Selectie van genen voor het meten van effecten van polluenten op genexpressie

Transcriptie

1 Rapport Selectie van genen voor het meten van effecten van polluenten op genexpressie door Sam De Coster, Prof. dr. Nik van Larebeke december

2 Selectie van genen voor het meten van effecten van polluenten op genexpressie Voor de selectie van genen met betrekking tot het meten van effecten van polluenten op de genexpressie bij de mens, werd zowel een theoretische als een praktische methode gehanteerd. Het theoretische deel bestond uit 1/ databankopzoekingen van relaties tussen genexpressie en geselecteerde polluenten en 2/ selectie van sleutelgenen van de carcinogenese en van genen geassocieerd met blootstellingen en/of biologische effecten op basis van enkele geselecteerde review-publicaties en PubMed-gene. Tijdens het verloop van het tweede (praktische) deel, werd echter besloten deze theoretische selectie niet verder te gebruiken in de eigenlijke selectie van 20 genen, omwille van het te sterk onvolledige en evoluerende karakter van de data achter deze genselectie. Het praktische deel bestond uit genexpressieanalyses (volledige genoom) van 40 volwassenen (50-65 jaar), waarvan de blootstellingsmerkers van verschillende polluenten (cadmium, lood, PCBs, dioxines, DDT, hexachlorobenzeen, PAKs en benzeen) gekend waren. Deze personen werden uit een grotere dataset geselecteerd op basis van de grootste resp. laagste cumulatieve blootstelling (som van z- waarden van individuele polluenten), hetgeen resulteerde in 20 hoog blootgestelde en 20 laag blootgestelde individuen. In eerste instantie werden genexpressieverschillen tussen beide blootstellingsgroepen geanalyseerd, in combinatie met correlaties tussen indivuele blootstellingsmerkers en de expressie van afzonderlijke genen. Door de relatief lage aantallen significante genen die daaruit voortvloeiden, werd ook overgegegaan tot afzonderlijke analyses voor mannen en vrouwen. Hieruit bleken bijzonder grote verschillen tussen beide geslachten, waardoor besloten werd om afzonderlijk genen te selecteren voor beide geslachten. Als eerste selectiecriterium werd een maximale p-waarde van 0,01 voor de lineaire regressieanalyse tussen de expressie van een gen en de een bepaalde blootstellingsmerker gesteld, als tweede de aanwezigheid van een gen in een pathway met significantieniveau lager dan 0,05 bij Metacorepathwayanalyse, en als derde en laatste criterium een verwacht genexpressieverschil van 62% (mannen) en 51% (vrouwen) tussen intensiteiten van blootstelling resp. overeenstemmend met de p10 en de p90 (a.h.v. de regressievergelijkingen).deze selectieprocedure resulteerde in een selectie van de beoogde 20 genen voor elk geslacht (na inclusie van de genen die geselecteerd waren op basis van onderzoek uit het eerste Steunpunt Milieu en Gezondheid). 2

3 Overzicht: 1. Inventarisatie genen geassocieerd met blootstelling aan polluenten en/of met biologisch effect (literatuurstudie) 1.1. Databankanalyse: genen geassocieerd met blootstelling aan geselecteerde stoffen 1.2. Selectie van sleutengenen in de carcinogenese en andere aandoeningen op basis van enkele review-publicaties en PubMed-gene 1.3. Gebruik van deze gegevens 2. Genexpressie van 40 volwassenen i.f.v. interne blootstelling aan diverse polluenten. Studie in het kader van de selectie van genen voor genexpressieanalyse in het tweede Steunpunt Milieu en Gezondheid 2.1. Doelstellingen 2.2. Methodes 2.3. Resultaten Populatiekenmerken Data-analyse over alle stalen (beide geslachten) Data-analyse gescheiden voor beide geslachten (eerste selectiecriterium: p-waarde correlatie <0.01) Pathway-analyses (tweede selectiecriterium: gen in MetaCore pathway met p-waarde <0.05) Verwachte genexpressieverschil tussen intensiteiten van blootstelling respectievelijk overeenstemmend met de p10 en de p90 a.h.v. regressievergelijkingen (derde selectiecriterium: verwachte verandering van >62% resp. 51% - mannen resp. vrouwen): uiteindelijke selectie 3

