt het sluitstuk van mijn opleiding Biomedische Laboratoriumtechnologie met afstudeerrichting Medische Laboratoriumtechnologie aan de Hogeschool Gent campus Vesalius. Deze bachelorproef was een werk van lange adem. Het bekomen resultaat zou nooit tot stand zijn gekomen zonder de hulp van enkelen die ik langs deze weg graag zou bedanken. Allereerst wil ik mijn promotor apr. klin. biol. R. Joseph van het Jan Yperman Ziekenhuis bedanken. Zonder zijn wijze raad en bijstand was dit resultaat nooit haalbaar geweest. Hij stuurde me bij waar nodig en stond steeds paraat om mijn vragen te beantwoorden. Graag zou ik ook alle medisch laboratoriumtechnologen en klinisch biologen van het Jan Yperman Ziekenhuis in Ieper bedanken. Zij hebben mij zeer goed begeleid doorheen mijn stageperiode. Ook wens ik de docenten van Hogeschool Gent campus Vesalius te bedanken voor de kennis die ik er de afgelopen drie jaar heb opgedaan. Hierbij wil ik in het bijzonder mijn co-promotor Dr. Els Van Mechelen bedanken. Ze heeft me altijd goede raad gegeven en heeft me bijgestuurd waar nodig. Ook mijn stagebegeleider Dr. Leen Puimège verdient een dankwoord om mij zeer goed te begeleiden doorheen de vier maanden stage. Verder wens ik mijn ouders te bedanken voor de kans die ik gekregen heb om mijn studie als medisch laboratoriumtechnoloog te volbrengen. Ook mijn vriend verdient een dankwoord voor de steun en het vele malen nalezen van mijn eindwerk. Charlotte Depover Juni 2016

5 Inhoudsopgave 1 Inleiding Calprotectine Differentiaaldiagnose Stabiliteit en bewaarcondities Interferentie Distributie van calprotectine in feces Normale range en biologische variabiliteit Irritable Bowel Syndrome Inleiding Klachten en symptomen Oorzaak Epidemiologie Diagnose Behandeling Inflammatory Bowel Diseases Ziekte van Crohn Inleiding Klachten en symptomen Oorzaak Epidemiologie Behandeling Colitis ulcerosa Inleiding Klachten en symptomen Oorzaak Epidemiologie Behandeling Diagnose Opzet van deze studie Materiaal en methoden EliA Calprotectin Principe Materiaal Werkwijze Kalibratie Interpretatie van de resultaten ImmunoCAP Principe Materiaal Werkwijze CalproSmart Office TM Principe Materiaal Opslag testkit Registratie en downloaden van de applicatie als de patiënt de CalproSmart test thuis wil uitvoeren Smartphone applicatie validatie Werkwijze Extractie van calprotectine Testprocedure... 29

6 2.3.7 Interpretatie CalproSmart Office TM -testresultaten Certest Calprotectin Principe Materiaal Werkwijze Staalvoorbereiding Testprocedure Interpretatie van de resultaten Statistische verwerking van de resultaten Validatie van een kwalitatieve methode Accuraatheid van een kwalitatieve test: specificiteit en sensitiviteit Positieve Predictieve Waarde (PPV) en Negatieve Predictieve Waarde (NPV) Precisie Kappacoëfficiënt en waarschijnlijkheidsfactor Resultaten Methodevalidatie EliA Calprotectin Bepalen van de accuraatheid Bepalen van precisie CalproSmart Office TM Bepalen van de accuraatheid Herhaalbaarheid Reproduceerbaarheid Certest Calprotectin Bepalen van de accuraatheid Herhaalbaarheid Reproduceerbaarheid Quantum Blue Calprotectin Bepalen van de accuraatheid Vergelijking verschillende methodes Voor- en nadelen Reagenskost Materiaal Tijdsbesteding Discussie en besluit Bibliografie Lijst van figuren Lijst van tabellen Lijst van bijlagen:... 57

7 Afkortingen BSA CD CRC CRP CV ELISA EN EP FC IBD IBS NPV NSAID NVT PBS PDS PPV SD UC VN VP WBC Bovine Serum Albumine Crohn s Disease ColoRectal Cancer C-Reactive Protein Variatiecoëfficiënt Enzyme Linked Immunosorbent Assay Echt Negatief Echt Positief Fecaal Calprotectine Inflammatory Bowel Disease Irritable Bowel Syndrome Negatieve Predictieve Waarde Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs Niet Van Toepassing Phosphate Buffered Saline Prikkelbare Darm Syndroom Positieve Predictieve Waarde Standaarddeviatie Ulcerative Colitis Vals Negatief Vals Positief Witte Bloedcellen

8 Verklarende woordenlijst Differentiaaldiagnose Fissuur Interferentie Remissie Transmuraal vaststelling van de aard van een ziekte door vergelijking van de kenmerken van verschillende ziekten kloof in de huid verstoring verminderen van ziekteverschijnselen dieper dan alleen het slijmvlies

9 Abstract In dit eindwerk, uitgevoerd in het Jan Yperman Ziekenhuis te Ieper, worden drie methodes om calprotectine op te sporen in een fecesstaal met elkaar vergeleken. De eerste methode is de EliA Calprotectin 2 methode. Deze methode wordt uitgevoerd op het toestel ImmunoCAP 250. De andere twee methodes zijn CalproSmart Office TM en Certest Calprotectin Dit zijn twee sneltesten. De fecesstalen worden tot op heden doorgestuurd naar een labo dat de Quantum Blue Calprotectin methode gebruikt. Deze methode wordt ook meegenomen in dit eindwerk. Om calprotectine te bepalen met deze vier methodes, dient er eerst een extractie te gebeuren om het calprotectine uit het fecesstaal te extraheren. In totaal worden 73 staaltjes, waarvan de waarde met de Quantum Blue Calprotectin gekend is, geanalyseerd via de drie methodes. 42 Fecesstalen zijn afkomstig van het Jan Yperman Ziekenhuis zelf en 31 fecesstalen komen van andere routinelaboratoria. Bij de drie methodes worden de reproduceerbaarheid en de herhaalbaarheid bepaald. Bij de EliA Calprotectin 2 methode wordt dit bepaald door positieve en negatieve controlestalen. Bij de CalproSmart Office TM en bij de Certest Calprotectin wordt een fecesstaal gebruikt dat een bepaalde waarde heeft, die volgens de cutoff waarde van de firma positief is. Met behulp van de sensitiviteit en de specificiteit wordt er een overzicht verkregen van het aantal vals positieven en vals negatieven per methode. Hierbij scoort de Certest Calprotectin en de EliA Calprotectin 2 het best. Bij het vergelijken van de methodes onderling en met de overheersende waarde (ofwel positief, ofwel negatief) van de vier methodes, worden de kappacoëfficiënten en de waarschijnlijkheidsfactoren bepaald. Ook hierbij scoort de Certest Calprotectin en de EliA Calprotectin 2 het best. Na het overlopen van de voor-en nadelen van iedere test, kan men besluiten dat de Certest Calprotectin de beste test is om in het routine labo te gebruiken. Trefwoorden: fecaal calprotectine, ziekte van Crohn, colitis ulcerosa, kwantitatieve methode, klinische diagnose

