Legionella metingen in oppervlaktewater

Transcriptie

1 Ministerie van Verkeer en Waterstaat jklmnopq Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling/RIZA Legionella metingen in oppervlaktewater Verslag van een oriënterend onderzoek Werkdocument X December 2001 auteurs: Ing. P.J.C. Kuiper en Drs. R.P.M. Berbee RIZA Postbus AA Lelystad Bezoekadres: Zuiderwagenplein AD Lelystad

2 Legionella in oppervlaktewater Verslag van een oriënterend onderzoek Werkdocument X December 2001 auteurs: Ing. P.J.C. Kuiper en Drs. R.P.M. Berbee Legionella metingen in oppervlaktewater

3 Legionella metingen in oppervlaktewater

4 Inhoudsopgave Inhoudsopgave Voorwoord Samenvatting 1 Inleiding Aanleiding Doel en opzet oriënterend onderzoek testmethoden Legionella Leeswijzer rapport 2 2 Testmethoden Overzicht testmethoden Soorten Legionella Levenscyclus en verschijningsvormen van Legionella Overzicht detectiemethoden Beschrijving testmethoden De kweekmethode DFA methode (Direct Fluorescent Antibody) FISH methode (Fluorescente In Situ Hybridisatie) PCR methode (Polymerase Chain Reaction) De Colony Blot methode Snelle testen 8 3 Resultaten en evaluatie Resultaten De kweekmethode Beschrijving Evaluatie De FISH methode Beschrijving Evaluatie Opwekken van Legionella uit VBNC Legionella Evaluatie van de resultaten van het oriënterend onderzoek 10 4 Conclusies 13 5 Referenties 15 Legionella metingen in oppervlaktewater

5 Legionella metingen in oppervlaktewater

6 Voorwoord Door het RIZA is een oriënterend onderzoek verricht naar de gehalten van Legionella in het water van de Rijn en de Maas. Deze metingen zijn van belang in verband met de groei van Legionella in de koeltorens van circulatiekoelsystemen, de bestrijding van Legionella met biociden en de lozingen van het biocidehoudend koelwater. Metingen van Legionella in oppervlaktewater blijken niet eenvoudig te zijn. De standaard in Nederland gebruikte kweekmethode bleek hiervoor niet geschikt en de inzet van geavanceerdere meetmethoden blijkt noodzakelijk te zijn. Met de zogenaamde FISH-methode is Legionella in het water van de grote rivieren aangetoond. Dit is in lijn met de bevindingen zoals die in het buitenland zijn gesignaleerd. Van een breder monitoring programma wordt afgezien omdat hiervoor nog veel ontwikkelingswerk op het gebied van Legionellametingen noodzakelijk is. De in dit rapport beschreven metingen zijn uitgevoerd door medewerkers van het waterleidingbedrijf WMO in Zwolle. De interpretatie van de gegevens en risico s van de aangetroffen legionellabacteriën was niet eenvoudig. Hiervoor zijn vele Nederlandse deskundigen op het gebied van microbiologie geraadpleegd (KIWA, Omegam, RIVM, KEMA en de WMO). Voor mensen die in hun dagelijks werk te maken hebben met metingen, interpretatie en behandeling van risico s t.g.v. Legionella kan dit rapport een waardevolle informatiebron zijn. Peter Kuiper en Rob Berbee Afdeling Procestechnologie van het RIZA Legionella metingen in oppervlaktewater

7 Legionella metingen in oppervlaktewater

8 Samenvatting Aanleiding tot het oriënterend onderzoek In 1999 is het RIZA rapport: Legionella in oppervlaktewater, in koelwater, in RWZI s, etc verschenen. Daarin werden o.a. aanbevelingen gedaan voor onderzoek naar de aanwezigheid van Legionella in oppervlaktewater. RIZA heeft in 2000 een oriënterend onderzoek gedaan naar de meetbaarheid van Legionella in oppervlaktewater. De resultaten hiervan zijn in dit rapport beschreven. Het oriënterend onderzoek had tot doel na te gaan of Legionella op verantwoorde wijze in oppervlaktewater kan worden gemeten. Het vooronderzoek ging vooraf aan een mogelijk uitgebreider meetprogramma. RIZA heeft monsters genomen van Rijn en Maas en deze monsters zijn geanalyseerd op Legionella door Waterleiding Maatschappij Midden Overijssel (WMO). Daarnaast zijn er voor de interpretatie van de gegevens gesprekken over de meettechnieken voor Legionella gevoerd met een aantal deskundigen bij KIWA, KEMA, RIVM en Omegam. Gegevens over Legionella in oppervlaktewater zijn relevant voor de Wvoadvisering over het gebruik van biociden in circulatie koelsystemen met koeltorens. Koeltorens kunnen aanleiding zijn tot aërosolvorming en vormen daarmee een potentiële bron voor verspreiding van Legionella [KIWA, 2001]. Indien de Legionella gehalten in het ingenomen oppervlaktewater hoog zijn, kan dit betekenen dat eerder besmetting van het koelsysteem optreedt. Daardoor moeten bedrijven mogelijk meer biociden gaan gebruiken om (humane) risico s te beperken. Deze biociden komen via de spui van de koelsystemen in het oppervlaktewater terecht. Deze stoffen kunnen zeer nadelige consequenties hebben voor de aanwezige waterorganismen. Resultaten met kweekmethode en FISH methode Bemonsterd is op een drietal locaties in Rijn en Maas, te weten de meetstations Lobith, Eijsden en Keizersveer. Hierin zijn Legionella gehalten gemeten met behulp van de kweekmethode volgens NEN 6265 en de Fluorescente In Situ Hybridisatie methode (FISH). Deze twee methoden zijn geselecteerd omdat daar de meeste ervaring mee was bij het waterleidingbedrijf WMO. Gebleken is dat de kweekmethode geen bruikbare resultaten opleverde. Bij gefiltreerde oppervlaktewater monsters trad overgroei van de kweek met concurrerende microflora op. In ongefiltreerde monsters werden geen Legionella aangetroffen. De detectiegrens in ongefiltreerde monsters ligt hoof en bedraagt < kve/l (kolonievormende eenheden per liter). Ter vergelijking: in drinkwater ligt de detectiegrens op 50 kve/l. Geconcludeerd kan worden dat de kweekmethode niet geschikt is voor het meten in oppervlaktewater. De FISH methode leverde wel meetresultaten boven de detectiegrens: de aantallen liepen van tot kve/l. De gehalten bij Eijsden en Lobith bedroegen in de zomer (eind juli/begin augustus) resp kve/l en kve/l. In de herfst (medio oktober) waren de gehalten ongeveer gehalveerd en bedroegen resp en kve/l. In Keizersveer was het gehalte beneden de detectiegrens (<1000 kve/l). Legionella metingen in oppervlaktewater

