Immuunserologische diagnostiek van systeemziekten

Transcriptie

1 Immuunserologische diagnostiek van systeemziekten Trefwoorden - antinucleaire antistoffen - anti-ena; anti-ds-dna - SLE - gesystematiseerde auto-immuunziekten - antifosfolipide antistoffen - antifosfolipide syndroom - antineutrofiele cytoplasmatische antistoffen - anti-proteïnase 3 - antimyeloperoxidase - systemische vasculitis - ziekte van Wegener Samenvatting Serologische diagnostiek naar autoantistoffen is van groot belang bij de klinische evaluatie van patiënten met verdenking op systeemziekten. Autoantistoffen tegen kernantigenen (ANA) zijn karakteristiek voor SLE en verwante ziektebeelden. Antistoffen tegen specifieke kernbestanddelen zijn geassocieerd met specifieke klinische ziektebeelden binnen deze groep. Fluctuaties van antistoffen tegen DNA lopen, tot op zekere hoogte, parallel met de klinische activiteit bij SLE. Antifosfolipide antistoffen zijn geassocieerd met trombo-embolische processen, zowel veneus als arterieel. Antistoffen tegen cytoplasmatische bestanddelen van myeloïde cellen (ANCA) zijn nauw geassocieerd met verschillende vormen van systemische vasculitis, maar worden ook bij andere ontstekingsziekten aangetroffen. Binnen deze groep is de aanwezigheid van antistoffen tegen proteïnase 3 en myeloperoxidase een sensitieve en ook in hoge mate specifieke graadmeter voor systemische vasculitis. (Ned Tijdschr Allergie 2001;2:78-82) Auteur C.G.M. Kallenberg Inleiding Gesystematiseerde auto-immuunziekten worden enerzijds gekenmerkt door de betrokkenheid van meerdere orgaansystemen bij het ziekteproces, anderzijds door het voorkomen van autoantistoffen tegen antigenen die niet specifiek zijn voor één bepaald orgaan. In deze bijdrage zullen drie categorieën van autoantistoffen besproken worden: antinucleaire antistoffen (ANA), antistoffen tegen fosfolipiden en antineutrofiele cytoplasmatische antistoffen (ANCA). De betekenis van autoantistoffen tegen kernantigenen 1,2 Bij patiënten met gesystematiseerde auto-immuunziekten (AIZ) worden vaak antinucleaire antistoffen in het serum aangetroffen. Deze antistoffen kunnen gericht zijn tegen verschillende bestanddelen (antigene structuren) van de kern. Gebleken is dat klinisch nauw omschreven ziektebeelden samengaan met het voorkomen van ANA met specificiteit voor één bepaald kernantigeen. Bepaling van de antigene specificiteit van ANA is derhalve van belang voor de diagnostiek van gesystematiseerde auto-immuunziekten. Techniek van de ANA-bepaling De oudste methode ter detectie van ANA is de LEcel test. Deze test berust op de binding van ANA aan kernen, die in vivo of in vitro beschadigd zijn. Sommige van deze ANA binden complement en trekken granulocyten aan, die het met antistoffen beladen kernmateriaal fagocyteren. De granulocyt met het gefagocyteerde en gehomogeniseerde kernmateriaal wordt de LE-cel genoemd. Momenteel wordt voor de bepaling van ANA meestal gebruik gemaakt van de indirecte immunofluorescentietechniek (IIF) op kernhoudende cellen. Met deze techniek is het mogelijk verschillende kernfluorescentiepatronen te onderscheiden. De verschillen in patronen berusten op verschillen in antigene specificiteit van de antistoffen. Daarnaast is het mogelijk door middel van serumtitratie een kwantitatieve indruk te krijgen van ANA in een serummonster. Bij de test worden meestal monolagen van in kweek gebrachte cellijnen gebruikt. Hoewel de fluorescentiepatronen van ANA een indruk geven van de antigene specificiteit van de antistoffen, is het voor de nauwkeurige bepaling van antistoffen tegen specifieke antigenen, bijvoorbeeld dubbelstrengs-dna, noodzakelijk dit antigeen min of meer zuiver ter beschikking te hebben. Deze bijdrage beperkt zich tot de bepaling van antistoffen tegen DNA en tegen extraheerbare kernantigenen (ENA). Antistoffen tegen (dubbelstrengs) DNA kunnen op verschillende wijzen worden aangetoond. Met de zo- 78 A P R I L - M E I N R. 2

