CONSTRUCTING PROTECTION AND IMMUNE RESPONSES AGAINST MALARIA

Transcriptie

1 CONSTRUCTING PROTECTION AND IMMUNE RESPONSES AGAINST MALARIA

2 Summary Summary Malaria is an important infectious disease with more than 3 billion people at risk, resulting in more than 200 million clinical cases and almost 600,000 deaths annually. The disease is caused by Plasmodium parasites and transmitted by bites from Anopheline mosquitoes. Implementation of effective interventions such as insecticide-treated bed nets, indoor insecticide spraying and targeted diagnosis and treatment with artemisinin-based combination therapy has led to a significant decrease in the burden of malaria in the past decades. However, these interventions are threatened by emerging drug resistance of parasites and resistance of mosquitoes to insecticides. Therefore, novel strategies are needed to effectively control malaria. A potent vaccine would be a crucial component of such a strategy, and understanding protective immune responses will be of great help to design and develop such a vaccine. In this thesis we use models in healthy volunteers to investigate protective immunity against P. falciparum malaria. In Controlled Human Malaria Infections (CHMIs), healthy subjects are infected with malaria, either through bites from mosquitoes infected with P. falciparum sporozoites, or by venous inoculation of blood-stage forms of the parasite. In the chemoprophylaxis and sporozoites (CPS) immunization model, volunteers are exposed to live sporozoites while receiving chloroquine prophylaxis. The CPS immunization regime has previously been shown to induce very high levels of protection against challenge infection in a controlled setting. We use these models to advance our understanding of anti-malarial immunity induced by whole sporozoite immunization and thereby aim to augment clinical development. The thesis starts with an interdisciplinary study, using the heuristics from Science Technology and Society studies (STS), to investigate the social construction of scientific knowledge in CHMI trials (chapter 2). Specifically, we argue that tandems of trust and control play a central role in the successful execution of CHMI trials and scientific experiments in general. We especially elaborate on the distinction between trust in and control of persons, machines, and institutions and argue that links between these different domains are crucial for the safe and effective execution of clinical trials. We also argue that trust and control are not just alternatives, which substitute for each other when one does not suffice, but that they actually work in conjunction and coproduce each other, to make scientific research work. In the review in chapter 3 we raise the hypothesis that chloroquine might be important for the efficient induction of immunity by CPS immunization through its known immune modulating capacities. In chapter 4 we use the rodent malaria parasite P. berghei to investigate this hypothesis, but do not find supportive evidence in this model. In chapter 5, we explore the option of translating chemoprophylaxis and parasite exposure into a field intervention with the aim of inducing protective immune responses. We propose that this could be evaluated in an area with a short but intensive transmission season, allowing for high exposure to pre-erythrocytic antigens while blood-stage infections are controlled by the