9 Het feit dat de Legionella niet in de kweektest werden gevonden en wel in de FISH test, duidt op de aanwezigheid van zgn. Viable But Non-Culturable (VBNC) Legionella. Viable But Non-Culturable (VBNC) is een vorm waarin de bacteriën overleven onder voor hen slechte leefomstandigheden, maar waarin ze niet op te kweken zijn met behulp van de gebruikelijke Agar kweekmethode (volgens NEN6265). Volgens Steinert kunnen VBNC Legionella aanleiding geven tot de zgn. Pontiac fever [Steinert 1997]. Het feit dat ze via amoeben (en soortgelijke organismen, waaronder dierlijke en menselijke cellen) toch weer zeer virulent kunnen worden, noopt tot extra voorzichtigheid bij een positieve uitslag in een FISH test. Figuur S 1: legionellabacterie die gepakt wordt door een amoebe. Door de universiteit van Würzburg is in het kader van het project Ecologie en pathogenese van Legionella pneumophila getracht vast te stellen of de gevonden VBNC Legionella in de monsters van Eijsden en Lobith opkweekbaar zijn via amoeben (Acanthamoeba castellanii). Dit onderzoek is echter mislukt.. Een proefondervindelijk bewijs voor de opkweekbaarheid van de VBNC Legionella via de amoeben kon hierdoor niet worden geleverd. Alternatieve methoden Naast de gebruikte kweekmethode en de FISH-methode bestaan er nog andere bepalingsmethoden. Het betreft hier de zogenaamde DFA-methode (detectectie op basis van legionella-eiwit) en de PCR-methode (detecteert legionella-dna). Daarnaast is er een aantal snelle testen die binnen een uur of enkele uren een resultaat opleveren, zoals de de Equate test van Binax en de Microdetect van IQ Products. Met deze laatste testen was nog weinig ervaring, waardoor deze hier niet verder zijn besproken. In figuur S2 is een indicatief overzicht opgenomen van de onderlinge verhoudingen van uitslagen van Legionella-testen [v.d. Kooij, 2001 c] bij testen in hetzelfde water. De verschillende methoden blijken tot sterk verschillende Legionella metingen in oppervlaktewater

10 uitkomsten aanleiding te geven. Dit komt doordat sommige methoden zowel dode als levende legionellabacteriën meten. Bij de interpretatie van de hoogte van Legionella test-resultaten is het daarom belangrijk het werkingsmechanisme van de toegepaste methode hier steeds bij te betrekken. Figuur S2: Onderlinge verhoudingen van de uitslagen van verschillende Legionella bepalingsmethoden (indicatief) [Van der Kooij 2001 c] ,1 0, PCR: DNA, levende + dode Legionella DFA: levende + dode (intacte) Legionella FIS H: levende Legionella, incl. VBNC Kweekbare Legionella (actief) Virulente Legionella (geen bepalingsmethode) Indicatie van de betekenis van de bepalingsmethoden Een interessante methode voor oppervlaktewater is de Colony Blot-methode (ELISA-Systems Legionella, Riedel-de Haën) [Jenner 2001; Worst 2001]. Deze methode gaat uit van de kweekmethode (stap 1), maar heeft geen last van overgroei door aanwezige bacteriën, doordat Legionella worden gekleurd (stap 2). Dit laatste gebeurt met specifieke antilichamen, waarmee Legionella reageren. In Duitsland zijn positieve ervaringen met de methode gemeld. Ook KEMA gebruikt de methode voor haar onderzoek in koelwatersystemen. Gemeten gehalten in oppervlaktewater liggen in de ordegrootte van 1000 kve/l [Worst 2001]. Conclusies en aanbevelingen Uit het oriënterend onderzoek blijkt, dat de kweekmethode niet werkt voor oppervlaktewater, dat de FISH methode Legionella in oppervlaktewater aantoont, dat de met de FISH methode gemeten Legionella in de zgn. VBNC vorm is, dat niet zeker is of de gevonden VBNC Legionella nog opkweekbaar is tot de zeer virulente vorm, dat de Colony Blot methode in verband met de aanwezige kweekstap in combinatie met de detectiestap, voor oppervlaktewater een interessant alternatief kan zijn. Uit dit oriënterende onderzoek is duidelijk dat er verschillende testen zijn voor Legionella die tot sterk uiteenlopende resultaten aanleiding kunnen geven. Voor het verantwoord kunnen meten van Legionella in oppervlaktewater is nog veel ontwikkelingswerk nodig. Om die reden ziet RIZA af van een uitgebreider monitoringsproject in oppervlaktewater. Legionella metingen in oppervlaktewater