2 antigene specificiteit ziekte-associatie sensitiviteit specificiteit ANA (IIF) SLE % laag ds-dna SLE 70% hoog nrnp (U1 RNP) MCTD 100%? Sm SLE 25% hoog SS-A (=Ro) SLE 45% matig Sjögren 70% matig SS-B (=La) Sjögren 30% hoog SLE 10% PM-Scl Polymyositis 10% hoog (scleroderma overlap) Jo-1 Polymyositis 20% hoog (longafwijkingen) Scl-70 (topo-isomerase 1) Systeem Sclerodermie 30% hoog Tabel 1. Specificiteit van ANA en ziekte-associaties. Centromeereiwitten CREST/sclerodermie 30% hoog (limited cutaneous) Toelichting: SLE: gesystematiseerde lupus erythematodes MCTD: mixed connective tissue disease CREST: vorm van sclerodermie gekenmerkt door calcinosis, het fenomeen van Raynaud, hypotonie van de oesofagus, sclerodactylie, en teleangiëctasieën. De klinische diagnose van de hierboven genoemde ziekten berust op de aanwezigheid van een omschreven aantal karakteristieke klinische kenmerken ("criteria") zoals vastgesteld door een groep internationale experts op het gebied van de genoemde ziekten. genaamde Farr-techniek worden precipiterende, veelal hoog avide, dat wil zeggen sterk bindende anti-dna antistoffen gedetecteerd. Radioactief gelabeld DNA wordt door binding aan deze antistoffen geprecipiteerd in een half verzadigde ammoniumsulfaat-oplossing. De hoeveelheid radioactiviteit in het precipitaat is een maat voor de hoeveelheid anti-dna antistoffen in het monster. Door de precipitatie te vergemakkelijken met polyethyleenglycol kunnen in deze test ook laag avide, dat wil zeggen zwak bindende, anti-dna antistoffen worden aangetoond. Een tweede methode is de IIF op Crithidia luciliae. De kinetoplast van deze flagellaten bevat zuiver dubbelstrengs DNA (ds-dna) en is derhalve een uitstekend substraat voor de bepaling van hiertegen gerichte antistoffen. Door middel van serumtitratie kan kwantificering van de antistoffen plaatsvinden. In deze test worden ook laag avide antistoffen aangetoond. Daarnaast zijn ook zgn. ELISA-technieken ontwikkeld voor de bepaling van anti-dna-antistoffen. Antistoffen tegen extraheerbare kernantigenen (ENA) worden meestal bepaald met de counterimmunoelectroforese (CIE) techniek. Met deze techniek worden precipiterende antistoffen tegen ENA gedetecteerd. Dit ENA, een extract uit kernen, die meestal afkomstig zijn van de kalfsthymus, bevat verschillende antigenen. Door nu gebruik te maken van zogenaamde referentiesera (internationaal verspreide standaardsera met antistoffen tegen nauwkeurig omschreven antigenen) kan de identiteit van een te testen serum worden vastgesteld. Op deze wijze kunnen antistoffen tegen nucleair ribonucleoproteïne (nrnp), tegen het zgn. Sm-antigeen, tegen SS-A, SS-B, PM-1, en andere antigenen worden bepaald (zie Tabel 1). Daarnaast worden anti-nrnp antistoffen ook bepaald door de CIE uit te voeren met RNase behandeld ENA. Behandeling met het enzym RNase breekt het RNA af waardoor de structuur van het nrnp, een RNA-eiwit complex, verloren gaat. Wanneer RNase behandeling van het ENA resulteert in het verdwijnen van de precipitatielijn, is dit een aanwijzing voor anti-nrnp antistoffen. Voor het aantonen van anti-ss-a (= Ro) via CIE wordt gebruik gemaakt van humane miltcellen als antigene bron. Deze antistoffen geven vaak een negatieve uitslag in de routine ANA-test! Een andere mogelijkheid is de immunoblottings-techniek voor de bepaling van antistoffen tegen kernantigenen. Hierbij kan rechtstreeks afgelezen worden tegen welke specifieke N e d e r l a n d s T i j d s c h r i f t v o o r A l l e r g i e 79