10 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine 10 1 Inleiding De opdracht van deze bachelorproef was om calprotectine te bepalen in een fecesstaal met drie verschillende methodes. Hieronder wordt uitgelegd wat calprotectine precies is en waarom het zo belangrijk is om dit eiwit op te sporen in het kader van enkele specifieke ziektebeelden. De technieken die momenteel reeds gebruikt worden voor de bepaling van calprotectine, komen in dit onderdeel ook aan bod. 1.1 Calprotectine Calprotectine is een calcium- en zinkbindend proteïne met een molecuulmassa van 36 kd. Het eiwit is een heterotrimeer bestaande uit twee lange, identieke ketens van aminozuren en een korte polypeptideketen. Elke keten kan twee calciumatomen binden, dus in totaal kan de molecule zes calciumatomen binden, maar bindt ook met zink. Aangezien elke molecule zes calciumatomen bindt en het de groei remt van bacteriën en fungi in vitro, wordt het eiwit calprotectine genoemd. Er is nog niet veel gekend over de functie van calprotectine in vivo. Daar het een binding aangaat met zink- en calciumionen, kan men veronderstellen dat het een functie heeft in de regulatie van enzymen in vivo. Het eiwit is betrokken bij de regulatie van ontstekingsreacties door remming van zinkafhankelijke metalloproteïnasen en wordt dus de regulator van ontsteking genoemd. Calprotectine vermindert de lokale concentraties aan zink en calcium. Het eiwit behoort tot de S-100-eiwitfamilie, dat geproduceerd wordt door neutrofielen en monocyten. Deze witte bloedcellen (WBC) zijn de ontstekingscellen van het lichaam en migreren naar de plaats van de ontsteking, hier de darm. De WBC komen in de feces terecht en sterven daar af. Het calprotectine komt vrij en kan zo gemeten worden in een fecesstaal. Daarom spreekt men van fecaal calprotectine (FC) (Hindryckx et al., 2012). Calprotectine werd voor het eerst geïsoleerd uit de cytosolische fractie van polymorfonucleaire cellen door Fagerhol et al. in Calprotectine vertegenwoordigt in het cytosol van deze cellen meer dan 60% van de totale eiwitfractie (Von Roon et al., 2007). FC is zeer nuttig om inflammatoire darmziekten (inflammatory bowel disease, IBD) te onderscheiden van irritable bowel syndrome (IBS). IBS wordt verder uitgelegd in 1.2 Irritable bowel syndrome. Het eiwit komt in verhoogde mate vrij in de darm bij intestinale inflammatie. FC is dan ook een nietinvasieve merker voor IBD, aangezien IBD gekenmerkt wordt door intestinale inflammatie. Een verhoogde waarde van calprotectine kan dus gedetecteerd worden bij chronische IBD. Men kan twee belangrijke vormen van IBD onderscheiden, namelijk de ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC). Dit wordt verder uitgelegd bij 1.3 Inflammatory bowel diseases. Bij een normale waarde van calprotectine kan men de diagnose van IBD zo goed als uitsluiten (Roseth et al., 1992). Bij patiënten die gekend zijn voor IBD kan een onderscheid gemaakt worden tussen actieve IBD en IBD in remissie. Bij een verhoogde waarde van FC is actieve inflammatie aanwezig en bij remissie wordt een verlaagde waarde van FC vastgesteld (Labaere et al., 2014). Er werd getest of FC opmerkelijk verhoogd of verlaagd kan teruggevonden worden bij colorectale kanker (CRC). Hierbij werd aangetoond dat er geen significante verschillen in de FC waarden zijn tussen patiënten met CRC en patiënten zonder CRC. In dezelfde studie werd ook getest of calprotectine verhoogde waardes vertoont in de feces van personen met IBS. Het resultaat was dat er geen verschillen zijn in de FC levels tussen patiënten met IBS en gezonde personen (Von Roon et al., 2007).

11 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine Differentiaaldiagnose Een stijging van het FC is niet specifiek voor IBD. Het is een maat voor intestinale ontsteking en moet dus altijd in de klinische context worden geïnterpreteerd. Er dient een differentiaaldiagnose te worden uitgevoerd. In tabel I worden de aandoeningen weergegeven die bij gestegen waarden moeten opgenomen worden in de differentiaaldiagnose (Van Rheenen et al., 2010). Tabel I: Belangrijkste differentiaaldiagnosen bij gestegen waarden van het fecale calprotectine Aandoeningen Inflammatoir darmlijden Ziekte van Crohn Colitis ulcerosa Microscopische colitis Infecties Giardia lamblia Bacteriële dysenterie Virale gastro-enteritis Gastritis door Helicobacter pylori Tumoren (grote) Darmpoliepen Colorectaal carcinoom Maagcarcinoom Intestinaal lymfoom Medicatie Niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen Aspirine Andere Onbehandelde voedselallergie Gastro-oesofageale refluxziekte Mucoviscidose Levercirrose Stabiliteit en bewaarcondities Calprotectine is gedurende 7 dagen stabiel op kamertemperatuur. Hierdoor kan het staal thuis worden gecollecteerd, wat veel meer comfort biedt voor de patiënt zelf, en eventuele vertraging in het transport beïnvloedt de analyse niet (Roseth, 1992). In figuur 1 ziet men een grafiek waarbij de concentratie van fecaal calprotectine, weergegeven in µg/g, uitgezet wordt ten opzichte van de tijd. Er werd getest of het geëxtraheerde calprotectine stabiel blijft op 4 C, -20 C en 70 C. Dit werd gedurende zes weken getest. Op een temperatuur van 4 C daalt de calprotectine concentratie sterk na één week. Bij een temperatuur van 70 C stijgt de calprotectine concentratie na zes weken. Bij een temperatuur van 20 C blijft de concentratie van calprotectine gedurende zes weken vrij stabiel (Dhaliwal et al., 2014).

12 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine 12 Figuur 1: Bepaling van de stabiliteit van geëxtraheerd calprotectine door meting van de concentratie op verschillende tijdstippen van calprotectine extracten gestockeerd bij verschillende temperaturen, nl. 4 C, -20 C en -70 C en dit gedurende zes weken In andere studies werd de stabiliteit van de extractie van calprotectine bestudeerd voor een langere tijd. Het resultaat is dat na het extraheren in bufferoplossing, het extract bewaard kan worden gedurende vier maanden in de diepvries op -20 C (Hindryckx et al., 2012) Interferentie Enkele medicijnen kunnen invloed hebben op het resultaat van de test. Vals positieve FC-waardes werden gerapporteerd bij patiënten die niet-steroïdale anti-inflammatoire medicatie (NSAID) innamen. Het is niet het medicijn dat interfereert met de test, maar NSAID kan inflammatie in de darm induceren met een verhoogd FC tot gevolg (Dolwani et al., 2004). Ook werden verhoogde FC-waardes gevonden bij patiënten die protonpompinhibitoren innamen (Poullis et al., 2003) Distributie van calprotectine in feces In studies werd onderzocht of calprotectine homogeen verdeeld is over de feces. Hiervoor werd de concentratie van calprotectine bepaald in drie kleine willekeurige fracties van 5 g van fecesstalen. In totaal werden 48 staaltjes onderzocht. Dit werd vergeleken met de concentratie van calprotectine in het volledige fecesstaal. De correlatiecoëfficiënt lag tussen 0,90 en 0,95 (Roseth et al., 1992). In een andere studie werd hetzelfde onderzocht. Daar vond men ook geen significante verschillen in calprotectinewaarde wanneer men metingen deed op verschillende plaatsen in de feces (Dolwani et al., 2004). Er kan dus geconcludeerd worden dat het fecesstaal niet eerst gehomogeniseerd moet worden vooraleer de FC te meten Normale range en biologische variabiliteit Studies tonen aan dat de FC concentratie bij gezonde personen gelijkaardig is bij volwassenen en kinderen, en schommelt tussen 9,3 en 58 µg/g bij volwassenen en tussen 11 en 49 µg/g bij kinderen (Pouillis et al., 2004). Er werd ook bewezen dat fecaal calprotectine bij volwassenen stijgt bij het ouder worden. Het stijgen van fecaal calprotectine bij het ouder worden is niet te vergelijken met het stijgen van fecaal calprotectine bij mensen met IBD (Konikoff & Denson, 2006).