4 1. Inventarisatie genen geassocieerd met blootstelling aan polluenten en/of met biologisch effect (literatuurstudie) Als theoretisch deel van de selectieprocedure, werd een tweeledig literatuur- en databankonderzoek gedaan. Een eerste deel omvatte de inventarisatie van genen uit online databanken en de wetenschappelijke literatuur inzake blootstelling-genexpressie relaties, terwijl een tweede deel bestond uit de selectie van sleutelgenen in de carcinogenese op basis van de wetenschapelijke literatuur Databankanalyse: genen geassocieerd met blootstelling aan geselecteerde stoffen De stoffen in kwestie werden geselecteerd op basis van (mogelijke) metingen van stoffen of hun metabolieten in het kader van het eerste en/of het tweede Steunpunt Milieu en Gezondheid. Een overzicht hiervan wordt gegeven in tabel 1.1. Als basis voor het inventariseren van blootstelling-genexpressie relaties, werd gebruik gemaakt van de Comparative Toxicogenomics Database (CTD). Dit is een databank die relaties tussen chemische stoffen, genen en aandoeningen inventariseert. De informatie in deze databank heeft betrekking tot zowel de mens als andere soorten, en is afkomstig van een subset van MEDLINE/Pubmed, een databank van de U.S. National Library of Medicine. Deze relaties kunnen zowel direct als indirect zijn (via een tussenliggende stof of aandoening). Voor deze studie werden echter enkel directe relaties beschouwd, en bovendien beperkt tot genexpressie (terwijl ook informatie over eiwitbinding, fosforylering, secretie, etc beschikbaar is). Tabel 1.2 geeft systematisch de kenmerken weer van blootstelling-genexpressie relaties, geassocieerd met een bepaalde (groep) stof(fen): het aantal blootstellinggenexpressierelaties (totaal aantal en uniek aantal relaties), afzonderlijk voor UP en DOWNregulatie van de genexpressie. Tabel 1.3. geeft de over-all top 50 van genen die in verband gebracht worden met de vernoemde blootstellingen. Tabel 1.1. Overzicht van de stoffen waarvoor een opzoeking gedaan is in de CTD. Pollutant Metals Cadmium Arsene Mercury Lead Aromatic compounds Polyaromatic Hydrocarbons (PAHs) [Naphthalene, Acenaphthylene, Acenaphtene, Fluorene, Phenantrene, Anthracene, Fluoranthane, Pyrene, Benz(a)anthracene, Chrysene, Benzo(b)fluoranthane, Benzo(k)fluoranthane, Benzo(a)pyrene, Dibenzo(a,h)anthracene, Benzo(g,h,i)perylene, Indeno(1,2,3- c,d)pyrene] Benzene 4

5 PCBs TCDD (tetrachlorodibenzodioxin) Brominated and fluorinated compounds Polybrominated diphenylethers Hexabromocyclododecane Tetrabromobisphenol A Perfluoro-compounds [e.g. perfluoro-octaansulfonaat (PFOS), perfluorooctaanzuur (PFOA), perfluoro-octaansulfonamide (PFOSA), perfluoro-nanoaat (PFNA)] Pesticides and their metabolites Hexachlorobenzene DDT, p,p'-dde Organophosphate pesticides [chlorpyrifos, malathion, dimethoate] Pyrethrine pesticides [e.g. permethrine, cyfluthrin, cypermethrine, phenothrin, deltamethrin, cyhalomethrin, biphentrin] Carbamatepesticides [thiram, mancozeb, maneb] Other pesticides [para-dichlorobenzene, 2,4-dichlorophenoxy-acetic acid, chloorthalonil, chloorpropham, diuron, linuron, propanil, Iprodion, vinclozolin, procymidone, chlozolinate] Plastics compounds Bisphenol A Phthalates Cosmetics compounds Musks nitromusks Musks- polycyclische musks Parabens UV screens [o.a. benzophenone-3, 2,4-dihydroxybenzophenone, 2,2 - dihydroxy-4-methoxybenzophenone (DHMB), methylbenzylidenecamphor (MBC), octyl methoxycinnamate (OMZ)] Others Nicotine 5

6 Tabel 1.2. Relaties tussen genexpressie en blootstelling aan diverse (groepen) stoffen uit de Comparative Toxicogenomics Database. UPREG: genexpressie opgereguleerd door polluent, DOWNREG: genexpressie neergereguleerd. : som van alle referenties (per gen) die modulatie van genexpressie beschrijven (publicaties die modulatie van meerdere genen beschrijven tellen meermaals mee). : totaal aantal genen waarvan modulatie van genexpressie door polluent beschreven is (UP/DOWN). Top 12 van genen die het meest gelinkt worden aan de blootstelling in kwestie (gegevens mei 2008). Vb: cadmium wordt gelinkt aan 112 unieke genen, terwijl een totaal van 256 keer een blootstelling-genexpressie verband beschreven is. Zo zijn voor MT2A en HMOX1 14 resp 12 keer publicaties beschikbaar waarin opregulatie van de genexpressie door cadmium beschreven wordt. Cadmium Arsene Mercury Lead UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG b MT2A 14 CYP1A 4 HMOX1 31 GJA1 6 ABCC1 6 EGFR 2 GSTM1 2 POU4F1 2 HMOX1 12 GPX1 3 NQO1 12 TERT 6 MT2 5 FN1 2 GSTP1 2 BAD 1 MT1A 8 ACOX1 2 ABCC2 10 CCL2 5 ABCC2 4 PDGFRA 2 POU2F2 2 BNIP3 1 HSP70 7 ACTA1 2 GADD45A 10 CYP1B1 4 HMOX1 4 SERPINC1 2 ALDH2 1 CASP3 1 COX1 6 ADH6 2 AFP 9 FLG 4 HSP70 3 A2M 1 ATF4 1 CASP6 1 FOS 5 AKR1B1 2 JUN 9 ID2 4 HSPA1A 3 ACP2 1 BIRC3 1 CASP9 1 HSPA1A 4 ALB 2 TXNRD1 9 IGFBP2 4 MT3 3 ACSL1 1 DDIT3 1 COL4A1 1 MT1 4 ALDH6A1 2 CCND1 8 IVL 4 ATF4 2 AGXT 1 DNAJA1 1 CYP7A1 1 MT2 4 AR 2 GSTP1 8 MMP2 4 CRP 2 AKR1B1 1 DNAJB1 1 DAP 1 SPP1 4 ATP2B1 2 HSPA1A 8 MYC 4 CYP1A1 2 AKT2 1 FOS 1 FADD 1 TXNRD1 4 CD36 2 MT2A 8 TNF 4 DUSP1 2 ALDH6A1 1 FTH1 1 FOS 1 HSP22 3 CEBPA 2 VEGFA 8 ARHGDIB 3 GADD45G 2 ANXA6 1 GADD45A 1 GSTA1 1 PAHs Benzene PCBs Dioxins UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG CYP1A1 16 HBB 3 ACF 1 ATP5I 1 CYP1A1 34 CYP11A1 3 CYP1A1 42 BAX 2 CYP1B1 12 ADAM12 1 APOB 1 CD74 1 CYP11B2 11 ATF3 2 CYP1B1 17 BCL2L1 2 NQO1 8 ADAMTS16 1 DAO1 1 EGFR 1 CYP1A2 10 BCL2 2 CYP1A4 11 CAR3 2 ABCB1 4 AHR 1 EIF4G2 1 EPB4.1L1 1 CYP11B1 9 BTG1 2 CYP1A2 9 CDKN1A 2 ALPHA ESR1 3 ELOVL5 1 FASN 1 CYP1A 8 CDKN1A CYP1A5 8 CYP3A13 GLOBIN