3 Tabel 2. Antifosfolipiden syndroom, associaties. Veneuze trombose Arteriële trombose Herhaalde miskramen/vroeggeboorten Trombocytopenische purpura in combinatie met hemolytische anemie Andere klinische manifestaties Diep veneuze trombose Longembolieën Chiari Budd syndroom Niervene trombose Vena centralis retinae trombose CVA, TIA, amaurosis fugax Myocardinfarct Claudicatio intermittens Livedo reticularis, migraine, epilepsie, chorea, myelopathie, hartklepafwijkingen, pulmonale hypertensie, ziekte van Addison, huidulcera, ischemische botnecrose eiwitten uit het eerder genoemde extract de antistoffen gericht zijn. Een toenemend aantal van deze kernantigenen is, met behulp van de recombinant DNA-techniek, thans in gezuiverde vorm beschikbaar. Deze zuivere antigenen kunnen in ELISA-tests gebruikt worden voor het kwantitatief aantonen van de desbetreffende autoantistoffen. Diagnostische betekenis 1. Betekenis van een positieve ANA-test Een positieve ANA-test is niet pathognomonisch voor SLE, doch wordt ook bij andere gesystematiseerde auto-immuunziekten aangetroffen. Bovendien komt een positieve test ook voor tijdens het gebruik van sommige geneesmiddelen, zoals bijvoorbeeld apresoline en d-penicillamine en bij gezonde personen (met name bij oudere vrouwen). Hoge titers worden echter vooral bij patiënten met auto-immuunziekten gevonden. Het fluorescentiepatroon van de ANA geeft een zekere differentiatie naar de aard van de gesystematiseerde auto-immuunziekten, doch dit is zeker niet absoluut. Een homogeen patroon wordt vooral bij gesystematiseerde lupus erythematodes (SLE) en reumatoïde arthritis (RA) gezien; een grof gespikkeld patroon bij mixed connective tissue disease (MCTD), maar ook bij SLE. Het nucleolaire patroon is betrekkelijk specifiek, maar niet gevoelig voor sclerodermie. Het fijn gespikkelde patroon wordt veelal gezien bij antistoffen tegen centromeer-eiwitten. Wanneer derhalve bij een patiënt een positieve ANA-test wordt gevonden, met name in de vorm van een hoge titer, is het enerzijds van belang klinisch onderzoek naar (symptomen van) auto-immuunziekten te verrichten en anderzijds nader serologisch onderzoek te doen. 2. Betekenis van een positieve test voor anti-ds-dna antistoffen Uitgaande van omschreven groepen patiënten met gesystematiseerde auto-immuunziekten (zoals SLE, RA, sclerodermie, etc), orgaanspecifieke auto-immuunziekten, infecties en degeneratieve aandoeningen, blijken anti-ds-dna antistoffen (in de IgG-klasse) vrijwel uitsluitend voor te komen bij patiënten met SLE. Anderzijds blijkt uit routinebepalingen dat een positieve anti-ds-dna test nogal eens voorkomt bij een patiënt bij wie de diagnose SLE (nog) niet gesteld kan worden, doch bij wie wél enkele symptomen van SLE aanwezig zijn. Hoewel de aanwezigheid van anti-ds-dna antistoffen dus in hoge mate specifiek is voor de diagnose SLE, is de sensitiviteit voor SLE beduidend lager. Toch heeft ± 70% van de patiënten met actieve SLE een positieve test voor anti-ds-dna. Dit geeft al aan dat er een relatie is tussen activiteit van de ziekte en aanwezigheid van anti-ds-dna. Inderdaad blijkt een stijging van het gehalte aan antistoffen tegen ds-dna in de meeste gevallen gevolgd te worden door een exacerbatie van SLE. Als zodanig kan kwantificering van anti-ds-dna van nut zijn bij het volgen van patiënten met SLE. Onderzoek van onze groep heeft laten zien dat behandeling op geleide van stijgingen van het gehalte aan anti-ds-dna antistoffen exacerbaties van SLE kan voorkomen zonder dat dit gepaard gaat met een toegenomen gebruik van corticosteroïden en immunosuppressiva. 3. Betekenis van een positieve test voor antistoffen tegen extraheerbare kernantigenen (ENA) Bij een positieve ANA-test kan ook een bepaling verricht worden om eventuele antistoffen tegen ENA te detecteren. Aanwezigheid van anti-nrnp anti- 80 A P R I L - M E I N R. 2