13 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine Irritable Bowel Syndrome Inleiding Irritable bowel syndrome wordt in het Nederlands prikkelbare darmsyndroom (PDS) genoemd. Dit is een functionele gastro-intestinale aandoening. Het is een zeer vervelende aandoening, maar minder ernstig omdat er geen schade optreedt in het maagdarmstelsel. Men spreekt van PDS als de symptomen gedurende langere tijd optreden, continu of met tussenpauzen. Het grootste verschil met IBD is dat er bij IBS zoals reeds vermeld geen schade optreedt in het maagdarmstelsel en bij IBD is dit wel het geval (Van der Horst et al., 2012) Klachten en symptomen Prikkelbare darmsyndroom wordt gekenmerkt door min of meer dezelfde symptomen als deze bij IBD, maar de symptomen blijven optreden. Men heeft last van diarree, krampen, opgezwollen gevoel in de buik, winderigheid en constipatie. Deze symptomen komen alsmaar terug en gaan niet meer weg. Soms gaan deze klachten gepaard met andere klachten zoals misselijkheid, minder goed verteren van voedsel, moeheid. Bij iedere persoon zijn de klachten verschillend en het is moeilijk om uitspraken te doen van het verdere verloop. (Van der Horst et al., 2012) Oorzaak Het is nog niet duidelijk wat de oorzaak van IBS is. Momenteel komt PDS tot stand op basis van drie met elkaar samenhangende mechanismen. Ten eerste is er een veranderde mobiliteit van de darmen. Hierbij treedt er een stoornis op in de intrinsieke activiteit van het intestinale gladde spierweefsel van de darm, met voornamelijk een effect op de contractiliteit van de dunne darm en het colon. Een verhoogde sensitiviteit van de darmen spelen ook een rol (Van der Horst et al., 2012) Epidemiologie De prevalentie is voor mannen 4 per 1000 mannen en voor vrouwen 10 per 1000 vrouwen. Het komt dus veel meer voor bij vrouwen dan bij mannen. Het syndroom komt voornamelijk voor bij personen tussen 15 en 65 jaar (Van der Horst et al., 2012) Diagnose Er bestaat geen test om IBS op te sporen. Dokters geven een diagnose aan de patiënt op basis van de symptomen, de leeftijd en het geslacht van de patiënt (Van der Horst et al., 2012) Behandeling De behandeling voor IBS is bij iedere patiënt verschillend. Een behandeling met geneesmiddelen is slechts bij een gering percentage van de patiënten zinvol. Men geeft medicatie op basis van de symptomen van de patiënt. Als constipatie één van de belangrijkste klachten zijn, schrijft men een laxans voor. Wanneer diarree de belangrijkste klacht is bij PDS, gaat men medicijnen geven tegen diarree. Bij pijnklachten geeft men pijnstillers zoals paracetamol of NSAID (Van der Horst et al., 2012).

14 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine Inflammatory Bowel Diseases Zoals eerder vermeld bij 1.1 Calprotectine worden twee grote groepen onderscheiden bij IBD, namelijk de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa. Dit zijn auto-immuunziekten waarbij de patiënt een ontsteking van de darm vertoont. In figuur 2 wordt het verschil weergegeven tussen de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa. Bij CD zijn alle lagen van het gastro-intestinale tractus beschadigd en dit fenomeen kan overal voorkomen in het maagdarmstelsel. Bij CU wordt enkel de binnenste laag van de darm beschadigd en dit enkel in het colon. Verdere uitleg over beide ziektes wordt hieronder gegeven (Jin, 2014). Figuur 2: IBD, ziekte van Crohn vs colitis ulcerosa Ziekte van Crohn Inleiding De ziekte van Crohn behoort tot de chronische inflammatoire darmaandoeningen. Deze ziekte werd voor het eerst beschreven in het jaar 1932 in New York. Burill Crohn en zijn medewerkers kenden een groep patiënten deze ziekte toe, die klachten van langdurige diarree en buikpijn hadden. Ze gebruikten eerst de term enteritis regionalis omdat ze dachten dat de ontsteking zich enkel lokaal situeerde ter hoogte van de dunne darm. Later bleek dat de ontsteking niet enkel in de dunne darm was gelokaliseerd maar dat de ziekte ieder deel van het maagdarmstelsel kon aantasten. De ziekte van Crohn bestaat uit een transmuraal ontstekingsproces. De ontsteking is dus dieper gelegen dan alleen het slijmvlies. Dit ontstekingsproces geeft aanleiding tot fistels en abcessen. Bij kinderen heeft deze ziekte een grote invloed op de groei, maturatie en ontwikkeling (Janssens & Hoffman, 2008) Klachten en symptomen De klachten zijn sterk afhankelijk van de plaats waar de ontsteking zich bevindt in het maagdarmstelsel. De meest voorkomende plaats van ontsteking is de dunne darm. Deze patiënten klagen over buikpijn, diarree, gewichtsverlies en moeheid. Bij kinderen heeft dit ook een nadelige invloed op de groei en ontwikkeling. Ze hebben onder andere een afbuigende gewicht- en lengtecurve en een vertraagde ontwikkeling in de puberteit.

15 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine 15 De ontsteking kan ook plaatsvinden ter hoogte van het colon. Dit wordt ook wel Crohn-colitis genoemd. Bloederige diarree is hierbij de voornaamste klacht. Andere klachten zijn onder meer ook buikpijn, defecatienood, anale aantasting met fistels en fissuren % Van de Crohn-patiënten vertonen extra-intestinale manifestaties, zoals gewrichtsaantasting (artritis), oogletsels, huidafwijkingen en leveraantasting. Er kunnen ook complicaties optreden bij deze ziekte. Dit uit zich in het optreden van stenosen, fistels, bloedingen en moeilijk behandelbare perianale aantasting (Janssens & Hoffman, 2008) Oorzaak De oorzaak van deze ziekte is nog altijd niet gekend. De aandoening is vermoedelijk multifactorieel bepaald waarbij er een wisselwerking bestaat tussen de genetische aanleg en bepaalde omgevingsfactoren (Janssens & Hoffman, 2008) Epidemiologie De ziekte van Crohn komt voor bij ongeveer 1,7 tot 3,5 per 1000 mensen. Per jaar komen er vijf nieuwe patiënten bij per inwoners. Deze ziekte is streekgebonden en komt frequenter voor bij het blanke ras, voornamelijk in de Westerse gebieden. De incidentie in Azië, Afrika en Zuid- Amerika is veel lager. De ziekte komt veel vaker voor bij jongeren. Bij 25% van de patiënten wordt de diagnose gesteld vóór de leeftijd van 20 jaar (Janssens & Hoffman, 2008) Behandeling De behandeling bestaat uit ontstekingsremmende en immuun modulerende medicatie aangevuld met symptomatische maatregelen zoals dieet en vitaminesubstitutie. De behandeling wordt aangepast aan de noden en problemen van iedere patiënt. De leeftijd is een belangrijke parameter. Bij opgroeiende kinderen, die nog ten volle groeien en ontwikkelen, is het belangrijk om de chronische inflammatie zo snel mogelijk onder controle te krijgen en om allereerst hun voedingstoestand te optimaliseren (Janssens & Hoffman, 2008). Er wordt anti-tnfα gegeven. Dit is een biologische therapie met antistoffen tegen TNFα. TNFα is een eiwit en dit eiwit wordt in te hoge hoeveelheden geproduceerd bij de ziekte van Crohn (Reimund et al., 2007). Sulfasalazine en Mesalazine worden gegeven bij milde opstoten. Cortisone wordt gebruikt om een opstoot onder controle te krijgen, maar bij langdurige behandeling heeft deze medicatie nevenwerkingen, onder andere op de groei en ontwikkeling van het kind. Immunosuppressiva worden gegeven bij patiënten met herhaalde opstoten. Darmrust op zich kan ook een opstoot onderdrukken. Hierbij is een therapie met sondevoeding essentieel gedurende 4 à 6 weken. Chirurgie wordt zoveel mogelijk vermeden en wordt enkel toegepast bij complicaties (Janssens & Hoffman, 2008).