3 Summary drug, and the possibility to evaluate induced protection in the next season. Next, we use the CPS model to address two important questions in malaria immunity. We first investigate, in chapter 6, towards which stages of the parasite lifecycle the protective immune responses are directed. The clinical trial described in this chapter shows that CPSimmunized subjects are not protected against a challenge with blood-stage parasites. Thus, CPS-induced protection is, at least primarily, mediated by immune responses against the pre-erythrocytic (sporozoite and liver) stages. We do, however, find evidence that immune recognition of blood-stages does occur after CPS immunization, although apparently not sufficient to protect against these parasite densities. The second question is which immune responses are induced and whether these are associated with protection. Both cellular responses and antibodies appear to play a role in protection induced by live sporozoite based immunization; in this thesis we focused on cellular immune responses. In chapter 7 we perform a dose de-escalation CPS trial, generating a differentially protected cohort: protection is dose-dependently induced, with almost 100% protection when immunized with bites from three times 15 mosquitoes, reducing to 50% protection when immunized with bites from three times five mosquitoes. This study design allows us to investigate immune correlates of protection. In vitro restimulation experiments reveal two cell types that are associated with protection: CD4 T cells expressing the degranulation marker CD107a and CD8 T cells producing granzyme B. In chapter 8 we conduct an alternative analysis of CPS-induced immune responses by ex vivo lymphocyte phenotyping during immunization. These experiments indicate a role for Th1 responses and cytotoxic T cells in CPS-induced immunity, which is in line with the results from chapter 7. All CPS studies up until now have been performed with the same (homologous) NF54 strain for both immunization and challenge. It is, however, of critical importance to show protection against heterologous strains, given the huge diversity of strains in the field. Chapter 9 describes a clinical trial in which NF54 CPS-immunized and challenged subjects were re-challenged with a different strain (NF135.C10). Although less efficient, NF54- induced CPS immunity also protects against NF135.C10 when tested after a period of more than a year. In chapter 10 we show that CPS immunization in humans does not specifically depend on the choice of chloroquine for prophylaxis, as CPS with mefloquine is equally safe and protective. In addition, induced cellular and humoral immune responses do not differ significantly between both drug groups. For clinical development of whole sporozoite based vaccines, it is obviously necessary to replace sporozoite inoculation through mosquito bites by needle and syringe. We show in chapter 11 that CHMI can be performed by intradermal injection of aseptic, purified, vialed and cryopreserved P. falciparum sporozoites. These results will facilitate application of CHMI and accelerate malaria vaccine development, including whole sporozoite approaches. Finally, in chapter 12, we use the CHMI model for an alternative application by

4 Summary exploring a novel framework derived from population biology. Our objective is to investigate tolerance against malaria by using so called disease maps to describe the relationship between the level of parasitemia and severity of disease. Visualization of the course of infection in disease space enables us to distinguish different levels of tolerance against P. falciparum malaria. The presented data illustrate the potential of this framework for rational monitoring and treatment of malaria on an individual basis. In conclusion, this thesis sheds light on several aspects of protective immunity induced by whole sporozoite immunization: i) pre-erythrocytic stages as the target of immunity, ii) the dose-response relationship between immunization dose and protection, iii) the generation of heterologous protection, iv) the induction of cellular immune responses, v) the option to use different drugs for CPS and vi) the possibility to use cryopreserved sporozoites instead of bites by infected mosquitoes. We hereby aim to set an agenda for future work on the clinical development of whole sporozoite vaccines. This will be supported by the reproducibility and efficiency of CPS immunization and will include identification of novel target antigens and delineation of mechanisms of sterile pre-erythrocytic immunity. Rather than single immunological markers or parasitic antigens, we expect the focus of such studies to be on identifying immune signatures of protection. Altogether, CHMI and CPS immunization have proven to be highly valuable models in malaria vaccine research, and will likely continue to do so in future.