11 Legionella metingen in oppervlaktewater Uit dit oriënterende onderzoek is duidelijk geworden dat Legionella in het koelwater kan voorkomen. De normale beheersingsprogramma s voor bacteriegroei in circulatiekoelsystemen zullen dan in principe ook effectief zijn voor beperking van de groei van Legionella. Hierbij moet bijvoorbeeld worden gedacht aan de beperking van de intrek van zwevend stof, voorkomen dode einden in de koelsystemen e.d. [Van Donk,1996]. Mochten er desondanks Legionella in te hoge aantallen worden geconstateerd, dan zullen er afhankelijk van de aangetroffen niveaus soms iets verhoogde gehalten aan biociden noodzakelijk zijn. Gelet op de hoge toxiciteit van de gebruikte biociden kan dit nadelige consequenties hebben voor de organismen in het oppervlaktewater. Afhankelijk van de gehalten aan biociden kan het dan noodzakelijk zijn om het koelwater te ontgiften alvorens lozing op het oppervlaktewater plaatsvindt. De verschillende mogelijkheden hiervoor worden in opdracht van het RIZA op dit moment uitgewerkt.

12 Legionella metingen in oppervlaktewater

13 1 Inleiding 1.1 Aanleiding Sinds de uitbarsting van de veteranenziekte door met Legionella besmet water tijdens de Flora in Bovenkarspel (februari 1999), is de Legionella problematiek volop in de belangstelling. Uiteraard is de volksgezondheid daarbij de voornaamste invalshoek. Diverse partijen spelen hierbij een rol: de Ministeries van SZW, WVS en VROM, maar ook allerlei onderzoeksinstellingen. Maatregelen die voor de bestrijding van Legionella nodig zijn kunnen ook gevolgen hebben voor de lozingen op het oppervlaktewater. Hierbij moet bijvoorbeeld worden gedacht aan de vele honderden industriële circulatiekoelsystemen met koeltoren. Hierin wordt oppervlaktewater ingetrokken waarin Legionellabacteriën aanwezig kunnen zijn. In de koeltorens komen temperatuurcondities voor waaronder deze bacterie zich kan vermenigvuldigen. De hierdoor verhoogde gehalten aan Legionellabacteriën kunnen nadelige consequenties hebben voor de mensen op de industrieterreinen en in de leefomgeving daarbuiten. Hierdoor kan het nodig zijn dat verhoogde gehalten aan biociden noodzakelijk zijn om de bacterie te bestrijden. Via de spui uit deze koelsystemen komen deze biociden vervolgens in het oppervlaktewater terecht. Hier kunnen deze zeer giftige middelen effecten hebben op daarin aanwezige waterorganismen. Naarmate er meer Legionella in het oppervlaktewater aanwezig zijn zullen er dus meer biociden voor de bestrijding noodzakelijk kunnen zijn. Dit staat in principe haaks op het nationale beleid om het gebruik van biociden zoveel mogelijk terug te dringen. Dit beleid is verwoord in het Meerjarenplan Hygiëne en Materiaalbescherming MJP-H [Ministerie VROM, 1994]. Uit onderzoek van het RIZA is gebleken dat de kennis over Legionellabacteriën in Nederlands oppervlaktewater zeer beperkt is [Berbee, 1999]. Omdat er sprake is van een relatie is tussen Legionella in het oppervlaktewater en verhoogde gehalten aan biociden in het spuiwater kan dit consequenties hebben voor de Wvo-vergunningen van bedrijven. Ten behoeve van de Wvoadviestaak van het RIZA is daarom een oriënterend onderzoek verricht naar de aanwezigheid van Legionellabacteriën in oppervlaktewater 1.2 Doel en opzet oriënterend onderzoek testmethoden Legionella Dit onderzoek gaat in op het verkrijgen van inzicht in de aantallen legionellabacteriën in Nederlands oppervlaktewater. Er zijn nog (te) weinig meetcijfers in oppervlaktewater [Berbee 1999]. Bovendien bestaan er analytische problemen bij metingen van Legionella in oppervlaktewatermonsters (zie ook hoofdstuk 2). Het doel van het onderzoek was om een betrouwbare detectiemethode voor Legionella in oppervlaktewater te selecteren. Vervolgens zou deze methode gebruikt worden voor een kortdurend meetprogramma in oppervlaktewater. Het onderzoek is begonnen met een korte inventarisatie naar geschikte detectiemethoden voor de meting in oppervlaktewater. Vervolgens zijn in overleg met Waterleidingbedrijf WMO twee methoden uitgekozen, waarmee Legionella in Maas en Rijn op twee momenten (zomer en herfst 2000) zijn gemeten. Daarnaast zijn er over de bepalingsmethoden en de resultaten 1

14 gesprekken gevoerd met een aantal deskundigen bij KIWA, KEMA, RIVM en Omegam. In dit werkdocument worden de resultaten weergegeven en besproken. 1.3 Leeswijzer rapport Hoofdstuk 2 gaat in op de onderzochte detectiemethoden, waarbij eerst een toelichting gegeven wordt op de soorten Legionella en hun levenscyclus. In hoofdstuk 3 worden de resultaten beschreven, waarna in hoofdstuk 4 de conclusies en aanbevelingen volgen. 2