7 UGT1A6 3 CDC2 1 HHEX 1 G6PC 1 CYP1A5 8 CYP2E1 2 CYP1A 7 DAO1 2 CYP1A2 2 COL8A1 1 HNF4A 1 HNRPUL1 1 NR1I3 6 ESR2 2 NQO1 7 FADS1 2 ABCG2 2 CUGBP2 1 IL12B 1 IDB4 1 CYP19A1 5 HSD17B1 2 AHRR 6 FASN 2 CYP-35A5 2 DHRS3 1 NR1D2 1 NDUFA5 1 CYP1A4 5 HSD17B3 2 AHR 5 GLUD1 2 CYP-35C1 2 DNMT3L 1 POLDIP2 1 PLA2G6 1 CYP1B1 5 IL2 2 ALDH3A1 5 GLUL 2 CYP1A 2 EGR1 1 PPP2R1A 1 RAP1GAP 1 CYP21A2 5 NEDD9 2 UGT1A6 4 GPT1 2 GSTA1 2 FIGF 1 RGS3 1 RPL35 1 HSD3B2 4 STAR 2 CLDN3 3 HAL 2 Hexachlorobenzene DDT, p,p'-dde organofosfaat pesticides pyrethrine pesticides carbamaat pesticides other pesticides UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG ALAS2 1 ART2B 1 NR1I3 5 NOS2 4 HSP70 2 FOS 1 TFF1 6 CHRM1 3 HSP22 2 BCL2 1 CYP1B1 2 ELA2 1 ALOX15 1 CD37 1 PGR 4 IL1B 3 FOS 1 SLC6A4 1 WNT10B 4 ALB 2 SLC5A5 1 FLT1 1 CYP11A1 2 ESR1 1 ANXA1 1 CD3D 1 CYP3A 3 TNF 3 HSP90AA1 1 IGF1 1 CYP2B1 4 APOE 2 TSHB 1 KDR 1 ABCB4 2 ESR2 1 C1QB 1 CD3Z 1 CYP3A4 3 AR 2 HTR1A 1 TGFB1 1 CYB5 3 TH 2 MMP13 1 VEGFA 2 ZIC5 1 C1S 1 CD74 1 ABCB1 2 CLU 2 HTR2A 1 ACP36DE 1 NR1I3 2 CYP11A1 2 CLU 2 CCDC120 1 C4BPA 1 CYP2E1 1 CYP12D1-P 2 HSD17B1 2 SLC6A4 1 ACP70A 1 APOA1 1 HSD17B1 1 CYP17A1 1 CLK1 1 CAPG 1 EPHX2 1 CYP19A1B 2 IL1R1 2 TP53 1 HBA 1 APOB 1 STAR 1 CYP19A1 1 IL1RL1 1 CAT 1 FCER2A 1 IL6 2 IL2 2 IGF1 1 HBB 1 CYP11A1 1 BDNF 1 CYP3A1 1 PTGER3 1 CCBP2 1 FRAP1 1 LTF 2 PGR 2 IL1B 1 CHRM2 1 STAR 1 FOS 1 FSHB 1 VEGFA 1 CCL20 1 GSTM1 1 NOS2 2 TNFRSF1A 2 MX1 1 STAR 1 CYP3A1 1 LHB 1 ACCN3 1 CCND1 1 HLA-DMA 1 TNF 2 ABCB1 2 TGFB1 1 CHRM3 1 S100G 1 PGR 1 ATP2A2 1 CD14 1 HLA-DMB 1 C3 1 ADM 2 HSC70 1 DCLRE1C 1 BCKDK 1 perfluoro-compounds tetrabromobisphenol A polygebromeerde diphenylethers Hexabromocyclododecaan UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG ACOT1 3 APOA4 2 ALDH18A1 1 BACTIN2 1 THIBZ-A 1 CYP2B1 1 ACOT2 3 CYP7A1 2 CYP21A2 1 BHMT 1 THRB 1 CYP3A1 1 CYP3A23/3 ALDH1A1 HSD11B1 3 2 MMP9 1 BRD8 1 A1 1 CYP17A1 3 BZRPL1 2 PCNA 1 PCNA

8 DCI 3 CCNG2 2 PGAM1 1 RBP4 1 ECH1 3 CRYBA2 2 THRA 1 WDR1 1 EHHADH 3 HBA2 2 THRB 1 SCD2 3 HKDC1 2 DBI 3 NR1D2 2 ACAA1 2 ATP1A2 1 CES2 2 CEBPD 1 HDC 2 CPLX1 1 bisphenol A Ftalates Parabens UV screens Nicotine UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG UPREG DOWNREG ESR1 8 APO14KDA 2 SLC5A5 6 NR0B1 6 TFF1 3 TFF1 4 AHR 1 AATK 1 AMHR2 1 S100G 6 APOA1 2 EGR1 4 LHCGR 5 IGF1 2 ESR1 1 APP 1 APP 1 VTG1 4 CYP1B1 2 GRB14 4 HNF1A 4 PGR 2 ESRRA 1 CACNA1F 1 BAD 1 VTG2 3 PIAS3 2 CYP1B1 3 INSIG1 4 CBL 1 BCL2A1 1 HOXA10 3 TGFB2 2 CYP4A1 3 INSL3 4 CCL5 1 BRCA1 1 PGR 3 TIMP3 2 FABP3 3 LDLR 4 CCR5 1 BTF3 1 CYP19A1 2 APOB 1 FOS 3 STAR 4 CD59 1 BTK 1 AURKA 2 CEL 1 JUN 3 SVS5 4 CYP2A3A 1 C5AR1 1 CDC6 2 COX1 1 PPARA 3 CYP17A1 3 CYP2B1 1 CART 1 MCM2 2 CYTB 1 PPARG 3 GALR2 3 EPO 1 CCL16 1 MYB 2 ELOVL2 1 SLC27A1 3 ADORA2A 3 EZR 1 CCR6 1 PCNA 2 METTL1 1 STAR 3 ADRA1A 3 FASLG 1 CD4 1 8

9 Tabel 1.3. Over-all top 50 van genen waarvan de expressie beïnvloed wordt door de hoger vermelde blootstellingen. UPREG DOWNREG Gene Count Gene Count Gene Count Gene Count CYP1A1 102 MT2 12 CYP11A1 10 TNFSF10 5 HMOX1 48 CYP19A1 11 STAR 9 CYP1A 5 CYP1B1 42 AHRR 11 BCL2 8 AHR 4 NQO1 31 AHR 11 HBB 8 ALB 4 CYP1A2 24 GSTA1 11 CYP1B1 8 HSD17B1 4 MT2A 23 GSTA2 11 LHCGR 8 FOS 4 ESR1 18 DDIT3 11 IL2 7 IGF1 4 FOS 18 CCND1 10 TNF 7 HBA 4 TXNRD1 18 MYC 10 CDKN1A 6 APOA1 4 HSP70 18 VEGFA 10 TGFB2 6 NEDD9 4 CYP1A 17 PGR 10 AR 6 SOX4 4 JUN 17 ABCB1 10 GJA1 6 GLUL 4 CYP1A4 16 CYP11B1 9 TERT 6 IL18 4 CYP1A5 16 CYP3A1 9 CYP1A1 5 PGR 4 TFF1 16 AFP 9 ID3 5 SCARB1 4 HSPA1A 15 MT1X 9 CYP17A1 5 CYP7A1 4 GSTP1 14 SOD1 9 SVS5 5 HSD11B1 4 MT1A 14 IGFBP1 9 EGR1 5 IER3 4 GADD45A 14 GCLC 9 BAX 5 CYP2E1 4 PCNA 14 IGF1 9 INSIG1 5 HSD3B1 4 NR1I3 13 MT1 9 LDLR 5 RBP1 4 ABCC2 13 CDKN1A 8 NR0B1 5 SULT1A1 4 CYP11B2 12 UGT1A6 8 BAD 5 DHRS3 4 CYP2B1 12 COX1 8 CCL2 5 SERPINE1 4 EGR1 12 HSP22 8 ID2 5 TH BS Selectie van sleutengenen in de carcinogenese en andere aandoeningen op basis van enkele review-publicaties en pubmed-gene Als tweede deel van de theoretische selectieprocedure, werden enkele reviewpublicaties gebruikt, alsook de literatuurdatabank PubMed-gene. Een korte toelichting wordt hier gegeven. 1. Hallmarks of cancer (Hanahan & Weinberg 2000): deze auteurs stellen voorop dat veel of de meeste kankers een aantal gemeenschappelijke eigenschappen kennen: een zelfvoorziening aan groeisignalen, ongevoeligheid voor externe groeisignalen, omzeilen van de apoptose, ongelimiteerd delingspotentiaal, langdurige vorming van nieuwe bloedvaten en weefselinvasie en metastase. Bij elk van deze factoren zijn genen en eiwitten betrokken die 9