5 Samenvatting Samenvatting Malaria is een belangrijke infectieziekte waaraan meer dan 3 miljard mensen worden blootgesteld, met meer dan 200 miljoen ziektegevallen en bijna doden per jaar. De ziekte wordt veroorzaakt door Plasmodium parasieten die worden overgebracht door vrouwelijke Anopheles muggen. Implementatie van effectieve maatregelen zoals geïmpregneerde klamboes, het binnenshuis spuiten van insecticiden en gerichte diagnostiek en behandeling met artemisinine-combinatie therapie, heeft geleid tot een afname in het aantal malariagevallen in de afgelopen jaren. Deze interventies worden echter bedreigd door de opkomst van resistentie van parasieten en muggen. Nieuwe strategieën zijn dus nodig om malaria te bestrijden, en een effectief vaccin zou een belangrijk onderdeel zijn van een dergelijke strategie. Goed begrip van de beschermende afweerreacties is cruciaal om een vaccin te ontwerpen en ontwikkelen. In dit proefschrift gebruiken wij modellen met gezonde vrijwilligers om beschermende immuniteit tegen P. falciparum malaria te onderzoeken. In gecontroleerde humane malaria infecties (CHMIs) worden gezonde vrijwilligers geïnfecteerd met malaria door hen bloot te stellen aan beten van geïnfecteerde muggen, of door intraveneuze toediening van bloedstadium parasieten. In het chemoprofylaxe en sporozoïten (CPS) immunisatie model worden vrijwilligers blootgesteld aan sporozoïten terwijl ze chloroquine profylaxe nemen. CPS immunisatie is zeer effectief gebleken in het opwekken van bescherming tegen een malaria infectie onder gecontroleerde omstandigheden. Wij gebruiken deze modellen om ons begrip van immuniteit tegen malaria te vergroten en op deze manier klinische ontwikkeling van sporozoïten-vaccins te bevorderen. Dit proefschrift begint met een interdisciplinaire studie waarin we gebruik maken van de methodologie en het gedachtegoed van Wetenschap en Technologie studies om de sociale constructie van wetenschappelijke kennis in CHMI studies te onderzoeken (hoofdstuk 2). We betogen dat tandems van vertrouwen en controle een cruciale rol spelen in de succesvolle uitvoering van CHMI studies en wetenschappelijke experimenten in het algemeen. We maken onderscheid tussen vertrouwen in en controle van personen, machines en instellingen en betogen dat verbindingen tussen deze verschillende domeinen cruciaal zijn voor de veilige en effectieve uitvoering van klinische studies. We betogen ook dat vertrouwen en controle niet simpele alternatieven zijn die elkaar vervangen als een van beide niet voldoet, maar dat ze samen werken en elkaar coproduceren, om wetenschappelijk werk succesvol te laten zijn. In de literatuurbespreking in hoofdstuk 3 opperen we de hypothese dat chloroquine op basis van haar immuun-modulerende eigenschappen belangrijk is voor de efficiënte wijze waarop immuniteit door CPS immunisatie wordt opgewekt. In hoofdstuk 4 gebruiken we de muizen-malariaparasiet P. berghei om deze hypothese te onderzoeken, maar vinden geen bewijs hiervoor in dit model. In hoofdstuk 5 verkennen we de mogelijkheid om CPS te vertalen naar een interventie voor endemische gebieden, met als doel het opwekken van een

6 Samenvatting beschermende immuunreactie. We stellen voor om dit te onderzoeken in een gebied waar sprake is van een kort maar intensief transmissie-seizoen. Op deze manier vindt blootstelling aan een relatieve hoge dosis pre-erytrocytaire antigenen plaats, terwijl bloedstadium infecties worden gecontroleerd met hulp van de medicatie, en is er de mogelijkheid om in een opeenvolgend seizoen de opgewekte bescherming te evalueren. Vervolgens gebruiken we het CPS model om twee belangrijke vragen te beantwoorden over malaria immuniteit. Ten eerste onderzoeken we, in hoofdstuk 6, tegen welke stadia van de parasiet-levenscyclus de beschermende immuunrespons is gericht. De klinische studie in dit hoofdstuk laat zien dat CPS-geïmmuniseerde personen niet beschermd zijn tegen een infectie met bloedstadium parasieten. Bescherming door CPS is dus primair gebaseerd op een afweerreactie tegen pre-erytrocytaire stadia (sporozoïten en leverstadia). We vinden wel aanwijzingen voor herkenning van bloedstadium parasieten door het immuunsysteem, maar dit is dus niet voldoende om een beschermend effect te bewerkstelligen bij de lage parasietenconcentraties waarvan in het CHMI model sprake is. De tweede vraag is welke immuunresponsen worden opgewekt, en of deze geassocieerd zijn met bescherming. Zowel cellulaire immuniteit als antistoffen lijken een rol te spelen in bescherming; in dit proefschrift concentreren we ons op de cellulaire responsen. In hoofdstuk 7 beschrijven we een dosis de-escalatie CPS studie, waarin een gedifferentieerd cohort is gecreëerd, met bijna 100% bescherming na immunisatie met beten van driemaal 15 muggen, afnemend tot 50% bescherming na immunisatie met beten van driemaal vijf muggen. Deze studie stelt ons in de gelegenheid om op zoek te gaan naar cellulaire immuunresponsen die geassocieerd zijn met bescherming. Uit in vitro restimulatie experimenten komen twee celtypes naar voren die geassocieerd blijken te zijn met bescherming: CD4 T cellen die CD107a tot expressie brengen (een teken van degranulatie) en CD8 T cellen die granzyme B produceren. In hoofdstuk 8 hebben we een alternatieve analyse van immuunresponsen uitgevoerd door middel van ex vivo fenotypering van lymfocyten tijdens CPS immunisatie. Deze experimenten wijzen op een rol voor Th1 responsen en cytotoxische T cellen, in lijn met de resultaten van hoofdstuk 7. Tot op heden zijn alle CPS studies uitgevoerd met dezelfde (homologe) NF54 stam voor zowel immunisatie als challenge infectie. Het is echter van cruciaal belang dat ook bescherming tegen een heterologe stam wordt aangetoond, gezien de enorme variatie tussen stammen in endemische gebieden. Hoofdstuk 9 beschrijft een klinische studie waarin vrijwilligers die CPS immunisatie en een challenge infectie met NF54 hebben ondergaan, worden blootgesteld aan een challenge met de heterologe stam NF135.C10. Uit deze studie blijkt dat CPS immunisatie ook bescherming opwekt tegen een heterologe stam, alhoewel minder effectief dan homoloog. In hoofdstuk 10 tonen we aan dat de werking van CPS immunisatie in mensen niet afhankelijk is van de keuze voor chloroquine als profylaxe: CPS immunisatie met mefloquine blijkt even veilig en effectief te zijn. Bovendien zijn ook