15 2 Testmethoden 2.1 Overzicht testmethoden Soorten Legionella Er zijn 40 verschillende soorten Legionella, en deze soorten zijn verder onder te verdelen in serogroepen. De soort Legionella pneumophila (Lp) is bijvoorbeeld onder te verdelen in 14 verschillende serogroepen. Lp serogroep 1 is de voornaamste veroorzaker van veteranenziekte (legionellose). Vaak bepaalt een laboratorium alleen of Lp serogroep 1 aanwezig is. Dit is vanuit medisch oogpunt ingegeven; in 80 % van de gevallen dat bij patiënten de veteranenziekte wordt geconstateerd wordt dit veroorzaakt door Lp. En in die gevallen waar Lp wordt aangetoond, is in 90 % van de gevallen serogroep 1 de ziekteverwekker. Andere soorten Legionella kunnen net zo infectueus zijn als Lp serogroep 1, maar ze komen minder vaak voor [In t Veld, 2001a] Levenscyclus en verschijningsvormen van Legionella Evenals andere micro-organismen kunnen legionellabacteriën in actieve vorm aanwezig zijn maar ook in een soort slaaptoestand [Hussong 1987; Paszko- Kolva 1992, 1995]. Dit laatste gebeurt meestal wanneer de bacteriën ongunstige leefomstandigheden moeten overleven. De bacteriën kunnen in slaaptoestand zijn, soms in de vorm van cysten, die onder gunstige omstandigheden weer naar de normale vorm overgaan. Bacteriën in de slaaptoestand worden ook wel VBNC genoemd. VBNC staat voor Viable But Non-Culturable. In slaaptoestand zijn de Legionella in het laboratorium niet op te kweken. Dit komt doordat ze geen kolonies vormen onder dergelijke condities. Of legionellabacteriën in de slaaptoestand zelf nog de gevreesde veteranenziekte kunnen veroorzaken is niet zeker. In ieder geval kunnen zij de veel minder ernstiger Pontiac fever tot gevolg hebben. Figuur 1: legionellabacterie die gepakt wordt door een amoebe. 3

16 Van Legionella is bekend dat de slaaptoestand ook kan worden doorgebracht in be;aalde eencellige organismen, zoals bijvoorbeeld amoeben [Steinert 1997]. In de amoebe vindt de Legionella de gunstige milieuomstandigheden om zich te vermenigvuldigen. Dit parasitair gebruik vormt een zeer belangrijke en mogelijk de enige weg van vermenigvuldiging van Legionella (zie figuur 1). Een besmette amoebe kan de Legionella uitscheiden in zgn. vacuoles (blaasjes) [Berk 1998]. Deze blaasjes (enkele m in doorsnee) kunnen tientallen tot honderdtallen legionellabacteriën bevatten. De blaasjes zijn goed bestand tegen extreme omstandigheden, zoals aanwezigheid van bactericiden en bevriezen/ontdooien. Plotselinge grote uitbarstingen van Legionella zijn waarschijnlijk vooral te verklaren door de aanwezigheid van deze vacuoles. Inademing van aërosolen met vacuoles zal een belangrijke route tot veteranenziekte vormen. Sommigen veronderstellen daarom dat Legionella aangepakt kan worden door het beheersen van Amoeben [Flierman 1996]. Tabel 1: Verschijningsvormen Legionella. Verschijningsvorm virulent? type ziekte vrij in water actief (bacterie) ja veteranenziekte VBNC inactief (zoals cyste) ja Risico door opname in amoeben veteranenziekte/pontiac fever in amoeben (in)actief, maar sluimerend ja Risico uitscheiding vacuoles, bijv. vóór cystenovergang veteranenziekte/pontiac fever In vacuoles (in)actief, maar sluimerend ja veteranenziekte Overzicht detectiemethoden De aanwezigheid van Legionella kan op een aantal manieren worden aangetoond. In deze paragraaf worden deze detectiemethoden besproken. Het betreft de volgende methoden. De kweekmethode (standaard methode, gebaseerd op kweek) FISH (gebaseerd op RNA) PCR (gebaseerd op DNA) DFA (gebaseerd op antilichamen) CB (gebaseerd op kweek en antilichamen) Snelle testen In figuur 1 is een indicatief overzicht opgenomen van de onderlinge verhoudingen van uitslagen van Legionella-testen [v.d. Kooij, 2001 c] in hetzelfde watermonster. De methoden blijken sterk verschillende uitkomsten op te leveren. Dit komt doordat bij sommige methoden zowel dode als levende legionellabacteriën worden gemeten. Bij de interpretatie van de testresultaten is het daarom belangrijk het werkingsprincipe van de toegepaste methode steeds te betrekken. 4