10 bepaalde sleutelrollen kunnen vervullen. Daaruit werden een aantal potentieel interessante genen weerhouden, zoals hier wordt verduidelijkt. - Positieve/negatieve groeifactoren: - TGFB: blokkeert progressie door celcyclus-g1 fase - p15, p21: blokkeren cycline:cdk-complexen en regelen progressie door G1- fase. Gereguleerd door p53 - c-myc: transcriptiefactor die bij overexpressie differentiatie verhindert en groei promoot - (inhibitie van) apoptose: - pro-apoptose: TNFa, FAS, Bax, Bad, Bid, Bim, caspases - anti-apoptose: IGF1/2, IL-3, Bcl-2 - Angiogenese (bloedvadvorming): - pro-angiogenese: VEGF, FGF1/2 - angiogenese-inhibitoren: thrombospondin-1 - Invasive en metastase: integrines en cadherines linken cellen aan extracellulaire matrix. Deze koppeling resulteert in bepaalde regulatorische signalen: - E-cadherin: geeft groei-inhiberende signalen door aan interne celsignalisatie, zoals de Lef/Tcf transcriptie factoren 2. Environmental exposures and gene regulation in disease etiology (Edwards & Meyers 2007) Deze publicatie gaat in op hoe milieublootstellingen de genexpressie beïnvloedt en hoe dit kan leiden tot bepaalde aandoeningen: - Non-hodgkin lymphoma en pesticide exposure: BCL-2 overexpressie (antiapoptose) - Luchtvervuiling, activatie van onstekingsgerelateerde genen en ademhalingsstoornissen: inductie van NF-kB, AP-1, en IL-8 (onstekingsmerker) - Xeno-oestrogenen, transcriptie en allergieën: verhoging van IL-4 mrna niveau, : 10

11 3. Pubmed-gene Via PubMed-gene werden verder nog een aantal genen geselecteerd wegens hun rol i.v.m. bepaalde blootstellingen of pathologische effecten: - AHR: transcription factor involved in the regulation of biological responses to planar aromatic hydrocarbons - FOS: has been implicated as regulator of cell proliferation, differentiation, and transformation. In some cases, expression of the FOS gene has also been associated with apoptotic cell death. - STAT1: The protein encoded by this gene is a member of the STAT protein family. In response to cytokines and growth factors, STAT family members are phosphorylated by the receptor associated kinases, and then form homo- or heterodimers that translocate to the cell nucleus where they act as transcription activators. This protein can be activated by various ligands including interferonalpha, interferon-gamma, EGF, PDGF and IL6. This protein mediates the expression of a variety of genes, which is thought to be important for cell viability in response to different cell stimuli and pathogens. - BCL-2: This gene encodes an integral outer mitochondrial membrane protein that blocks the apoptotic death of some cells such as lymphocytes. Constitutive expression of BCL2, such as in the case of translocation of BCL2 to Ig heavy chain locus, is thought to be the cause of follicular lymphoma. - GADD45A: This gene is a member of a group of genes whose transcript levels are increased following stressful growth arrest conditions and treatment with DNAdamaging agents. The protein encoded by this gene responds to environmental stresses by mediating activation of the p38/jnk pathway via MTK1/MEKK4 kinase. The DNA damage-induced transcription of this gene is mediated by both p53-dependent and -independent mechanisms. - ESR1: This gene encodes an estrogen receptor, a ligand-activated transcription factor composed of several domains important for hormone binding, DNA binding, and activation of transcription. The protein localizes to the nucleus where it may form a homodimer or a heterodimer with estrogen receptor 2. Estrogen and its receptors are essential for sexual development and reproductive function, but also play a role in other tissues such as bone. Estrogen receptors are also involved in pathological processes including breast cancer, endometrial cancer, and osteoporosis. Alternative splicing results in several transcript variants, which differ in their 5' UTRs and use different promoters. - IGF: The protein encoded by this gene is similar to insulin in function and structure and is a member of a family of proteins involved in mediating growth and development. The encoded protein is processed from a precursor, bound by a specific receptor, and secreted. Defects in this gene are a cause of insulin-like growth factor I deficiency. Several transcript variants encoding different isoforms have been found for this gene. 11

12 - BID: This gene encodes a death agonist that heterodimerizes with either agonist BAX or antagonist BCL2. The encoded protein is a member of the BCL-2 family of cell death regulators. It is a mediator of mitochondrial damage induced by caspase-8 (CASP8); CASP8 cleaves this encoded protein, and the COOH-terminal part translocates to mitochondria where it triggers cytochrome c release Gebruik van deze gegevens in de selectieprocedure Na overleg met de partners aan de Universiteit Maastricht (GRAT), werd besloten de uiteindelijke selectie van 20 genen voor het tweede steunpunt Milieu en Gezondheid, niet te baseren op deze literatuur-gegevens. De voornaamste reden hiervoor is het sterk evoluerende (en onvolledige) karakter van genexpressie-data, waardoor het wetenschapsdomein rond genexpressie zeer snel evolueert en data snel verouderd zijn. Het is duidelijk dat de onze inzichten inzake beïnvloeding van de genexpressie door blootstelling aan vervuilende stoffen nog zeer onvolledig zijn. Daarom werd ook besloten de keuze zo pragmatisch mogelijk te maken, gebaseerd op de resultaten van een whole-genome analyse van 40 personen uit de volwassenendataset van het eerste Steunpunt Milieu en Gezondheid. 12

13 2. Genexpressie van 40 volwassenen i.f.v. interne blootstelling aan diverse polluenten. Studie in het kader van de selectie van genen voor genexpressieanalyse in het tweede Steunpunt Milieu en Gezondheid 2.1. Doelstellingen - Meten van verschillen in genexpressie tussen hoog en laag blootgestelde individuen - Welke polluenten zijn hiervoor verantwoordelijk - Welke genen komen differentieel tot expressie 2.2. Methodes - Selectie van 40 volwassenen niet-rokers (50-65j), 20 hoog (H) & 20 laag (L) blootgestelden - Evenredig verdeelde leeftijdscategorieën: 50-55j (7H,7L), (6H,6L), (7H,7L) - Blootstelling aan: cadmium, lood, PCBs ( ), PCB118, dioxines (TEQ), HCB, p,p - DDE, PAKs (OH-pyreen), benzeen (ttma) - Beoordeling en rangschikking van blootstelling via z-score van elke polluent, als een som van 9 individuele z-scores - Genexpressieanalyse d.m.v. Agilent 4x44k human microarrays ( probes) 2.3. Resultaten Populatiekenmerken - Algmene kenmerken van de populatie, zoals persoonljike kenmerken en interne blootstelling aan diverse stoffen wordt weergegeven in tabel Alle blootstellingsmerkers zijn significant hoger bij de hoog blootgestelde groep, behalve Cd (p=0.11 en 0.08 voor Cd urine resp. bloed) en ttma (p=0.078). 13

14 Tabel 2.1: populatiekenmerken Parameter High exposed Low exposed (p-value of difference high-low) Descriptives Age (0.54) ± ± 1.01 Weight BMI Sex (M/F) 6/14 14/6 Internal exposure Cd urine (0.11) mg/g crt 0.67 ± ± 0.04 Cd blood (0.08) µg/l 0.52 ± ± 0.06 Pb blood (0.0023) µg/l ± ± 3.40 HCB fat (4.7*10-12 ) ng/g lipid ± ± 2.56 HCB (2.1*10-10 ) µg/l 0.72 ± ± 0.01 PCB 118 fat (1.3*10-9 ) ng/g lipid ± ± 1.30 PCB 118 (3.6*10-9 ) ng/ml 0.36 ± ± Sum PCBs fat (1.4*10-8 ) ng/g lipid ± ± 17.6 Sum PCBs (2.31*10-8 ) ng/ml 3.38 ± ± 0.11 pp_p,p -DDE fat (6.2*10-7 ) ng/g lipid ± ± 44.8 pp_p,p -DDE (4.2*10-7 ) ng/ml ± ± 0.34 TEQ fat (0.0016) pg TEQ/g lipid ± ± 2.02 TEQ serum (0.003) pg TEQ/g serum 0.15 ± ± ttma (0.078) mg/g crt 0.10 ± ± OH-pyr (0.044) µg/g crt 0.23 ±

15 Dataset 20H vs. 20L (alle stalen) In eerste instantie werd de dataset van 40 personen gebruikt voor de data-analyse (mannen en vrouwen samen). Het aantal genen dat (voor de hele dataset: mannen en vrouwen) differentieel tot expressie komt in beide groepen (per significantieniveau) is weergegeven in tabel 2.2 (analyse: t-test in GEPAS). Tabel 2.2. Aantal genen waarvan de expressie significant verschilt tussen de groep hoog en laag blootgestelden (per significantieniveau). Totaal aantal genen in de analyse na filtering: ALL Significance Up-regulated Down-regulated p< p< p< Door het relatief lage aantal significante genen die werden bekomen na het vergelijken van beide groepen (hoge vs. lage blootstelling op basis van een z score van de 9 blootstellingsmerkers), werd overgegaan op Pearson correlatie-analyses van de individuele blootstellingsvariabelen met de genexpressie. Het resultaat van deze correlatie-analyses wordt weergegeven in tabel Filtering bestaande uit verwijderen van genen met >30% missende waarden, en van genen met een zeer constante expressie overheen de dataset (flat-pattern filtering) 15

16 Tabel 2.3.Aantal genen waarvan de expressie positief resp. negatief correleert aan specifieke blootstellingsmerkers (Pearson correlatie p<0.05, totaal aantal genen in de analyse na filtering 2 : 19012). All pos neg tot Cd urine Cd blood Pb blood ttma OH-pyr PCB 118 fat Sum PCBs fat TEQ fat HCB fat DDE fat Afzonderlijke data-analyse voor beide geslachten (eerste selectiecriterium) Door de vrij lage aantallen significante genen bij data-analyse van de hele groep, en de waarneming van zeer grote verschillen in genexpressie tussen beide geslachten, werd vervolgens overgegaan tot afzonderlijke analyses voor beide geslachten. Deze nieuwe datasets hebben echter een ongelijke verdeling van de hoog/laag blootgestelden: bij de mannen 6H/14L, bij de vrouwen 14H/6L. Gegevens van zowel t-test analyses (hoge vs lage blootstellling) als van correlatie-analyses worden weergegeven in de tabellen 2.4 en 2.5. Zeer grote verschillen tussen beide geslachten worden waargenomen, zowel naar aantallen genen, als naar welke genen significant correleren. Door de schijnbaar verschillende reactie in genexpressie op blootstelling aan diverse stoffen werd besloten om verder te werken met deze afzonderlijke datasets. Deze correlatie-analyses vormen de eerste stap in de selectieprocedure, met als criterium een p-waarde lager dan Filtering bestaande uit verwijderen van genen met >30% missende waarden, en van genen met een zeer constante expressie overheen de dataset (flat-pattern filtering) 16

17 Tabel 2.4.Aantal genen waarvan de expressie significant verschilt tussen de groep hoog en laag blootgestelden voor de beide geslachten afzonderlijk (per significantieniveau). Totaal aantal genen in de analyse na filtering: (M) resp (F). Male Female Significance Up-regulated Down-regulated Up-regulated Down-regulated p< p< p< Tabel 2.5 Aantal genen waarvan de expressie positief resp. negatief correleert aan specifieke blootstellingsmerkers (Pearson correlatie p<0.05, totaal aantal genen in de analyse na filtering: (M) resp (F)). Male Female All pos neg tot pos neg tot pos neg tot Cd urine Cd blood Pb blood ttma OH-pyr PCB 118 fat Sum PCBs fat TEQ fat HCB fat DDE fat

18 Er werd nog verder ingegaan op de waargenomen geslachtsverschillen wat betreft genexpressieveranderingen gecorreleerd aan de blootstellingsmerkers, door na te gaan welke genen zowel bij mannen als bij vrouwen significant correleerden met een bepaalde blootstelling, en door de richting van correlaties na te gaan: i.e. bij beide geslachten een gelijk teken dan wel een verschillend teken van de correlatiecoëfficiënt. De aantallen genen die zowel bij mannen als vrouwen positief correleren worden weergegeven in tabel 2.6. Daarin blijken grote verschillen tussen de verschillende blootstellingsmerkers te bestaan. Zo correleren genen geassocieerd met blootstelling aan cadmium en OH-pyreen hoofdzakelijk in de zelfde richting (zelfde teken van de correlatiecoëfficiënt), terwijl dat voor de sompcbs, teq, DDE en HCB hoofdzakelijk in tegengestelde richting is. Dit is met name zeer uitgesproken voor sompcbs, met 235 van de genen (of 95%) met een tegengestelde correlatiecoefficient, tegenover 12 genen met een gelijk teken voor de correlatiecoëfficient bij mannen en bij vrouwen. Deze waarneming wijst op verschillen in genexpressieveranderingen onder invloed van blootstelling aan deze polluenten. Tabel 2.6: Aantal genen met bij beide geslachten eenzelfde, dan wel tegengesteld teken van de correlatiecoëfficiënt, voor elke blootstellingsmerker, voor genen met p-waarde van correlatie bij beide geslachten < 0,05, alsook de binomiale probabiliteit op de verdeling van deze waarden. Correlations coefficients when p<0.05 +/+ or -/- +/- or -/+ TOT Binomial probability 19 p=0,05 Cd crea 13 68% 6 32% 22 p=0,041 Pb 7 32% 15 68% DDE 10 4% % 238 p<0, HCB 8 19% 35 81% 43 p= SUMPCB 12 5% % 247 p<0, PCB % 17 63% 27 p=0,063 TEQ 4 7% 55 93% 59 p<0, TTMA 11 55% 9 45% 20 p=0,16 hpyr 21 84% 4 16% 25 p=0,

19 Pathway-analyses (tweede selectiecriterium) Om ook de biologie en functie van de genen te includeren in de selectieprocedure, werden ook pathway-analyses uitgevoerd als tweede selectiecriterium. Als basis hiervoor werd gebruik gemaakt van alle genen die correleerden met één van zes blootstellingsmerkers (cadmium urine, lood, som PCBs, teq,ttma, OH-pyr) met een significantie van p<0.01. Wegens de sterke overeenkomsten tussen HCB, DDE en PCB118 met sompcbs, werden deze blootstellingsmerkers niet verder gebruikt in de selectieprocedure). Met behulp van het programma MetaCore, werden genen geassocieerd met pathways met een significantieniveau van p<0.05 weerhouden 3. De op deze manier bekomen genenlijst vormde de basis van verdere selectiestappen. Aantallen genen die resteerden na deze selectiestappen worden weergegeven in tabel 2.7. Tabel 2.7 Aantal genen resterend in de selectie: na criterium p-waarde correlatie<0.01 en na additioneel criterium gen in Metacore pathway met p<0.05 ). Correlation p<0,01 MetaCore p<0,05 M F M F Cd crea Pb SUMPCB TEQ TTMA hpyr Verwacht verschil in genexpressie tussen personen met p10 en de p90 waarden van de blootstelling (derde selectiecriterium) Als derde en laatste selectiecriterium werd een minimale vereiste genexpressieverandering ingevoegd. Per gen en per polluent werd de verwachte genexpressieverandering berekend - op basis van de regressievergelijking - tussen de waarde p10 en de waarde p90 voor blootstelling. Om tot een selectie van 20 genen te komen bij mannen en 20 bij vrouwen, werd respectievelijk een genexpressieverandering van 62% (M) en 51% (F) aangehouden als criterium. Voor PCBs bij de mannen, bleef een groot aantal ribosomale genen in de selectie. Hiervoor werd een small en een large ribosomal subunit gerelateerd gen geselecteerd op basis van de laagste p-waarde en grootste waarde voor verwachte genexpressieverandering (zoals beschreven in ). Voor OH-pyreen bij de mannen bleven 4 genen gerelateerd aan histone cluster 1 over, waaruit twee genen geselecteerd werden, op basis van de laagste p-waarden en grootste waarde voor verwachte genexpressieverandering. Tabel 2.8 geeft de geselecteerde genen weer, met hun kenmerken. Merk op dat via dit onderzoek 16 resp. 17 genen geselecteerd werden (mannen resp. vrouwen), die werden aangevuld met 4 resp. 3 genen waarvan in het onderzoek van D. van Leeuwen (2008) voor 3 Metacore werkt met over of onder-representatie van bepaalde pathways in een lijst met genen tegenover een achtergrondlijst van genen, en berekent op basis van de mate van over/onderrepresentatie een p-waarde. 19

20 het eerste Steunpunt Milieu en Gezondheid correlaties met blootstelling aan milieupolluenten werden waargenomen (Mannen:CYP1B1, MAPK14, SOD2, DGAD2; vrouwen: CYP1B1, CXCL1, DGAT2). Tabel 2.8. Selectie van 2 keer 20 genen, met de verwachte genexpressieverandering tussen p10 en p90 van de desbetreffende blootstelling op basis van de regressievergeljiking, en de p-waarde van de regressie. Cd= cadmium, Pb=lood, PCB=somPCBs, teq=teq, ttma= t,t-muconzuur, hpyr=oh-pyreen. Male subset Exposure GENE Change p10- p90 p-value regression cadmium AREG amphiregulin (schwannoma-derived growth factor) 1, , PPP1CB protein phosphatase 1, catalytic subunit, beta isoform -0, , lead APOL6 apolipoprotein L, 6 0, ,00341 EXOC8 exocyst complex component 8 0, , PCBs RPL34 ribosomal protein L34-1,086 0, RPS3A ribosomal protein S3A -1,0261 0,00096 HLA-DQA1 major histocompatibility complex, class II, DQ alpha 1 1, , HEY1 hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif 1 0, ,0078 COX7B cytochrome c oxidase subunit VIIb -0, ,00143 teq (~dioxins) - ttma (~benzene) JAK2 Janus kinase 2 (a protein tyrosine kinase) -0, , ACTA2 actin, alpha 2, smooth muscle, aorta 0, , PPP3R1 protein phosphatase 3 (formerly 2B), regulatory subunit B, alpha 1, , isoform OH-pyrene (~PAHs) HIST1H4L histone cluster 1, H4l -0, , HIST1H4C histone cluster 1, H4c -0, , IFI6 interferon, alpha-inducible protein 6 0, , ARID4A AT rich interactive domain 4A (RBP1-like) 1, , Female subset Exposure GENE Change p10- p-value p90 regression cadmium SPHK1 sphingosine kinase 1 0, , ASAHL N-acylsphingosine amidohydrolase (acid ceramidase)-like -0, , lead ABCA1 ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 1-0, , PCBs TNS1 tensin 1 0, , teq (~dioxins) HEY1 hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif 1 0, , GIT1 G protein-coupled receptor kinase interactor 1-0, , GSTT1 glutathione S-transferase theta 1-0, , ttma (~benzene) HLA-G HLA-G histocompatibility antigen, class I, G -1, , GSTM2 glutathione S-transferase M2 (muscle) 1, , B4GALT1 UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4- galactosyltransferase, polypeptide 0, , G6PD glucose-6-phosphate dehydrogenase 1, , HNMT histamine N-methyltransferase -1, , EIF2S1 eukaryotic translation initiation factor 2, subunit 1 alpha, 35kDa -0, , HLA-DRB5 major histocompatibility complex, class II, DR beta 5-1, , OH-pyrene (~PAHs) MAN1B1 mannosidase, alpha, class 1B, member 1 0, ,

21 PIAS2 protein inhibitor of activated STAT, 2-0, , SMS spermine synthase 0,6142 0, Discussie en conclusie A priori kan men verwachten dat de wijziging van de genexpressie bij mannen en vrouwen op blootstelling aan een polluent in dezelfde richting (ofwel daling ofwel stijging) verloopt. Het feit dat de waargenomen associaties in tegengestelde zin verlopen zou in de eerste plaats verklaard kunnen worden door het feit dat één of beide associaties aan het toeval te wijten zijn. Het feit dat, voor sommige polluenten, de wijziging in de expressie van een significante meerderheid genen voor mannen en vrouwen in tegengestelde zin verloopt kan echter wijzen op het feit dat het hier gaat om wijzigingen, veroorzaakt door blootstelling aan de betreffende polluent, die door sex-hormonen of andere specifiek sexgebonden factoren beïnvloedt worden. Na verschillende statistische analyses en selectiecriteria op basis van p-waarden van regressie-analyses, p-waarden van pathway-analyses en de verwachte genexpressieverandering (op basis van de regressievergelijking en p10 en p90 waarden voor blootstelling), werd een finale selectie van 20 genen per geslacht weerhouden. Voor de mannen: AREG, PP1CB, APOL6, EXOC8, HLA-DQA1, COX7B, HEY1, RPL34, RPS3, JAK2, ACTA2, PPP3R1, HIST1H4L, HIST1H4C, IFI6, ARID4A, CYP1B1*, MAPK14*, SOD2*, DGAT2*. Voor de vrouwen: SPHK1, ASAHL, ABCA1, TNS1, HEY1, GSTT1, GIT1, HLA-G, GSTM2, G6PD, HNMT, HLA-DRB5, B4GALT1, EIF2S1, MAN1B1, PIAS2, SMS, CYP1B1*, CXCL1*, DGAT2*. Genen met een * werden geselecteerd op basis van correlaties met blootstellingsmerkers die beschreven werden door D. van Leeuwen (2008) in het kader van het eerste Steunpunt Milieu en Gezondheid. Referenties Edwards TM, Myers JP. Environmental exposures and gene regulation in disease etiology Environ Health Perspect. 115(9): Hanahan D, Weinberg RA The hallmarks of cancer. Cell. 7;100(1): van Leeuwen DM, Gottschalk RW, Schoeters G, van Larebeke NA, Nelen V, Baeyens WF, Kleinjans JC, van Delft JH Transcriptome analysis in peripheral blood of humans exposed to environmental carcinogens: a promising new biomarker in environmental health studies. Environ Health Perspect. 116(11): The Comparative Toxiciogenomics Database (CTD). accessed june Dit rapport draagt de volledige goedkeuring van het Steunpunt Milieu en Gezondheid. 21