16 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine Colitis ulcerosa Inleiding Colitis ulcerosa is een chronische ontstekingsziekte van de endeldarm en de dikke darm. De ziekte evolueert door een afwisseling van aanvallen. Colitis ulcerosa geeft daarbij aanleiding tot een oppervlakkige inflammatie, beperkt tot het colon (Solberg et al., 2009) Klachten en symptomen Er kunnen drie soorten symptomen optreden, namelijk spijsverterings-, algemene en ontstekingssymptomen in andere organen. Bij spijsverteringssymptomen klaagt men over bloederige diarree, hevige buikpijn en afscheiding van slijm samen met de ontlasting. Algemene symptomen zijn vermoeidheid, gewichtsverlies en koorts. Bij ontstekingssymptomen in andere organen gaat het voornamelijk om pijnlijke gewrichten (artritis), ontstekingen van de huid samen met mondzweertjes en ontstoken ogen (Solberg et al., 2009) Oorzaak Oorzaken voor deze ziekte zijn op dit moment nog altijd niet gekend. Vermoedelijk spelen diverse omgevings- en genetische factoren hierin een rol (Solberg et al., 2009) Epidemiologie Colitis ulcerosa komt bij per inwoners voor. De ziekte kan op elke leeftijd toeslaan, maar komt vaker voor bij jongvolwassenen tussen 15 en 35 jaar. Zowel vrouwen als mannen kunnen door deze ziekte getroffen worden (Solberg et al., 2009) Behandeling De ziekte kan door geen enkele behandeling volledig worden genezen. Met sommige medicijnen kunnen wel de aanvallen behandeld worden. Dit noemt men aanvalsbehandelingen. Andere medicijnen voorkomen het terugvallen en het optreden van complicaties. Dit worden onderhoudsbehandelingen genoemd. Ontstekingsremmende darmmedicijnen dienen om de ontsteking te verminderen. Ze worden toegediend bij patiënten om de darmsymptomen onder controle te krijgen. Sommige van deze medicijnen kunnen ook toegediend worden voor langere tijd. Dit dient dan als onderhoudsbehandeling om het risico op een hernieuwde aanval te verkleinen. Immunomodulerende medicijnen zijn zeer nuttig bij de meest progressieve en moeilijk controleerbare vormen van de ziekte. Ze onderdrukken de werking van het immuunsysteem. Dit gebruikt men indien de ontstekingsremmende behandelingen onvoldoende doeltreffend zijn. TNFα-blokkers behoren tot de nieuwe generatie medicijnen, de biofarmaca. Deze recombinante eiwitten werken in op een bepaald deel van het immuunsysteem. Ze blokkeren de werking van het eiwit TNFα. Deze stof speelt een rol bij het ontwikkelen van ontstekingen. Hierdoor zorgt de TNFαblokker ervoor dat de ontsteking in kracht vermindert en dat nieuwe ontstekingen voorkomen worden. Dit is echter zeer duur voor de patiënt en de patiënt moet naar het ziekenhuis voor een parenterale toediening. Dit wordt dus zoveel mogelijk vermeden.

17 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine 17 Chirurgie is aangewezen bij ernstige vormen van de ziekte. Dit wordt vooral gedaan na herhaalde mislukte medicamenteuze behandelingen of bij ernstige complicaties. Hierbij heeft men tot doel om de gehele dikke darm te verwijderen. Dit gebeurt in verschillende fasen (Solberg et al., 2009) Diagnose De ileocolonoscopie met histopathologisch onderzoek van biopsies is de gouden standaard voor het bevestigen of uitsluiten van een IBD. Dit onderzoek is echter zeer belastend voor de patiënt en aangezien er veel patiënten zijn waarvan men CD of UC wil uitsluiten, was men op zoek naar een eenvoudige en minder belastende test. Met dit doel voor ogen zocht men naar specifieke biochemische merkers in plasma en feces. Inflammatoire darmziekten kennen een moeilijk te voorspellen wisselend verloop met opstoten en periodes van remissie. Een opstoot kan pas klinisch worden aangetoond wanneer de inflammatie in de darm reeds vrij ernstig is. Door het bepalen van een merker in plasma of feces, kan men een opflakkering van de ziekteactiviteit vroeger detecteren en de behandeling tijdig aanpassen. Een voorbeeld van een biochemische merker in bloed en feces voor diagnose en opvolging van inflammatoire darmziekten is C-reactief eiwit (C-reactive protein), CRP. CRP is een acuut fase proteïne. Dit eiwit wordt al zeer lang bepaald in plasma als ontstekingsparameter. De resultaten bij een IBD zijn verschillend. Normaal zou er een verhoogd CRP optreden bij een IBD, maar dit is niet zo bij elke patiënt. Dit is vooral zo bij colitis ulcerosa. Dit kan mogelijks te wijten zijn aan het feit dat deze ziekte zich enkel beperkt tot de darmmucosa in tegenstelling tot de ziekte van Crohn die zich dieper dan het darmslijmvlies begeeft. Bovendien komt een verhoogd CRP voor bij heel wat andere pathologische condities. Deze merker is dus weinig specifiek. In studies werd op zoek gegaan naar meer specifieke merkers als mogelijke test voor inflammatoire darmziekten. Hierdoor kwam men bij granulocyt-geassocieerde proteïnen, zoals lactoferrine en calprotectine. De voorkeur ging naar calprotectine. Dit eiwit wordt beschreven bij 1.1 Calprotectine (Solberg et al., 2009).

18 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine Opzet van deze studie In dit eindwerk is het de bedoeling om drie verschillende methoden voor de bepaling van fecaal calprotectine met elkaar te vergelijken. Deze technieken zullen ook vergeleken worden met de Quantum Blue Calprotectin kit van de firma Bühlmann, omdat deze techniek momenteel gebruikt wordt om FC te bepalen. De drie te onderzoeken methodes zijn Certest Calprotectin , CalproSmart Office TM en EliA Calprotectin 2. De CerTest calprotectin is een gecombineerde testkaart. De testkaart is gevoelig voor twee cutoff waardes van calprotectine namelijk 50 µg/g feces en 200 µg/g feces. De cutoff waarde van 50 µg/g feces is belangrijk bij de detectie van een inflammatoire aandoening. Daarentegen is de cutoff waarde van 200 µg/g feces belangrijk bij de opvolging van deze inflammatoire aandoening (Labaere, 2012). Om het fecaal calprotectine te kunnen meten, moet het calprotectine eerst geëxtraheerd worden uit het fecesstaal. Iedere methode heeft zijn aparte extractiemethode. Dit deed men vroeger door feces af te wegen waarna een extractiebuffer werd toegevoegd. Nu bieden alle firma s een extractie methode aan waarbij dit afwegen overbodig is geworden. De karakteristieken van de verschillende testen, die in dit eindwerk besproken worden, zijn weergegeven in tabel II (Labaere et al., 2014). Calprolab van Calpro is het voorbeeld van een ELISA-test (Labaere et al., 2014). Aangezien dit soort testen vrij arbeidsintensief zijn, hebben een aantal firma s enkele sneltesten op de markt gebracht. Deze testen zijn gebaseerd op het principe van immunochromatografie. De firma Phadia ontwikkelde een geautomatiseerde EliA fluorescentie immuno-assay testkit. Deze test kan geautomatiseerd uitgevoerd worden op het toestel ImmunoCAP 250 (Labaere, 2012). Tabel II: Karakteristieken van de verschillende testen Test Firma Principe Extractiemethode Meetbereik (µg/g) Calprolab Calpro ELISA Roche faecal extraction EliA Calprotectin 2 Thermo Fisher Scientific Enzyme fluoroimmunotechniek kwantitatief Roche faecal sample preparationkit 3, CerTest Calprotectin Certest Biotec S.L. Immunochromatografie Semi-kwantitatief In kit zelf > 50 of > 200 CalproSmart Office TM Calpro Immunochromatografie Kwantitatief In kit zelf Quantum Blue Calprotectin Bühlmann Immunochromatografie Kwantitatief Roche faecal extraction Om deze drie methodes te vergelijken werden er patiëntenstalen gebruikt van het Jan Yperman Ziekenhuis, van het ziekenhuis Oost-Limburg (ZOL) in Genk en van het Imelda ziekenhuis in Bonheiden. De stalen van het Jan Yperman Ziekenhuis en van het ZOL in Genk werden onmiddellijk ingevroren in de diepvries op -20 C tot de studie van start ging. De staaltjes van het Imelda ziekenhuis in Bonheiden werden bewaard in de koelkast. Hier moet rekening worden gehouden met eventuele discordanties. Na de studie werden de patiëntenstalen in de koelkast bewaard op 4 C.