17 Figuur 1: Onderlinge verhoudingen van de uitslagen van verschillende Legionella bepalingsmethoden (indicatief) [Van der Kooij 2001 c] PCR: DNA, levende + dode Legionella DFA : levende + dode (intacte) Legionella FISH : levende Legionella, incl. VB N C 0, K w eekbare Legionella (actief) 0,0 500 Virulente Legionella (geen bepalingsmethode) Indicatie van de betekenis van de bepalingsmethoden In tabel 2 worden de methoden schematisch weergegeven. Uit dit overzicht blijkt dat methode 5 en 6 een overschatting geven van de aantallen, doordat ook dood materiaal wordt meegemeten. Met methode 4 is nog te weinig ervaring. Van de overblijvende methoden kent de kweekmethode het probleem van overgroeiing door andere organismen (dit onderzoek, zie hst 3). De Colony Blot methode is beter uitvoerbaar dan de kweekmethode, maar detecteert niet de VBNC Legionella. De FISH methode doet dit wel.vbnc kunnen weer tot leven verwekt worden na amoebenpassage, en vormen hierdoor een potentieel risico. Tabel 2: Overzicht detectiemethoden voor Legionella in oppervlaktewater De methoden zijn nader toegelicht in hoofdstuk 2.2 Naam Principe Dode bacteriën Actieve bacteriën VBNC In amoeben VBNC in vacuoles Losse VBNC Testtijd Detectielimiet in oppervlaktewater (kve/l) Beoordeling voor oppervlaktewater Kweekmethode Colony Blot methode groei op speciale voedingsbodem Kweekmethode + antilichamen Onderschatting één vacuole bevat veel Legionella, maar levert één kve! 5 7 dagen 3 5 dagen Problemen door overgroei kweekplaat (zonder door andere organismen. concentratiestap) 1000 Mogelijk goede test FISH methode RNA fluorescentie 30 uur? Virulentie van VBNC hangt af van amoebenpassage DFA methode Antilichamen? ook dode bacteriën, valspositieven minder bruikbaar PCR methode DNA vermenigvuldiging Alleen kwalitatief of semi-kwantitatief alleen ja/nee minder bruikbaar; mogelijk ook dode bacteriën Testkits Als DFA of PCR Meetuitslag vermoedelijk vergelijkbaar met DFA, resp. PCR methode 1 - enkele uren? Geen ervaring in Nederland 5

18 Voor het experimentele onderzoek is gekozen voor methode 1 en 3 (kweek en FISH), omdat daar de meeste ervaring mee was bij het waterleidingbedrijf WMO en omdat ten tijde van dit onderzoek de CB methode minder algemeen gangbaar was. De bepalingsmethoden worden nu nader toegelicht. 2.2 Beschrijving testmethoden De kweekmethode De meest gangbare methode om Legionella te bepalen is de kweekmethode volgens NEN Er vindt een concentratiestap plaats door filtratie over een polycarbonaatfilter (poriegrootte 0,2 m). Het afgefiltreerde residu, waarin de micro-organismen aanwezig zijn, wordt overgebracht in 5 ml van het oorspronkelijke water door middel van ultrasonore menging met glasparels. Van deze 5 ml worden kweken gemaakt (0,1 ml per kweek). Als substraat wordt BCYE (buffered charcoal yeast extract) gebruikt. Er worden kweken ingezet met antibiotica en na pasteurisatie. Doel hiervan is het doden van concurrerende microfauna; Legionella is bestand tegen de betreffende antibiotica en de pasteurisatie. Een positieve uitslag kan worden bevestigd door een verdachte kolonie opnieuw op kweek te zetten. Hierbij wordt gekweekt met en zonder cysteïne. Cysteïne is een exclusieve voedingsbodem voor de groei van Legionella. Een nadeel van de kweekmethode is de relatief lange incubatieperiode van 5 tot 7 dagen voordat de kolonies zichtbaar worden. De detectielimiet in relatief schoon water (drinkwater) is 50 kolonievormende eenheden (kve) per liter. Dit is zo laag doordat er opgeconcentreerd wordt via de filtratiestap, waarbij het volume wordt teruggebracht van 1000 ml water naar 5 ml. Van die 5 ml wordt 0,1 ml op kweek gezet. Stel dat er bij de kweek (afkomstig van 0,1 ml) één kolonie zich ontwikkelt, dan is het gehalte in de oorspronkelijke 5 ml 50 kve (kolonie vormende eenheden). Deze 50 kve zaten oorspronkelijk ook in het monster van 1 liter, zodat het Legionella getal 50 kve/l bedraagt. In een sterk vervuilde matrix (koelwater, oppervlaktewater) kan de filtratie niet goed worden uitgevoerd. Doordat er dan minder monster gefiltreerd kan worden, zal de detectiegrens stijgen. Als er bijvoorbeeld maar 500 ml of 250 ml monster kan worden gefiltreerd in plaats van de voorgeschreven 1000 ml, dan bedraagt de detectielimiet respectievelijk 100 of 200 kve/l. Een probleem is de bijgroei van andere micro-organismen (Coli s, Pseudomona e.d.), die veel sneller groeien dan de Legionella. Soms kan in verband met bijgroei beter worden uitgegaan van het oorspronkelijke monster. De detectiegrens ligt dan op kve/l. Immers, als één kolonie wordt gevonden in een kweek afkomstig van 0,1 ml van het oorspronkelijke monster, komt dit overeen met kve/l. Het is soms zelfs noodzakelijk uit te gaan van verdunningen. De detectiegrens neemt hierdoor evenredig toe. Als men bijvoorbeeld 10 x verdund, dan bedraagt de detectiegrens kve/l. Het is mogelijk om de diverse soorten en serogroepen Legionella te bepalen in de gekweekte en geïsoleerde legionellabacteriën. Dit gebeurt door agglutinatie (klontering) testen met antisera (vloeistoffen waarin anti stoffen - zgn. 6