4 Ziekte anti-proteïnase 3 (%) anti-myeloperoxidase (%) Ziekte van Wegener microscopische polyangiitis Tabel 3. Ziekte associaties van antistoffen tegen proteïnase 3 en myeloperoxidase. Idiopathische crescentische glomerulonefritis Syndroom van Churg-Strauss Polyarteriitis nodosa 5 15 stoffen is geassocieerd met MCTD. Naast het nrnp komen in het ENA-preparaat vele andere antigenen voor waartegen antistoffen zijn aangetoond (Tabel 1, op pagina 79). Deze antigenen worden aangeduid met de eerste letters van de naam van de patiënt wiens serum met het betreffende antigeen precipiteerde (Sm, Jo, Ro, La, etc), òf met een afkorting van het ziektebeeld waarmee antistoffen tegen deze antigenen geassocieerd zijn (SS - Sjögren's syndroom, PM - polymyositis, etc). Antistoffen tegen het Smantigeen karakteriseren een groep SLE patiënten met mogelijk een milder ziektebeloop. Antistoffen tegen SS-A (= Ro) zijn geassocieerd met het syndroom van Sjögren (zonder RA), maar komen ook voor bij SLE, waar ze een groep patiënten met vooral huidafwijkingen (subacute cutane LE) en een milder ziektebeloop karakteriseren. Deze antistoffen zijn ook geassocieerd met het neonatale lupus syndroom waarvan het congenitaal hartblock een onderdeel kan zijn. Bij ongeveer 50% van de gevallen met congenitaal hartblock blijken moeders positief te zijn voor anti-ss-a antistoffen, veelal zonder dat zij klinische verschijnselen van een systeemziekte vertonen. Anderzijds leidt de aanwezigheid van deze antistoffen bij een vrouw slechts in ongeveer 2% van de gevallen tot neonatale lupus. Wanneer een vrouw met deze antistoffen eenmaal een zwangerschap met neonatale lupus heeft doorgemaakt, is er 50% kans dat neonatale lupus ook in een volgende zwangerschap optreedt. 4. Betekenis van een positieve test voor antistoffen tegen centromeer-eiwitten (ACA) ACA komen voor bij 57-96% van de patiënten met een relatief beperkte en milde vorm van sclerodermie (het zogenaamde CREST-syndroom). Deze antistoffen komen daarnaast ook voor bij 8-12% van de patiënten met een uitgebreide vorm van sclerodermie, alsmede bij patiënten met het fenomeen van Raynaud en beginnende sclerodermie. Betreffende de sensitiviteit en specificiteit van al deze antistoffen voor de verschillende ziektebeelden bestaat nog geen volledige eenduidigheid (Tabel 1, op pagina 79). De betekenis van antifosfolipiden antistoffen 3,4 Antistoffen tegen fosfolipiden werden als eerste bij SLE beschreven als de fout positieve Wassermann reactie en als het zogenaamde lupus anticoagulans. Het lupus anticoagulans ontleent zijn naam aan het fenomeen dat bij aanwezigheid van deze factor een verlengde APTT (geactiveerde partiële tromboplastine tijd) en TT (trombinetijd) gevonden kan worden. Dit fenomeen bleek te berusten op autoantistoffen tegen fosfolipidenstructuren op het tromboplastine waardoor dit laatste geïnactiveerd wordt. In vivo blijken deze autoantistoffen echter geassocieerd te zijn met trombo-embolische processen. Daarnaast zijn een aantal andere associaties beschreven, waaronder livedo reticularis (Tabel 2). Detectie van deze antistoffen kan plaatsvinden door middel van een functionele assay (bepaling van het lupus anticoagulans door middel van stollingstesten) of met behulp van ELISA-systemen waarbij cardiolipine veelal als antigeen wordt gebruikt. De klinische symptomatologie van het zogenaamde antifosfolipidensyndroom wordt vooral gekenmerkt door trombo-embolische processen, zowel veneus als arterieel (Tabel 2). De aanwezigheid van het lupus anticoagulans zoals bepaald door middel van stollingstesten blijkt hechter met dit syndroom geassocieerd te zijn dan de aanwezigheid van antistoffen tegen cardiolipine zoals bepaald door middel van ELISA. De betekenis van anticytoplasmatische antistoffen (ANCA) 5,6 Deze autoantistoffen werden eerst beschreven bij de ziekte van Wegener. Bij deze ziekte werden antistoffen aangetoond die bij IIF een typisch cytoplasma- N e d e r l a n d s T i j d s c h r i f t v o o r A l l e r g i e 81

5 A ANWIJZINGEN VOOR DE PRAKTIJK 1. Een positieve ANA-test heeft een hoge sensitiviteit, maar een lage specificiteit voor de diagnose SLE. 2. Bepaling van de antigene specificiteit van ANA geeft verdere richting aan de diagnostiek van specifieke, gesystematiseerde auto-immuunziekten. 3. Persisterende aanwezigheid van antifosfolipiden antilichamen (met name van de IgG-klasse en in hoge titer) is een evidente risicofactor voor trombo-embolische processen. 4. Een positieve ANCA-test (met name bij een perinucleair (p-anca) of atypisch fluorescentiepatroon) heeft een geringe diagnostische waarde en dient gevolgd te worden door een specifieke test op antistoffen tegen proteïnase 3 en myeloperoxidase. Deze laatste (PR3-ANCA en MPO-ANCA) zijn nauw geassocieerd met systemische vasculitis. tisch aankleuringspatroon laten zien op met ethanol gefixeerde granulocyten (c-anca). Deze c-anca bleken gericht te zijn tegen proteïnase 3, een serine protease uit de azurofiele korrels van myeloïde cellen. Sera van sommige patiënten met de ziekte van Wegener lieten bij IIF een perinucleaire aankleuring van de granulocyt zien (p-anca). P-ANCA bij patiënten met systemische vasculitis bleken in de meeste gevallen gericht te zijn tegen myeloperoxidase en in enkele gevallen tegen elastase, beide enzymen die eveneens afkomstig zijn uit de azurofiele korrels. Terwijl antiproteïnase 3 antistoffen vooral voorkomen bij patiënten met de ziekte van Wegener, komen myeloperoxidase antistoffen voor bij verschillende vormen van systemische vasculitis (Tabel 3, op pagina 81). Beide hebben echter een hoge specificiteit voor de primaire vasculitiden. P-ANCA met andere antigene specificiteit, zoals lactoferrine en andere nog slechts ten dele gekarakteriseerde bestanddelen van myeloïde cellen, blijken echter voor te komen bij andere idiopathische ontstekingsziekten, zoals reumatoïde arthritis, inflammatoire darmziekten en tevens bij sommige chronisch verlopende infecties. De diagnostische betekenis van p-anca als zodanig is dus beperkt. Dit betekent dat een positieve ANCAtest altijd gevolgd dient te worden door specifieke testen voor antiproteïnase 3 en antimyeloperoxidase. Met name bij patiënten met de ziekte van Wegener is gebleken dat stijging van het gehalte aan ANCA in het bloed vaak gevolgd wordt door een exacerbatie van de ziekte. Of stijging van ANCA-spiegels alléén voldoende reden is om behandeling in te stellen, is nog omstreden. Een dergelijke stijging dient de clinicus echter wel alert te maken op de mogelijkheid van een naderende exacerbatie. Conclusie Systeemziekten, zoals gesystematiseerde autoimmuunziekten en systemische vasculitiden, zullen vanwege de diversiteit aan klinische manifestaties vaak in een differentiaal diagnose opgenomen zijn. Bepaling van autoantistoffen is van grote betekenis bij de diagnostiek van deze ziekten. Kennis van deze bepalingen, zowel voor wat betreft hun technische uitvoering, als voor wat betreft hun klinische betekenis, is van belang om een positieve of negatieve uitslag op de juiste wijze te kunnen interpreteren. Referenties 1. Von Mühlen CA, Tan EM. Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Sem Arthritis Rheum 1995; 24: Bootsma H, Spronk P, Derksen R, de Boer G, Wolters-Dicke H, Hermans J, Limburg P, Gmelig-Meyling F, Kater L, Kallenberg C. Prevention of relapses in systemic lupus erythematosus. Lancet 1995;345: Bick RL, Arun B, Frenkel EP. Antiphospholipid-thrombosis syndromes. Haemostasis 1999;29: Amiral J. Diagnostic approach of phospholipid-dependent antibodies. Haemostasis 1999;29: Kallenberg CGM, Brouwer E, Weening JJ, Cohen Tervaert JW. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies: current diagnostic and pathophysiological potential. Kidney Int 1994;46: Savige J, Davis D, Falk RJ, Jennette JC, Wiik A. Antineutrophil cytoplasmic antibodies and associated diseases: a review of the clinical and laboratory features. Kidney Int 2000;57: Correspondentie-adres auteur: Prof. Dr. C.G.M. Kallenberg, internist-immunoloog Afdeling Klinische Immunologie Academisch Ziekenhuis Groningen Postbus RB Groningen 82 A P R I L - M E I N R. 2