19 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine 19 De bepaling van calprotectine wordt in het lab van het Jan Yperman Ziekenhuis tot op heden doorgestuurd naar een labo die de techniek Quantum Blue Calprotectin gebruikt van de firma Bühlmann. Er wordt bij deze methode gebruik gemaakt van twee cartridges, de low range - cartridge en de high range -cartridge, die calprotectine kunnen meten over een meetbereik van 30 tot 1800 µg/g feces. De low range -cartridge heeft een meetbereik van 30 tot 300 µg/g feces en wordt gebruikt voor de diagnostiek van IBD. De high-range -cartridge heeft een meetbereik van 100 tot 1800 µg/g feces en wordt gebruikt voor de opvolging van patiënten gekend met IBD. Bij het uitvoeren van de test zelf, wordt een hoeveelheid feces overgebracht op de cartridge. Dit wordt vervolgens geïncubeerd en uiteindelijk wordt het resultaat afgelezen met behulp van een meettoestel (Hindryckx et al., 2012). Deze techniek wordt niet in het labo van het Jan Yperman Ziekenhuis uitgevoerd. Deze test wordt dus niet uitgewerkt. Vermits de Quantum Blue Calprotectin methode gebruikt wordt in een extern labo en deze waardes gebruikt werden in het Jan Yperman Ziekenhuis, zal deze methode ook mee gevalideerd worden met de andere methodes. Als referentie wordt er gebruik gemaakt van de kliniek van de patiënten. Deze informatie wordt vertrouwelijk verkregen van de gastro-enterologen van de patiënten. De principes van de methodes die vergeleken worden in dit eindwerk, worden verder onder 2. Materiaal en methoden besproken.

20 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine 20 2 Materiaal en methoden In figuur 3 wordt een samenvattende figuur weergegeven. Links zijn de technieken weergegeven die in het labo van het Jan Yperman Ziekenhuis worden uitgevoerd. De werkwijze van de drie methodes wordt kort uitgelegd evenals de manier waarop de drie methodes worden vergeleken. De fecesstalen worden voorlopig doorgestuurd naar een labo waar de Quantum Blue Calprotectin techniek gebruikt wordt om het FC te bepalen. Deze techniek wordt ook bekeken samen met de drie technieken die vergeleken moeten worden. Figuur 3: Samenvattende figuur van de verschillende methodes gebruikt in dit eindwerk

21 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine EliA Calprotectin 2 De EliA Calprotectin 2 wordt gebruikt om een kwantitatieve meting uit te voeren van calprotectine in humane stoelgang. Deze methode wordt uitgevoerd met het toestel ImmunoCAP Principe De verbeterde EliA test is nog niet lang op de markt gebracht door de firma Phadia. Het principe is gelijkaardig aan de ELISA techniek. De ELISA techniek is een immunologische test. De EliA Calprotectin 2 wells zijn gecoat met monoclonale antistoffen gericht tegen calprotectine. Het staal wordt geïncubeerd en de te meten antigenen, indien aanwezig in het staal, binden op deze antistoffen. Alle niet gebonden componenten dienen weggewassen te worden. Daarna wordt een tweede enzym-gemerkte antilichaam toegevoegd die gericht is tegen calprotectine (EliA Calprotectin 2 Conjugate). Er wordt een calprotectine-conjugaat complex gevormd. Na incubatie wordt de niet gebonden conjugaat weggewassen. Daarna wordt het complex geïncubeerd met een development solution en ontstaat er een fluorescent eindproduct. Na het stoppen van de reactie (stop solution) wordt het fluorescent eindproduct niet verder gevormd. De fluorescentie wordt gemeten. De intensiteit van de fluorescentie is recht evenredig met de concentratie van calprotectine. Zo wordt de concentratie van het antigen bepaald. (Labaere, 2012) Dit principe wordt weergegeven in figuur 4 (Thermo Fisher Scientific, 2012). Deze ELISA-test is kwantitatief, heeft een hoog meetbereik en er is controlemateriaal beschikbaar. Deze test loopt na extractie volledig automatisch op het toestel ImmunoCAP 250. (Labaere, 2012) Wash + conjugaat Wash + Development Solution Stop Solution + meting fluorescentie Figuur 4: Principe van de EliA Calprotectin 2 methode

22 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine Materiaal Allereerst moet het calprotectine geëxtraheerd worden uit het fecesstaal. De methode die hiervoor gebruikt wordt, is de Faecal sample preparation kit. Het materiaal die hierbij nodig is, wordt weergegeven in figuur Figuur 5: Materiaal vereist voor de uitvoering van de extractiemethode van Faecal sample preparation kit : 1: EliA Calprotectin 2 Extraction Buffer, 2: Extractietube, 3: Spatel, 4: Extractiedopje 1. EliA Calprotectin 2 Extraction Buffer: Dit is een Tris-buffer. Er zitten zes flesjes in de kit van elk 117 ml. Er kunnen 15 extracties uitgevoerd worden met één flesje. Dit wordt bewaard bij 2-8 C. 2. Extractietube 3. Spatel om feces te nemen 4. Extractiedopje De werkwijze om het calprotectine te extraheren uit het fecesstaal wordt beschreven in Werkwijze. In figuur 6 wordt het materiaal, die nodig is voor de EliA Calprotectin 2 methode te kunnen uitvoeren, weergegeven. Dit is het materiaal die op het toestel zelf nodig is. Deze methode wordt uitgevoerd op het toestel ImmunoCAP 250. Dit toestel wordt beschreven in 2.2 ImmunoCAP 250. Het materiaal die dit toestel nodig heeft om een bepaling te kunnen uitvoeren wordt daar ook beschreven.