19 antilichamen - zitten). Deze antilichamen reageren met de eiwitten (antigenen) van de Legionella. In het vooronderzoek is geen aandacht besteed aan een onderverdeling in soorten en serogroepen. Dit werd voor dit onderzoek in oppervlaktewater niet zo belangrijk gevonden. Daar waar Legionella van de ene soort worden aangetroffen, zullen andere soorten eveneens goed kunnen gedijen DFA methode (Direct Fluorescent Antibody) Na concentratie van de aanwezige bacteriën over een 0,45 m filter, worden de vrijgemaakte cellen behandeld met formaline (eindconcentratie 2 %) [Berbee 1999]. 20 ml van de oplossing wordt behandeld met antilichamen voor Legionella. Aan het antilichaam is voor de detectie een specifiek fluorescerende stof gebonden. Op deze wijze kunnen Legionella micadadei, pneumophila, bozemanii, longbeach serogroep 1 en 2, dumoffii, gormanii en jordanis worden bepaald. De DFA methode is niet volledig betrouwbaar: er kunnen valspositieven of valsnegatieven optreden [Palmer, 1993, Osha, 1993]. Storende reacties met ander celmateriaal en het niet kunnen maken van onderscheid tussen dood en levend zijn enkele nadelen van deze methode [KIWA 2001 a en b]. De DFA methode is het minst bewerkelijk in de uitvoering. Binnen 24 uur zijn de resultaten bekend FISH methode (Fluorescente In Situ Hybridisatie) Belangrijk voordeel van de FISH methode is dat al binnen 30 uur de uitslag bekend is. Bovendien heeft men met de FISH methode voor oppervlaktewater monsters geen last van filtratieproblemen en overgroei (er is geen kweekstap). Bij de FISH methode wordt Legionella gekleurd (fluorescerend gemaakt) en vervolgens microscopisch gedetecteerd en gekwantificeerd [Grimm,1998]. Dit gebeurt met een stukje fluorescerend RNA (genprobe) dat in de legionellabacteriën gebracht wordt. De genprobe is zeer specifiek en hecht (vrijwel) alleen aan Legionella species. De reagerende stof kan door celmembranen heendringen, waardoor Legionella ook in gastheer eencelligen zoals amoeben kunnen worden gedetecteerd. Dit is interessant, aangezien de voornaamste voortplantingsroute van Legionella via amoeben verloopt. Aangenomen wordt dat in cysten ( verdroogde vorm van amoeben waarin deze eencelligen onder extreme condities kunnen overleven) Legionella niet worden aangetoond, omdat de harde wand van deze cysten voor de genprobe ondoordringbaar is [In t Veld, 2000 a]. Een nadeel van de FISH bepaling is dat een gering volume (10 tot 50 l) wordt getest, dit is i.t.t. de kweekmethode. Inhomogeniteit van een monster kan daardoor gemakkelijker tot te hoge of te lage resultaten leiden [Worst, 2001]. Dit kan echter worden ondervangen door goede homogenisatie van het monster en/of door meerdere steekproeven per monster te onderzoeken. Met de FISH methode worden ook zogenaamde Viable But Non-Culturable Legionella (VBNC) gemeten (zie voor een korte uitleg over VBNC Legionella ) PCR methode (Polymerase Chain Reaction) Bij deze methode wordt genetisch materiaal (DNA) van legionellabacteriën uit monsters geïsoleerd en vermeerderd met de zogenaamde polymerase kettingreactie. Het verkregen genetische materiaal wordt geanalyseerd op specifiek Legionella genmateriaal. Detectie van de aanwezigheid van twee specifieke stukjes DNA is de basis van deze methode [Berbee 1999; KIWA

20 a en b]. Een van deze stukjes is specifiek voor Legionella pneumophila (macrofaag infectivity potentiator, mip). De testresultaten zijn semi-kwantitatief en detecteren Legionella of Legionella pneumophila. Dat gebeurt door vergelijking met een kleurvlekmethode. De uitslag van de test werd in het verleden uitgedrukt als > 1000 cellen/ml of 0 kve/ml ; met andere woorden wel aanwezig of niet aanwezig. De methode is goed uitvoerbaar en objectief [Palmer 1993]. Een nadeel is dat de test een kwalitatieve uitslag geeft. De test meet in principe DNA van levende Legionella bacteriën. Dood DNA wordt in de test door filtratie verwijderd. Hier wordt nog wel eens over getwijfeld. De afgelopen jaren is deze methode verbeterd, waardoor hij ook voor semikwantitatieve doeleinden kan worden gebruikt. De PCR methode kan ook worden toegepast voor genotypering van legionellabacteriën om na isolatie van Legionella met de kweekmethode de besmettingsbron op te sporen [KIWA, 2001 a]. De PCR methode wordt als veelbelovend gekenschetst. Naar verwachting zal de PCR methode in de toekomst een kansrijke methode worden. Op het gebied van DNA testen vinden de laatste jaren namelijk veel ontwikkelingen plaats. [Van der Kooij 2001 c] De Colony Blot methode KEMA [Jenner 2001] maakt gebruik van de zgn. Colony Blot-methode (ELISA- Systems Legionella, Riedel-de Haën) voor metingen in koelwatersystemen. Deze CB methode is ontwikkeld door het Institut für Medizinische Mikrobiologie der Medizinischen Hochschule te Hannover. De methode is min of meer op te vatten als een variant op de kweekmethode. De detectie vindt plaats door moleculaire technieken. De methode omvat een filtratiestap, een kweekstap en een detectie met voor Legionella specifieke antilichamen. De kweekstap is van grote betekenis voor de selectie van kweekbare en dus virulente Legionella. De CB wordt bij oppervlaktewatermonsters veel minder gestoord door concurrerende microflora [Worst, 2001]. In Duitsland zijn positieve ervaringen met de methode opgedaan [Obst, 1996]. De methode is uitvoerig getest in een ringonderzoek in Duitsland. In Nederland wordt de methode toegepast door KEMA in oppervlaktewater en men vindt dan gehalten van 1000 kve/l [Worst, 2001]. De uitkomsten zijn vergeleken met die van de kweekmethode en komen goed overeen [Jenner 2001] Snelle testen [KIWA, 2001 a] maakt melding van een tweetal snelle testen (testkits): de MicroDetect Legionella-test van IQ Products die werkt volgens de PCRmethode en de Equate Legionella Water Test Kit van Binax, die werkt met enzymkoppeling aan het antilichaam van Lp serogroep 1. MicroDetect geeft binnen enkele uren al een resultaat, Equate al binnen 45 minuten. In Nederland is hiermee nog niet veel ervaring opgedaan. 8