7 Samenvatting cellulaire en humorale immuunresponsen niet verschillend tussen beide groepen. Voor de klinische ontwikkeling van sporozoïten-vaccins is het natuurlijk noodzakelijk dat het toedienen van sporozoïten door middel van muggenbeten wordt vervangen door een injectie met spuit en naald. We laten in hoofdstuk 11 zien dat dit mogelijk is: we voeren CHMIs uit door intradermale injectie van aseptische, gezuiverde en bevroren P. falciparum sporozoïten. Deze resultaten zullen wereldwijde toepassing van CHMI faciliteren en de ontwikkeling van malaria vaccins, inclusief sporozoïten-vaccins, versnellen. Tot slot gebruiken we in hoofdstuk 12 het CHMI model voor een alternatieve toepassing door een nieuw raamwerk, afgeleid van de populatie biologie, te onderzoeken. Ons doel is om tolerantie tegen malaria te onderzoeken door de relatie tussen de hoogte van de parasitemie en de ernst van de ziekte te beschrijven in zogenaamde disease maps. Visualisatie van het beloop van de infectie in disease space maakt het mogelijk om verschillende niveaus van tolerantie tegen P. falciparum te onderscheiden. Deze data illustreren het potentieel van dit raamwerk voor rationele monitoring en behandeling van malaria op een individuele basis. Concluderend werpt dit proefschrift licht op een aantal aspecten van immuniteit tegen malaria, opgewekt door immunisatie met sporozoïten: i) de pre-erytrocytaire stadia als aangrijpingspunt voor immuunresponsen, ii) de dosis-respons relatie tussen immunisatie dosis en bescherming, iii) het opwekken van heterologe bescherming, iv) de opgewekte cellulaire responsen, v) de mogelijkheid om andere medicatie voor CPS te gebruiken en vi) de mogelijkheid om bevroren parasieten te gebruiken in plaats van beten van geïnfecteerde muggen. Hiermee hopen wij bij te dragen aan het ontwikkelingsproces van sporozoïtenvaccins, waarin CPS immunisatie gezien de reproduceerbaarheid en efficiëntie een belangrijke rol zal kunnen spelen. Toekomstige studies zullen onder andere gericht zijn op het identificeren van nieuwe antigenen en het uitpluizen van de immunologische mechanismen van pre-erytrocytaire bescherming. In plaats van een enkele marker, zullen deze studies zich waarschijnlijk richten op het identificeren van een immunologische handtekening voor bescherming. CHMI en CPS immunisatie hebben bewezen zeer waardevolle modellen te zijn voor malaria vaccin onderzoek, en zullen deze rol hoogstwaarschijnlijk ook in de toekomst blijven vervullen.