23 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine Figuur 6: Materiaal vereist voor de uitvoering van de Elia Calprotectin 2 test: 1: EliA Calprotectin 2 Wells, 2: EliA Calprotectin 2 Calibrator Wells, 3: EliA Calprotectin Positive Control 250, 4: EliA Calprotectin Negative Control 250, 5: EliA Calprotectin 2 Conjugate 50, 6: EliA Calprotectin 2 Calibrator Strips, 7: EliA Calprotectin 2 Curve Control Strips 1. EliA Calprotectin 2 Wells: Deze zijn gecoat met monoklonale antilichamen tegen calprotectine. In een kit zitten vier dragers met elk 16 welletjes. Er kunnen dus 64 testen uitgevoerd worden. 2. EliA Calprotectin 2 Calibrator Wells: Deze welletjes zijn gecoat met monoklonale muis antilichamen. Er zitten vier dragers in de kit met telkens 16 welletjes. Er kunnen dus 64 testen uitgevoerd worden. 3. EliA Calprotectin Positive Control 250: Menselijke calprotectine in PBS. In de kit zit er één strip met 6 afzonderlijke putjes. Een controle wordt altijd in duplo uitgevoerd. Men voert dus twee keer een controle uit in hetzelfde putje. 4. EliA Calprotectin Negative Control 250: Idem aan Elia Calprotectin Postive Control EliA Calprotectin 2 Conjugate 50: β-galactosidase anti-calprotectine (muis monoklonale antilichamen gericht tegen calprotectine) in PBS. Er zitten 6 flesjes in de kit van elk 5 ml. Met 1 flesje kunnen er ongeveer 50 bepalingen gebeuren. 6. EliA Calprotectin 2 Calibrator Strips: Er zitten 5 strips in de kit. Elke strip bevat 6 putjes. In ieder putje zit er 3 ml humaan calprotectine van telkens een andere concentratie. De oplopende concentratie van het humaan calprotectine in de strip is 0, 3, 10, 20, 200, 750 ng/ml. Eén strip is goed voor één kalibratiecurve. 7. EliA Calprotectin 2 Curve Control Strips: De kit bevat 5 strips met telkens 6 putjes die gevuld zijn met 3 ml humaan calprotectine. Al dit materiaal dient bewaard te worden bij 2-8 C tot de houdbaarheidsdatum.

24 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine Werkwijze Het staal dient vooraf geëxtraheerd te worden. De methode die hiervoor gebruikt wordt, is de Faecal sample preparation kit. Deze kit komt van de firma Roche Diagnostics en kan gebruikt worden door het toestel van Thermo Fisher Scientific. De procedure van deze kit gaat als volgt: 1) Weeg het lege extractiedopje af dat bedoeld is om het staal in te brengen. 2) Breng ongeveer 0,100 g gehomogeniseerd staal over in het extractiedopje met het voorziene spateltje. 3) Weeg hoeveel gehomogeniseerd staal er in het extractiedopje werd overgebracht. 4) Neem 75 keer het staalgewicht van de EliA Calprotectin 2 Extraction Buffer. Als er bijvoorbeeld 0,100 g staal afgewogen wordt dan moet er 7,5 ml buffer worden toegevoegd. 5) Sluit de extractietube. 6) Vortex de extractietube om het staal volledig te homogeniseren. Bij zeer vast staal dient men nog eens extra lang te vortexen zodat de buffer verkleurt van roze naar bruinachtig kleur. 7) Laat de extractietube 10 minuten incuberen op kamertemperatuur. 8) Breng 1-2 ml van de gehomogeniseerde oplossing in een eppendorf tube en centrifugeer vijf minuten aan 3000 g. 9) Breng het supernatans over in een nieuwe tube. 10) Deze tube wordt op het toestel ImmunoCAP 250 geplaatst Kalibratie Er moet telkens een nieuwe kalibratiecurve worden uitgevoerd op het toestel ImmunoCAP 250 wanneer: - de laatste kalibratie meer dan een maand geleden is. - een nieuw lotnummer van de EliA Calprotectin 2 Conjugate begonnen is. Indien er geen kalibratie gebeurt, wordt er per run een controlecurve meegenomen Interpretatie van de resultaten Tabel III: Interpretatie van EliA calprotectin 2 testresultaten Test Eenheid Negatief Positief EliA Calprotectin 2 µg/g In tabel III wordt de interpretatie van EliA Calprotectin 2 testresultaten weergegeven. Het gaat om een kwantitatieve meting. De test geeft een exacte waarde met een meetbereik van 3,8 tot meer dan 6000 µg/g feces. Vervolgens interpreteert het toestel ImmunoCAP 250 deze waarde volgens tabel III. De test is dus ofwel positief (indien 50) ofwel negatief (indien 50). (Phadia 250, 2014)

25 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine ImmunoCAP 250 Het toestel ImmunoCAP 250, ook wel Phadia 250 genoemd, wordt weergegeven in figuur 7. Onderaan ziet men de wash-, rinse- en waste bidon. De waste bidon wordt niet meer gebruikt, het vervuilde water is rechtstreeks verbonden met de afvoer. Figuur 7: ImmunoCAP 250 van de firma Phadia voor de geautomatiseerde uitvoering van de EliA Calprotectin 2 test voor de bepaling van fecaal calprotectine Principe Het principe werd al reeds beschreven in Principe Materiaal In figuur 8 wordt het materiaal weergegeven die nodig is op het toestel ImmunoCAP 250. Het overige materiaal om een assay uit te voeren wordt hieronder ook beschreven. Dit is voor iedere test anders. Het materiaal (Cal Wells, EliA Wells, kalibratorstrips, curve controle strips ) die erbij komt om calprotectine te bepalen, wordt beschreven in Materiaal Figuur 8: Materiaal voor ImmunoCAP 250: 1: Development Solution, 2: Stop Solution, 3: EliA Sample Diluent 1. Development Solution 2. Stop Solution 3. EliA Sample Diluent

26 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine 26 verdunningsplaten Wash (Washing Solution Conc. (400 ml) + Washing Solution Additive (86 ml)) Rinse Werkwijze Vooraleer het toestel klaar is om testen uit te voeren, dient men het toestel te laden met de nodige reagentia die het toestel nodig heeft gedurende de testprocedures. Het toestel moet voorzien worden van Development Solution, Stop Solution, Cal Wells, EliA Wells en de kalibrator- of curve controle strips. Om iets op het toestel te plaatsen moet de barcode scanner geactiveerd worden. Dit doet men door er op te duwen. Nu kan alles worden gescand en op het toestel worden geplaatst. De verdunningsplaten blijven op het toestel, maar moeten nog eens gecontroleerd worden of ze niet volledig opgebruikt zijn. Het conjugaat blijft ook op het toestel, maar de flesjes moeten nog ontdaan worden van hun dopje. Dit dient zeer voorzichtig te gebeuren omdat ze vrij gevoelig zijn voor contaminatie. Het conjugaat wordt op het toestel koel gehouden. Indien nodig moet de rinse en de wash oplossing ook aangevuld worden in de bidons die zich onderaan het toestel bevinden. De rinse is gewoon gedestilleerd water. De wash oplossing moet vooraf gemaakt worden. Vul de bidon met gedestilleerd water tot aan de maatstreep van 5 l. Hierbij voegt men 1 fles Washing Solution Conc. (400 ml). Meng daarna de bidon zodat men een homogene oplossing bekomt. Voeg nu 1 flesje Washing Solution Additive (86 ml) toe en meng opnieuw. Deze oplossing kan 5 dagen op kamertemperatuur bewaard worden. Hierna wordt de wash oplossing weggegooid en wordt er nieuwe aangemaakt. (Joseph, 2015) Dit wordt als voorbereiding gedaan door de technoloog om vervolgens het toestel te starten. Het toestel doet zijn bepaling volgens het principe dat beschreven staat in Principe

27 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine CalproSmart Office TM De CalproSmart TM wordt gebruikt om het ziekteverloop van patiënten met chronische IBD op te volgen. De CalproSmart TM -thuistest is oorspronkelijk gemaakt om de test thuis uit te kunnen voeren. De CalproSmart Office TM werd ontwikkeld om de test ook in het labo te kunnen uitvoeren. Met behulp van de CalproSmart TM -applicatie kan het resultaat worden afgelezen met een smartphone Principe Deze test is gebaseerd op de voorbereiding van een ontlastingsmonster met de fecale extractiebuffer. De hoeveelheid calprotectine wordt bepaald door het extract te testen in een laterale immunochromatische test speciaal bedoeld voor calprotectine. Deze test is een kwantitatieve detectie voor de bepaling van menselijk calprotectine in fecesstalen. Het staalextract wordt toegevoegd aan het welletje van de testcassette en laat toe om te reageren met goud-geconjugeerde antilichamen die binden met calprotectine. Dit complex vloeit over het membraan en bindt zich aan de geïmmobiliseerde calprotectine specifieke antilichamen aanwezig op de testlijn. Deze immobilisatie veroorzaakt het verschijnen van een testlijn. De goudgeconjugeerde antilichamen zonder gebonden antigeen (calprotectine) worden geïmmobiliseerd op de controlelijn. Na incubatie wordt de concentratie van het calprotectine in het staal berekend met behulp van de CalproSmart TM smartphone applicatie. De concentratie van het calprotectine in het staal is evenredig aan de kleurintensiteit (Calpro, 2015) Materiaal In figuur 9 wordt het materiaal van de CalproSmart Office TM kit weergegeven. In deze kit zit het volgende: - Extractiebuisje (B): Dit is gevuld met 5 ml Calpro fecale extractiebuffer. Als er 10 mg ontlastingsmonster wordt genomen dan heeft men een 1:500 extract. - Testcassettes (C): De testcassettes zijn apart verpakt in aluminiumfolie met een zakje droogmiddel. Op de testcassette is er een QR-code (soort barcode) voorzien. Zodra de smartphone deze code leest, weet de applicatie dat het over deze test gaat en kan hij zo de test aflezen en valideren. Nadien kunnen de cassettes weggegooid worden. - Houder (D): Dit is een plastiek houdertje waar de testcassette in geplaatst kan worden. Aan de zijkant is de houder voorzien van witte markeringen. Hiermee kan de smartphoneapplicatie de positie van de controle- en testlijn identificeren en het testresultaat lezen (Calpro, 2015). Figuur 9: Materiaal van de CalproSmart Office TM kit voor de bepaling van fecaal calprotectine

28 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine Opslag testkit De kit kan bewaard worden bij 2-8 C tot aan de houdbaarheidsdatum, indien deze ongeopend blijft. De kit mag niet worden blootgesteld aan hoge temperaturen en direct zonlicht Registratie en downloaden van de applicatie als de patiënt de CalproSmart test thuis wil uitvoeren Als de patiënt eenmaal door het ziekenhuis geregistreerd is, voert de gebruiker (behandelende arts) de naam van de patiënt, de geboortedatum en het adres in. Als dit is gebeurd, ontvangt de patiënt een op het geregistreerde adres. Daarna moet de patiënt een wachtwoord instellen op de webpagina Na het instellen van het wachtwoord is de patiënt klaar om de CalproSmart-applicatie te downloaden van de itunes App store of Google Play store. De patiënt moet akkoord gaan met de eindgebruikersovereenkomst om zich te kunnen registeren in het systeem. Als de test thuis wordt uitgevoerd, dan dient men zich op de applicatie in te loggen met de eigen gebruikersnaam en wachtwoord (Calpro, 2015) Smartphone applicatie validatie Nadat de CalproSmart TM -applicatie geïnstalleerd is op de smartphone, is het nodig om de functionaliteit te valideren door een test uit te voeren. De test gaat als volgt: 1) Open de CalproSmart TM -applicatie op de smartphone 2) Druk op Gebruiker wijzigen 3) Log in op het systeem met: Gebruikersnaam: Smart@calpro.no Wachtwoord: Calpro 4) Druk op het camerasymbool Lees nu de test 5) Houd uw smartphone zo vast dat het gele kader op uw scherm precies overeenkomt met de randen van de houder in het plaatje hieronder. Het lichtgroene vierkantje moet over de QRcode vallen. 6) Er wordt nu automatisch een foto gemaakt 7) Als het testresultaat Ernstig > 1500 aangeeft, werkt de applicatie zoals het moet 8) Druk op verwijder 9) Log uit bij de applicatie (Calpro, 2015)

29 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine Werkwijze De kit dient voor gebruik op kamertemperatuur te komen. Het materiaal in de kit dient ook gecontroleerd te worden op enige beschadiging Extractie van calprotectine 1) Trek eerst handschoenen aan vooraleer de testkit wordt gebruikt. Neem het extractiebuisje. Draai de witte afsluitdop eraf door hem uit het slotje te halen. Trek de dop en het staafje vervolgens recht omhoog. Steek het uiteinde van het staafje in het staal zodat beide groeven in het staafje volledig met monster worden gevuld. Steek het staafje enkele malen op verschillende plaatsen in de ontlasting. Zorg ervoor dat de groeven niet gevuld worden met luchtbellen. Vermijd hierbij ook granen, vezels,. 2) Houd het buisje vast en steek het staafje met de ontlasting door het gaatje dat aanwezig is in de blauwe afsluitdop. Het teveel aan ontlasting blijft achter in het trechtervormige gedeelte van de blauwe afsluitdop. Schroef de witte afsluitdop terug op de blauwe afsluitdop totdat de dop terug in zijn slotje zit. Zorg ervoor dat het buisje goed is afgesloten en vortex gedurende drie minuten (Calpro, 2015). Deze werkwijze wordt weergegeven in figuur 10. Figuur 10: Voorbereidende extractie van het staal voor de bepaling van fecaal calprotectine met de CalproSmart Office TM kit Testprocedure 1) Plaats de testcassette in het houdertje en leg deze op een horizontaal oppervlak, bijvoorbeeld een tafel. 2) Draai de rode afsluitdop eraf en verwijder de eerste druppel door het uiteinde van het buisje voorzichtig op een stuk toiletpapier of tissue te drukken 3) Houd het buisje verticaal boven de testcassette en breng twee druppels (ongeveer 80 µl) aan op de ronde opening van de testcassette. Laat de testcassette gedurende 15 minuten op een horizontaal oppervlakte bij kamertemperatuur liggen. Eens de 15 minuten verstreken zijn dan heeft men twee minuten tijd om de test af te lezen met de smartphone-applicatie. Deze testprocedure wordt weergegeven in figuur 11.

30 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine 30 Figuur 11: Testprocedure CalproSmart Office TM deel 1, waarbij het extract op de testcassette wordt gebracht 4) Houd de smartphone horizontaal boven het houdertje met daarin de testcassette. 5) Er wordt automatisch een foto genomen zodra de smartphone-applicatie de QR-code, testen controlelijn herkent. De applicatie vertaalt de kleurintensiteit van de lijnen naar de hoeveelheid calprotectine in de monsterontlasting van patiënten en geeft deze weer in mg/kg. 6) Het resultaat wordt vertoond in een lijn met groen, geel en rode kleur waarmee de mate van ziekteactiviteit wordt aangeduid. In figuur 12 wordt de werkwijze voor de smartphone-applicatie weergegeven. Figuur 12: Testprocedure CalproSmart Office TM deel 2: aflezing met de smartphone-applicatie Een verkeerd uitgevoerde procedure, het opnemen van een verkeerde hoeveelheid ontlastingsmonster in het extractiebuisje of het opbrengen van een verkeerde hoeveelheid extractievloeistof op de testcassette kunnen leiden tot een vals-positieve of een negatieve uitslag. De gebruiker van de CalproSmart Office TM moet een arts raadplegen voordat hij of zij op basis van de resultaten de medicatie wijzigt, tenzij de behandelende arts dit vooraf goedgekeurd heeft. Figuur 13: Smartphone-applicatie van CalproSmart Office TM In figuur 13 wordt de smartphone-applicatie van Calprosmart Office TM weergegeven. Er zijn drie tabbladen voorzien. Het eerste tabblad vertoont een camera-icoontje om een foto van de test te nemen. Het tweede tabblad dient om een overzicht van de resultaten weer te geven. In figuur 13 is dit tabblad weergegeven. Wanneer men dan een resultaat kiest om te bekijken, bekomt men het resultatenscherm dat weergegeven wordt in figuur 14. Het derde tabblad kan worden gebruikt om een volgende test in te plannen (Calpro, 2015).

31 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine Interpretatie CalproSmart Office TM -testresultaten Wanneer er een foto wordt getrokken van het resultaat met de CalproSmart Office TM smartphoneapplicatie, verschijnt er een resultatenscherm. Een voorbeeld van zo n resultatenscherm wordt weergegeven in figuur 14. Bovenaan wordt het resultaat weergegeven. Daaronder is er een band zichtbaar met drie kleuren. De interpretatie van deze kleuren wordt weergegeven in tabel IV. Daaronder worden enkele waardes weergegeven van de test. De datum en de tijd wanneer het resultaat bepaald werd. Daarnaast vinden we ook de afkortingen TL, CL en T/C. TL (testlijn) staat voor de intensiteit van de gemeten testlijn en CL (controlelijn) staat voor de intensiteit van de gemeten controlelijn. Wanneer je dan de waardes van TL deelt door de CL (T/C), komt men een getal uit die wordt gebruikt voor het bepalen van het calprotectine niveau. Figuur 14: Voorbeeld van een resultatenscherm met de CalproSmart Office TM smartphone-applicatie Tabel IV: Interpretatie van de CalproSmart Office TM -testresultaten Mate van ziekteactiviteit Kleur van de lijn Hoeveelheid calprotectine Milde ziekteactiviteit Groen < 200 µg/g Matige ziekteactiviteit Geel µg/g Ernstige ziekteactiviteit Rood > 500 µg/g Het is uiterst belangrijk dat de diagnose niet gesteld wordt op basis van één enkel testresultaat. De diagnose moet hoofdzakelijk gebaseerd worden op de klinische voorgeschiedenis en symptomen. De CalproSmart Office TM -testresultaten kunnen een hulpmiddel zijn om te kijken of er nog verder onderzoek moet gedaan worden, zoals een endoscopie. (Calpro, 2016) Deze test is ontwikkeld om de patiënten met IBD gemakkelijker op te kunnen volgen. De patiënten kunnen thuis de kit zelf gebruiken. Het resultaat wordt via de smartphone-applicatie doorgestuurd naar een softwareprogramma waar de gastro-enterologen de resultaten kunnen bekijken. De gastroenterologen kunnen dan opmerken wanneer de patiënt een opstoot gaat krijgen. Ze maken een afspraak met de patiënt om hem verder te onderzoeken in het ziekenhuis. Naargelang dit resultaat kunnen de gastro-enterologen dan de dosis van de medicatie veranderen.

32 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine Certest Calprotectin Principe De Certest Calprotectin is gebaseerd op het principe van een gekleurde chromatografische immunobepaling voor de semi-kwantitatieve detectie van menselijk calprotectine in fecesstalen. In figuur 15 is een testkaart weergegeven van de Certest Calprotectin Strip A en B bevatten een nitrocellulose membraan op het resultaatschermpje (testlijn + controlelijn). Dit nitrocellulose membraan op de testlijn is gecoat met monoklonale muis antilichamen. Die op het resultaatschermpje is gecoat met konijn polyklonale antilichamen gericht tegen menselijk calprotectine. De membraan op de controlelijn is gecoat met antilichamen gericht tegen specifieke proteïnes. Het testveld, waarover het staal vloeit, is bedekt met test label solution (rode kleur) op de testlijn en met control label solution (groene kleur) op de controlelijn. De test label solution bevat monoklonale muis antilichamen gericht tegen menselijk calprotectine. Indien het staal positief is voor humaan calprotectine bij een concentratie van 50 µg/g, reageren de antigenen van het staal met het rood gekleurde conjugaat complex in het testveld van strip A. Indien het staal positief is voor menselijk calprotectine bij een concentratie van 200 µg/g, reageren de antigenen van het staal met het rood gekleurde conjugaat complex in het testveld van strip B. Wanneer het staal verder migreert doorheen het testveld dan migreren de conjugaat complexen mee. De anti-humane calprotectine antilichamen die op het membraan van strip A en B zitten bij de testlijn nemen de gekleurde conjugaat vast en de rode lijn zal zichtbaar zijn in allebei de strips. Het verschil tussen strip A en strip B zat men in de variatie in antilichaamconcentraties op de testmembranen. Hierdoor kan de concentratie calprotectine in het staal vergeleken worden ten opzichte van verschillende cutoff waardes. Indien het staal negatief is, is er geen humaan calprotectine aanwezig in het staal. Er worden bijgevolg geen rood gekleurde conjugaat complexen gevormd. Als het staal verder migreert, migreren er geen rood gekleurde conjugaat complexen mee omdat er geen gevormd zijn. Er kan dus geen rode lijn verschijnen op de testlijn. Het staal migreert verder doorheen het testveld naar de controlelijn. Als het staal nu positief of negatief is, de antilichamen gericht tegen specifieke proteïnes gaan controle groene conjugaat complexen vastnemen en de beide controlelijnen zullen verschijnen. Deze controlelijnen vormen een bevestiging voor het feit dat het juist correcte volume gebruikt is bij de test, de migratie goed doorgekomen is en de reagentia nog optimaal zijn (Certest biotec S.L, 2013). Controlelijn Testlijn Migratie Figuur 15: Certest Calprotectin combo testkaart

33 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine Materiaal Het materiaal dat nodig is bij de Certest Calprotectin wordt weergegeven in figuur Figuur 16: Materiaal in de Certest Calprotectin voor de bepaling van fecaal calprotectine, namelijk de Certest Calprotectin combo testkaarten (1) en de staalcollectie tubes met verdunningsvloeistof (2) Werkwijze Staalvoorbereiding 1) Neem de dop uit de staalcollectie tube en gebruik het staafje om staal op te nemen. Steek het staafje in vier verschillende plaatsen in het staal om zo het fecesstaal te collecteren. Breng het staafje daarna terug in de staalcollectie tube. Bij vloeibare stalen neemt men 15 µl staal met een micropipet en brengt dit in de staalcollectie tube. 2) Sluit de tube met de verdunningsvloeistof en het staal. Vortex de tube drie minuten zodat alles goed gehomogeniseerd is. Dit kan worden bewaard in de koelkast bij 2-8 C gedurende 7 dagen. (Certest biotec S.L, 2013) In figuur 17 wordt de staalvoorbereiding weergegeven. Figuur 17: De CerTest Calprotectin staalvoorbereiding

34 Vergelijkende studie van drie methodes voor de bepaling van fecaal calprotectine Testprocedure 1) Neem de CerTest Calprotectin combo testkaart uit de verpakking juist voor gebruik. Op figuur 15 wordt de testkaart weergegeven. Links gebeurt de testprocedure voor de detectie van 50 µg/g FC en rechts de testprocedure voor de detectie van 200 µg/g FC. 2) Neem de staalcollectie tube en breek het einde van het dopje af. Laat vier druppels vallen in het ronde venstertje dat gemerkt is met de letter A. Doe hetzelfde bij het ronde venstertje dat gemerkt is met de letter B. Vermijd vaste partikels in de vloeistof. 3) Lees de testresultaten af na 10 minuten. Lees ze niet later af. In figuur 18 wordt de testprocedure weergegeven. Figuur 18: De CerTest Calprotectin testprocedure Interpretatie van de resultaten De mogelijke resultaten die bekomen kunnen worden, zijn weergegeven in tabel V. Er zijn drie testresultaten mogelijk en één niet interpreteerbaar testresultaat. De drie betrouwbare en mogelijke testresultaten worden weergegeven in figuur 19. Het niet interpreteerbaar testresultaat wordt weergeven in figuur 20. Er kunnen ook testresultaten bekomen worden waarbij er geen controlelijn ontstaat. Dit zijn ook niet interpreteerbare testresultaten en mogen dus niet als betrouwbaar worden aanschouwd (Certest biotec S.L, 2013). Figuur 19: Drie betrouwbare testresultaten bij CerTest Calprotectin Figuur 20: Niet interpreteerbaar testresultaat bij CerTest Calprotectin