21 3 Resultaten en evaluatie 3.1 Resultaten In de zomer en herfst van 2000 zijn op locaties in Maas en Rijn (Eijsden, Lobith en Keizersveer) monsters onderzocht op Legionella. Het microbiologische onderzoek is uitgevoerd door het laboratorium van de Waterleiding Maatschappij Overijssel (WMO) te Zwolle. Gemeten is met de standaard kweekmethode [NEN 6265] en de Fluorescente in Situ Hybridisatie methode (FISH). Op twee van de monsters zijn ook opwekkingstests uitgevoerd met amoebenpassage aan de universiteit van Würzburg. Hierbij worden slapende vormen van Legionella geactiveerd (zie hoofdstuk 2.1.2). In tabel 3 zijn de resultaten weergegeven. De resultaten zijn ontleend aan het analyserapport van WMO [In t Veld, 2000 b]. Tabel 3: Resultaten: aantallen Legionella per liter in oppervlaktewatermonsters Eijsden Lobith Keizersveer Zomer 2000 (eind juni/begin augustus) Kweekmethode Met concentratiestap (filtratie) overgroeid overgroeid overgroeid Monster als zodanig <1, <1, <1, FISH methode Met concentratiestap (filtratie) niet bepaald niet bepaald <1, Monster als zodanig 3, , niet bepaald Herfst 2000 (medio oktober) FISH methode Monster als zodanig niet bepaald 3.2 De kweekmethode Beschrijving Het gehalte aan zwevend stof leidde tot problemen. De filtratie ging minder goed, waardoor de hoeveelheid monster die in bewerking kon worden genomen beperkt was. Van alle drie monsters kon hierdoor maximaal 250 ml gefiltreerd worden. Alle platen van de gefiltreerde monsters waren compleet overgroeid. Door voorfiltratie met een grof filter konden de begeleidende flora niet worden weggevangen. Verdergaande voorfiltratie had geen zin omdat de kans dan zeer groot was dat Legionella ook zou worden verwijderd. Daarom is zonder concentratiestap rechtstreeks (dus ongefiltreerd) 0,1 ml op kweek gezet. Zowel de gefiltreerde als de ongefiltreerde monsters zijn voor en na pasteurisatie onderzocht. Doel van de pasteurisatie is het afdoden van storende microflora; Legionella zijn bestand tegen pasteurisatie Evaluatie In de ongefiltreerde monsters werden met de kweekmethode géén Legionella aangetroffen. De detectiegrens in het oorspronkelijke monster bedraagt echter < kve/l. Het KIWA [Jenner 2001] heeft vergelijkbare ervaringen met de toepassing van de kweekmethode voor oppervlaktewatermonsters (overgroeien van gefiltreerde monsters en te hoge detectielimieten in ongefiltreerde monsters). De conclusie is, dat de kweekmethode niet geschikt is voor de bepaling van Legionella in oppervlaktewater. 9

22 3.3 De FISH methode Beschrijving Bij de FISH methode zijn de monsters zonder voorafgaande pasteurisatie onderzocht. Voor Eijsden en Lobith kon vanwege de hoge concentratie Legionella het monstermateriaal rechtstreeks uit de fles worden gebruikt. Vanuit het monster is rechtstreeks 10 µl, 25 µl en 50 µl beoordeeld. Van het monster van Keizersveer kon het gefiltreerde monster worden beoordeeld. Van het gefiltreerde monster is 10 µl onderzocht. De FISH methode gaf wel resultaten boven de detectiegrens. Met behulp van deze methode konden bij Eijsden en Lobith Legionella gehalten worden aangetoond in ordegrootte van 10 5 kve/l. In de zomer (eind juli/begin augustus) waren de gehalten ongeveer 2 keer zo hoog als in de herfst (medio oktober). Hierbij moet worden opgemerkt dat het hier slechts een beperkt aantal monsters betreft. De aangetroffen Legionella bevinden zich in vrij zwemmende vorm, dus niet in amoeben. Dit is geconstateerd bij de microscopische determinatie. In het monster van Keizersveer werden geen legionellabacteriën aangetroffen Evaluatie Met de FISH methode zijn op twee locaties in Rijn en Maas hoge concentraties Legionella aangetroffen: tot kve/l. [Grimm 2000] heeft vergelijkbare resultaten in oppervlaktewater in Duitsland aangetroffen, eveneens met de FISH methode. Deze concentraties zijn dusdanig hoog dat, indien de Legionella bacteriën kweekbaar zouden zijn, deze zeker met de standaard kweekmethode waren gevonden in de ongefiltreerde monsters. De meest voor de hand liggende conclusie is dat we hier te maken hebben met levensvatbare maar niet kweekbare Legionella bacteriën (Viable But Non- Culturable (VBNC)). Een andere mogelijkheid is dat de specifieke genprobe die is gebruikt ook aan een andere bacteriesoort kan hechten. Dit is echter niet waarschijnlijk. De morfologische kenmerken die bij het microscopisch onderzoek zijn waargenomen, zijn namelijk zeer specifiek voor Legionella. De FISH methode is goed toepasbaar voor oppervlaktewater. Nadeel is dat de uitkomst niet direct te relateren is met kweekbare Legionella. 3.4 Opwekken van Legionella uit VBNC Legionella [Steinert 1997] van de Universiteit van Würzburg heeft aangetoond dat VBNC Legionella via passage in een amoebe, Acanthamoeba castellanii, kunnen leiden tot kweekbare Legionella met de oorspronkelijke virulentie. Met monsters van Maas en Rijn (herfst 2000, Eijsden en Lobith) is geprobeerd om VBNC Legionella via amoeben op te kweken. Dit is gebeurd in een kort onderzoek door de Universiteit van Würzburg. Helaas zijn deze experimenten met de amoeben mislukt. 3.5 Evaluatie van de resultaten van het oriënterend onderzoek Oppervlaktewater blijkt aantoonbare gehalten aan Legionella te bevatten: 1000 kve/l volgens de CB methode [Worst, 2001] en tot kve/l volgens dit onderzoek met de FISH methode, dus inclusief VBNC Legionella). Op basis van elders verricht onderzoek [Steinert 1997] kan de conclusie worden getrokken dat VBNC-Legionella een potentiële bron van besmetting in oppervlaktewater zal kunnen zijn. Dit betekent dat de VBNC 10

23 vorm van de Legionella zich kan vermeerderen in de koelsystemen als de omstandigheden daarin gunstig zijn. Nu er vaker gemeten wordt, treft men Legionella ook af en toe aan in verhoogde gehaltes in koeltorens bij de industrie [Schotel 2000]. Het ingetrokken oppervlaktewater kan dus een duidelijke bron zijn. Maar ook op andere manieren kan besmetting van het koeltorensysteem optreden, wellicht via de lucht. Dat dit soort systemen een gezondheidsrisico kunnen vormen, blijkt wel uit bestudeerde besmettingsgevallen, ook op grotere afstanden van een koeltoren. Een praktisch probleem is dat er geen kwantitatieve relatie bekend is tussen gemeten gehalten in koelwater en gezondheidsrisico s. [KIWA 2001 a] beveelt daarom aan hier onderzoek naar te doen. Het is duidelijk dat er soms maatregelen noodzakelijk zijn om de gezondheidsrisico s zo veel mogelijk uit te sluiten. Dit betekent in de huidige situatie dat in een aantal gevallen de industrie meer biociden zal gaan toepassen. Het gebruik van meer chloor of andere biociden in koelwater leidt tot verhoogde emissies van deze stoffen naar het oppervlaktewater. Dit is in principe niet gewenst. De afgelopen jaren is juist gestreefd naar een optimalisatie (= minimalisatie) van het biociden verbruik, in verband met de hoge toxiciteit van de biociden en de grote omvang van deze toepassing [Ministerie VROM, 1994]. De bekende maatregelen voor beheersing van de generieke bacteriegroei in circulatiekoelsystemen zullen ook effectief zijn voor beperking van de groei van Legionellabacteriën. Hierbij moet worden gedacht aan beperking van het intrekken van zwevend stof, voorkomen van dode einden in de koelsystemen, het handhaven van voldoende doorstroomsnelheid daarin, het voorkomen van proceslekkages etcetera. Een overzicht van dergelijke maatregelen is terug te vinden in een rapport van de KEMA [Van Donk et al, 1996]. Met betrekking tot de specifieke groei van Legionella is nader inzicht gewenst in de fundamentele relatie tussen biofilmvorming en legionellagroei [Jenner, 2001; van der Kooij, 2001a]. Tevens is meer inzicht gewenst in de effectiviteit van allerlei biociden voor legionellabestrijding [KIWA, 2001a]. Soms zal voor legionellabestrijding een hogere dosering van biociden noodzakelijk zijn. Dit kan leiden tot verhoogde gehalten van biociden in de spui van de koelsystemen. De waterkwaliteitsbeheerder zal in het kader van de Wvo-vergunning dan moeten oordelen onder welke voorwaarden dit kan worden toegestaan. Gelet op de hoge toxiciteit van de gebruikte biociden voor aquatische organismen [Baltus, 1999], is het in zijn algemeenheid raadzaam om de biociden te neutraliseren (ontgiften met bijv. bisulfiet), alvorens tot lozing over te gaan. Dit geldt zeer zeker wanneer er zeer hoge legionellagehalten in de koelsystemen worden aangetroffen die een bestrijding met hoge doseringen van biociden vragen. Naar de verschillende neutralisatiemogelijkheden van het koelwater wordt op dit moment onderzoek door het RIZA verricht. 11

24 12

25 4 Conclusies Uit dit oriënterende onderzoek blijkt dat er legionellabacteriën in het oppervlaktewater aanwezig zijn. Dit is aangetoond met de FISH-methode. In een beperkt aantal water monsters zijn gehalten aangetoond van tot kve/l. Het betrof hier vermoedelijk zogenaamde VBNC Legionella. De in Nederland gebruikelijke kweekmethode voor Legionella bleek in verband met bijgroei door andere bacteriën niet bruikbaar te zijn. De FISH-methode meet ook VBNC Legionella die, naar men aanneemt, Pontiac fever kunnen veroorzaken. Uit VBNC Legionella kan door vermenigvuldiging in bijvoorbeeld amoeben weer kweekbare Legionella (veteranenziekte) gevormd worden. