Virale Diagnostiek: Van CPE tot PCR. Page 1. Virusdiagnostiek. Waarom diagnostiek van virusinfecties. G. Ieven 21/09/04. Waarom.

Transcriptie

1 Virale Diagnostiek: Van CPE tot PCR G. Ieven 21/09/04 Virusdiagnostiek Waarom Technieken Klinische toepassingen en strategiën Waarom diagnostiek van virusinfecties Verzamelen van epidemiologische gegevens - griep en vaccinatie - vaccinatiepolitiek - seizoensgebonden activiteit van - vb. Ifl, RSV, Rhino, Mycoplasma e.a. Wetenschappelijke argumenten: inzicht in pathogenese Ondersteuning van beleid ten aanzien van individuele patiënt Page 1

2 Virusdiagnostiek t.a.v. individuele patiënt Stoppen of niet starten van antibioticatherapie - vb. bij respiratoire infecties Toediening van specifieke antivirale therapie - vb. HIV, Herpes, Hepatitis virussen Vermindering van hospitalisatieduur - vb. virale meningitis Preventie van verspreiding van infectie Voorwaarde: snelle diagnostiek: h Virusdiagnostiek: van CPE tot PCR Van laattijdig tot snel Van aspecifiek tot virusspecifiek Van minder gevoelig tot zeer gevoelig Diagnostische methodes in de virologie Rechtstreekse diagnose: - aantonen van het virus zelf Onrechtstreekse diagnose: - aantonen van de immuunrespons, meestal via specifieke antistoffen Niet-virale parameters Page 2

3 Doel van virus diagnostiek Aantonen van een acute infectie - aantonen van virus hetzij rechtstreeks, hetzij onrechtstreeks Aantonen van chronische infectie - opsporen van antistoffen (vb. seropositiviteit van HIV) - rechtstreeks aantonen van virus (vb. surface antigeen van hepatitis B) Aantonen van reactivaties - meestal gesteund op rechtstreekse diagnose (vb. detectie van CMV bij immuungedeprimeerden) Aantonen van immuniteit - opsporen van antistoffen Onrechtstreekse virusdiagnose: aantonen van antistoffen Aantonen van seropositiviteit - immuniteit - persisterende infectie Seroconversie of titerstijging - acute infectie - reactivatie van chronische infectie Aanwezigheid van IgM antistoffen - acute of recente infectie Aantonen van verschillende antigenen kan bijkomende informatie geven vb. HBV, EBV Virusdiagnostiek door serologische testen Voordelen Vooral nuttig voor niet of moeilijk kweekbare virussen vb. hepatitis Specifieke IgG: goede indicatoren voor voorbije infectie Capture IgM testen: goede indicatoren voor recente infectie Laat een retrospectieve diagnose toe ook indien geen klinisch monster in acute fase Snel Voor vele parameters geautomatiseerd Page 3

4 Virusdiagnostiek door serologische testen Nadelen Retrospectieve diagnose indien door KBR of IgG titerstijging Kruisreactiviteit en interferentie (meestal IgM) vb. respiratoire virussen Ongevoelig voor de diagnose van sommige congenitale infecties (vb CMV) Niet aangewezen voor immuungecompromiteerde patiënten Na bloedtransfusies mogelijks valse resultaten Rechtstreekse virus diagnose Elektronenmicroscopie Virusisolatie door kweek - klassieke viruskweek met detectie van CPE - korte kweektechnieken met detectie van virale antigenen door monoclonale antilichamen Antigeen detectie: rechtstreekse detectie van virale antigenen in klinische monsters Genoomdetectie: detectie van viraal DNA/of RNA - probe technieken - nucleïnezuuramplificatie technieken Taxonomy Page 4

5 Virusdiagnostiek d.m.v. electronenmicroscopie Belangrijk bij eerste benadering: - ontdekking van hepatitis virus - ontdekking van Ebola virus - identificatie van SARS als coronavirus, Op basis hiervan worden andere technieken uitgebouwd ten behoeve van klinische diagnostiek - ontwikkeling van antigeen voor serologische tests - ontwikkeling van monoclonale AL voor IF/Elisa - sequenceren van NZ voor latere amplificatiereacties Electronenmicroscopie van Ebolavirus Elektronenmicroscopie Voordelen detecteert alle virussen detecteert niet kweekbare virussen lage werkingskosten Nadelen ervaring vereist lage gevoeligheid hoge investeringskost Page 5

6 Isolatie van virus uit patiëntenmateriaal proefdieren: coxsackievirussen in babymuizen bebroede kippeneieren: (1930 s): Influenza A in amnionholte celkweken (1950 s): - conventionele viruskweek met CPE - versnelde viruskweek met IF zonder CPE na centrifugatie van beënte cellen Conventionele viruskweek Virus isolatie - Gouden standaard - Gebaseerd op de min of meer specifieke inwerking van virussen op de cellen - Resultaat: de detectie van een CPE in de celculturen, syncytia of veelkernige reuscellen, inclusies, vacuolisatie Conventionele virusisolatie Page 6

7 CPE van Herpes simplex virus op Verocellen CPE voor Rhinovirus op MRC5 cellen CPE van mazelenvirus op Verocellen Page 7

8 Beperkingen van conventionele celkweek Niet alle virussen geven CPE: - Norwalk-, calici-, rota-, parvovirus: EM - paramyxovirussen: hemadsorptie - rubellavirus: interferentie Specificiteit: identificatie noodzakelijk - vb. entero of rhinovirussen ph gevoeligheid Soms laattijdige diagnose: van enkele dagen tot weken Afhankelijk van transport en bewaring patiëntenmateriaal Arbeidsintensief, ervaren personeel noodzakelijk Virus isolatie Voordelen gevoelig detecteert meerdere virussen virusisolaat voor verdere studie detecteert levend virus mogelijks snel resultaat in aangepaste versie Nadelen langzaam (conventionele celkweek) arbeidsintensief verschillende cellijnen noodzakelijk Invloed van Specimen Kritisch!!! - Beperkte replicatie capaciteit in celculturen - Stabliliteit Bron en methode van monstername Tijdstip van afname in verhouding tot het begin van de symptomen Transport naar het laboratorium: Page 8

9 Invloed van Specimen : andere factoren Andere factoren die de succesvolle detectie kunnen beïnvloeden: - De leeftijd van de patiënt: bv jonge kinderen scheiden langer influenza virussen uit dan volwassenen - De immuunstatus van de patiënt: bv persistente uitscheiding van RSV in HIV geïnfecteerde kinderen Invloed van Specimen: transport en bewaring Transport naar het laboratorium - Zo snel mogelijk Viabiliteit tijd - Mengen met transport medium, transporteren op 4 C Bewaren van de monsters: - Indien noodzakelijk bij 4 C (zo kort mogelijk) C (!vriesdooi effecten kunnen schade berokkenen infectiviteit en afbraak van genoom) Snelle methoden voor virusdiagnostiek Versnelde viruskweek met indirecte immunofluorescentie Aantonen van virus: Elektronenmicroscopie en immuno EM Aantonen van virusantigeen in direkt preparaat - indirecte immunofluorescentie vb. RSV - enzyme-immunoassay vb. RSV, HBV, rota, adeno - latex agglutinatie vb. rota, adeno Aantonen van virusnucleïnezuur - hybridizatie - gen-amplificatie: PKR, LKR,... Page 9

10 Virusdetectie met IF na centrifugatie Results of virus detection by CPE compared with IF on centrifuged shell vial cultures CPE IFSV Number % Viruses detected of positives HS, 5 ADE, 5 RSV, 1 VZV HS HS, 5 ADE, 4 RSV, 3 CMV, 3 PFL S.R. Pattyn et al. (1989) Results of virus detection by CPE compared with IF on centrifuged shell vials cultures Number of IFSV pos. CPE pos. Pos n % n % Pattyn et al. (1989) Schirm et al. (1992) Page 10

11 IF van CMV op geïnfecteerde cellen IF van Adenovirus op geïnfecteerde cellen IF van CMV en adeno virus op geïnfecteerde cellen Page 11

12 IF van HSV en VZV op geïnfecteerde cellen Voordelen en beperkingen van versnelde viruskweek Voordelen - diagnose na h - sensitiviteit - specificiteit door detektie met MoAb s Beperking - afhankelijk van transport en bewaring patiëntenmateriaal - specificiteit: men vindt wat men zoekt Snelle methoden voor virusdiagnostiek Versnelde viruskweek met indirecte immunofluorescentie Aantonen van virus: Elektronenmicroscopie Aantonen van virusantigeen in direkt preparaat - indirecte immunofluorescentie vb. RSV - enzyme-immunoassay vb. RSV, HBV, rota, adeno - latex agglutinatie vb. rota, adeno Aantonen van virusnucleïnezuur - hybridizatie - gen-amplificatie: PKR, LKR,... Page 12

13 Indirecte immunofluorescentie op monster: RSV Results of respiratory viral detection by immunofluorescence on clinical samples (IFCS and in cell cultures after centrifugation (IFCC) Number of positive samples Virus(n) IFCS + IFCS + IFCS - % Positives IFCC + IFCC - IFCC + IFCS IFCC INF (28) PFL (12) ADE (5) RSV (51) S.R. Pattyn et al. (1991) RSV (248) J. Schirm et al (1992) Antigeendetectie door immunofluorescentie Voordelen snel onafhankelijk van verschijnen van CPE gevoelig voor sommige virussen (vb. RSV) laat kwaliteitscontrole toe van monster Nadelen ervaring vereist wisselende gevoeligheid afhankelijk van kwaliteit van monster specificiteit men vindt wat men zoekt, soms aspecifieke reacties Page 13

14 Antigeen detectie door latex agglutinatie Antigeendetectie door immunochromatografische methodes Immunochromatografische en Latex testen voor snelle virusdetectie Voordelen snel en eenvoudig minder afhankelijk van monsterkwaliteit specifiek Nadelen minder gevoelig dan IF geen controle op kwaliteit van monster prijs Page 14

15 Antigeendetectie door enzyme immuno assays Voordeel: - gebruiksvriendelijk en snel, leent zich voor grotere reeksen - automatisatie, - verminderde kans op subjectieve beoordeling Nadeel: - lage concentraties infectieus virus in respiratoire monsters van volwassenen - geen kwaliteitscontrole van het monster - Invloed van het gebruikte materiaal Snelle methoden voor virusdiagnostiek Versnelde viruskweek met indirecte immunofluorescentie Aantonen van virus: Elektronenmicroscopie Aantonen van virusantigeen in direkt preparaat - indirecte immunofluorescentie vb. RSV - enzyme-immunoassay vb. RSV, HBV, rota, adeno - latex agglutinatie vb. rota, adeno Aantonen van virusnucleïnezuur - hybridizatie - gen-amplificatie: PKR, LKR,... Indicaties voor NAAT Niet isoleerbare virussen: geen geschikte cellijnen Andere technieken zijn minder efficiënt of te traag bv. CMV 6 weken Zeer lage concentraties aanwezig in monster Virus inactivatie gedurende transport of bewaring Contaminatie met andere pathogenen Leveren van bijkomende info - Opvolgen van therapie - Resistentie - Viral load Page 15

16 NAAT: Technieken en evolutie PCR: - Real Time PCR - Multiplex PCR NASBA - Real Time NASBA - Multiplex NASBA DNA chip LCR SDA,... NASBA Amplification: schematic diagram 5 3 Primer 1 Reverse Transcriptase RNase H Primer 2 Reverse Transcriptase Primer 2 3 T7 RNA polymerase 5 Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase RNase H Primer 1 Detectie photon 620 nm Magnetic Particle Ru ++ RNA amplicon Working Electrode = ECL probe = target-specific capture probe Page 16

17 Molecular beacon DNA probe Molecular beacons T A G A A A C G C A G C G C T C C A NASBA RNA G CGT T TCATAG TAGGGAGGTA CGC A A G T A T A C C T C G G C G F Q C C F Q Single stranded RNA molecules Isothermal amplification Fast binding kinetics Real Time PCR Lightcycler: - 1)SYBR Green: bindt op dsdna - 2)Hybridisatie probes - voordeel: - minder contaminatie: 1 tube - snelle reactie (kleine volumes in capillair) - uniforme protocols - automatiseerbaar - quantitatief Conventional PCR vs Real Time PCR Conventional PCR amplificatie en detectie afz. Eindpunt meting Real Time PCR 1 tube amplificatie en detectie continue meting en/of eindpunt meting Je meet telkens op vast niveau (# cycli in reactie) Smeltcurves (moment waarop beide strengen uiteen gaan)bv mutatie-onderzoek Page 17

18 Multiplex amplificatiereacties Multiplex formats: - Principe: detectie van virussen in 1 reactietube door het gebruik van verschillende primersets in deze tube - Nadeel: beïnvloeding van de amplificatiereactie door te werken onder suboptimale condities met als gevolg een lagere specificiteit en sensitiviteit PCR : Aanbevolen controles Negatieve controles extractie controle: - controle op contaminatie tijdens extractie - gesimuleerd klinische monster reagens controle: - controle op contaminatie van reagentia - gebruik van solvens met geëxtraheerd nucleïnezuur Positieve controles extractie controle: - positief klinisch monster inhibitie controle: - door inclusie van gewijzigd target PCR: Preventie van contaminaties SCHEIDING IN VERSCHILLENDE LOKALEN Bereiding van reagentia - clean room : geen nucleïnezuren Nucleïnezuur extractie Amplificatiereacties (in geval van nested reacties, 2 PCR ronde eventueel nog scheiden) Analyse van PCR producten Page 18

19 Molecularie amplificatietesten in een klinisch diagnostisch lab Diagnose van infectie Diagnose van ziekte Genotypering van virussen Voorspelling van ziekte/status van infectie Monitoring van antivirale therapie Confirmatie van virus transmissie Epidemiologie van infectie Virusdiagnostiek: Diagnostische strategiën Detectie van individuele infectieuze agentia: kwalitatief of kwantitatief: belangrijk in opvolging van behandelingen - hepatitis B, C - HIV - CMV Syndroom gerichte benadering: breed spectrum aanpak van gericht op alle of meeste virussen die voor syndroom verantwoordelijk kunnen zijn. - respiratoire infecties - meningitis/encephalitis - gastro-intestinale infecties Klinische syndromen en virale infecties Syndroom Meest waarschijnlijk virus Respiratoir verkoudheid Rhinovirus pharyngitis Coronavirus bronchiolitis Adenovirus pneumonie Parainfluenza 1-3 Influenza A RSV CMV (immunogecompromiteerden) Centraal zenuwstelsel Meningitis Echovirus Encephalitis Coxsackievirus A-B Herpes simplex CMV Gastrointestinaal diarrhee rotavirus adenovirus Norwalk Like Hepatitis Hepatitis A-B-C Page 19

20 Virusdiagnostiek: Diagnostische strategiën Geoptimaliseerde technieken, eventueel combinaties van technieken rekening houdend met - gevoeligheid / specificiteit - snelheid - kostprijs Gevoeligheid van verschillende moleculaire testen Limiet in gevoeligheid Serum HBV DNA copijen/ml Vloeibare hybridisatie bdna Kwantitatieve PCR tijd Actieve CMV in Transplant Patienten Major complication in transplant patients : incidence % after renal transplantation Symptoms are unspecific and similar as in graft rejection Different differential diagnosis and treatment implications Early detection in high risk patients is essential for early or preemptive therapy. Page 20

21 Pos cellen/ ) CMV in Transplant Patienten: Beschikbare Technieken pp65 antigenemie (Ag) hybrid capture CMV DNA test (CMV-HCS) PCR op witte bloedcellen (PCR-WBC) PCR op plasma (PCR-Pl) Kwantitatieve PCR op bloed fracties Evaluatie van verschillende CMV detectie methoden bij transplantpatiënten Evaluatie van de sensitiviteit, specificiteit, TAT - CMV hybrid capture systeem op leucocyten - pp65 antigenemie - PCR op leucocyten - PCR on plasma Ontwikkelen van een optimale strategie om snel en door gebruiksvriendelijke methode een actieve CMV infectie te detecteren. CMV Posttransplantatie: PCR op Leucocyten en op Plasma pos cells / pp 65 PCR WBC PCR pl posttransplantation Posttransplantatie (days) (dagen) Page 21

22 Chronologie van Test Resultaten voor CMV in Nier Transplant Patiënten 33 d Ag PCR-Pl 3 d 7 d 43 d PCR-WBC 7 d 12 d 51 d 4.1 weken post transplantatie Monitoring CMV na Transplantatie UZA : 34 patiënten wekelijks opgevolgd gedurende 3 maanden 422 monsters vergelijking van 3 technieken voor opvolging Sensitiviteit Gebruiksgemak Kwantitatieve resultaten PCR op leucocyten PCR op plasma pp-65 antigenemie Conclusies : opvolging door PCR, inidien positief pp-65 antigenemie Diagnose van ziekte CMV copies/ml Laag gevoelige test: prediktief voor ziekte Zeer gevoelige test: niet prediktief voor ziekte tijd Page 22

23 Voorgestelde Strategie voor opvolging van Orgaantransplantaties Vanaf transplantatie en gedurende de volgende 3 maanden: wekelijks PCR-WBC of PCR-Pl en bereiding van cellen voor de detectie van pp65 antigenemie tot fixatie stap. Indien PCR-Pl positief is pp65 IF op de bereide uitstrijkjes. Voortzetting van deze procedure zolang de PCR-Pl positief is. Virologische monitoring van transplant patiënten : pretransplantatie Donor serologie : HIV, HCV, HBsAg, HBc, CMV, EBV Recipient serologie: HIV, HCV, HBsAg, HBc, CMV, EBV, HSV, VZV Virologische monitoring van transplant patiënten: posttransplantatie Wekelijke surveillance gedurende 3 maanden: CMV viremie (PCR, antigenemie) Bij symptomen Monster Mogelijke oorzaken Technieken respiratoir keelveger CMV, HSV, influenza virusisolatie/pcr BAL RSV, parainfluenza IF/virusisolatie bloed adeno, CMV PCR Gastrointestinaal biopsie, faeces, CMV, HSV, virusisolatie/pcr bloed adeno, rota (zeldzaam) PCR en EM CNS CSV CMV, JC (zeldzaam) PCR bloed CMV PCR Urinewegen urine adeno, BK PCR, EM (hemoragische cystitis) Page 23

24 Influence of Prevalence on Predictive Values for given test : Se = 99%, Sp = 98% Prevalence PPV NPV 1 / 4.9 % % 1 / 4.7 % % 1 % 33.3 % % 2 % 50.0 % % 3 % 60.0 % % 4 % 67.0 % % 5 % 72.0 % % 10 % 84.0 % % 20 % 92.0 % % 30 % 95.0 % % Goldberg M, 1990; L epidémiologie sans peine Amplificationtests for the Detection of C. trachomatis Method Assay Company Hands-on Time (hours) Amplif. control PCR Amplicor Roche Optional Cobas Amplicor Optional LCR LCx Abbott No TMA Amp CT Gen-Probe 2.5 No SDA ProbeTec ET Becton-Dickinson Yes Sensitivity of Amplification Methods for the Detection of C. trachomatis on First Void Urine Author Test Sens.(%) Spec. (%) Reference Chernesky LCR J. Clin. Microbiol. 1994; 32: 2682 Quinn PCR 93.3 J. Clin. Microbiol. 1996; 34: 1401 Pasternack PCR J. Clin. Microbiol. 1997; 35: 402 LCR Morre PCR J. Clin. Microbiol. 1999; 37: 3092 LCR Van Dyck PCR J. Clin. Microbiol. 2001; 39: 1751 LCR SDA Page 24

25 Prevalence of C. trachomatis Infection in General Practice in Antwerp Study population: 777 sexually active women, age 15-40, visiting their GP Methods: opportunistic screening by DNA on self-taken vaginal sample Age /50 (2%) /227 (6.6%) /260 (5.8%) / 220 (3.6%) /30 (0%) Overall prevalence: 4.96% Verhoeven V. et al, J. Med. Screening 2003; 10: Possible Recommendations for Screening for Chlamydia trachomatis in a Sample of Women in General Practice All women > 1 partner in the past year AND All women with two of the following: - age years - frequent postcoital bleeding - having symptomatic partners - no use of contraceptives would detect 92.3% of infections and 37.5% of the population would need to be screened Verhoeven V. et al, J. Med. Screening 2003; 10: Recommendations and Reports on Screening Tests to Detect C. trachomatis Infections. Potential adverse consequences caused by false positives: patients should be counceled regarding this potential: routine additional testing to improve predictive value of a positive screening test should be considered if low prevalence. Selecting persons for testing who are at high risk can increase the prevalence of infection among the tested persons, thereby reducing screening costs. CDC, MMWR 2002; 51: 1-27 Page 25

26 Strategy for Detection of C. trachomatis: Medico-legal Aspects Need for highest specificity: What may be appropriate for screening a sexually active adult may not be appropriate for testing a child for suspected sexual abuse Medico-legal implications Confirmatory testing is crucial if the probability of the infection is low Need for communication between clinician-lab Virusdiagnostiek : CONCLUSIES Voorbijgestreefde Mythes 1) Isolatie van een virus is enkel van academisch belang 2) Het epidemiologisch belang van virusdiagnostiek situeert zich enkel buiten het ziekenhuis 3) Virale diagnostiek is te traag om klinisch relevant te zijn 4) Virale diagnostiek is uitermate duur 5) Virusdetectie is overbodig wegens beschikbaarheid van serologische tests. Virusdiagnostiek: CONCLUSIES The time of retrospective viral diagnosis has gone to be replaced by rapid techniques which impact directly on patient management. More competition for healthcare resources means that new techniques are introduced at the expense of more traditional methods with limited clinical use Jeffery K, 2004 Page 26

27 Virusdiagnostiek: CONCLUSIES Clinical virologists are having to work more closely with their clinical collegues to establish new diagnostic criteria, develop protocols for use of antiviral drug, and for monitoring of these patients with persistent infections. The diversity of diagnostic methods now available make communication between physicians and clinical virologists more important than ever before Jeffery K, 2004 Page 27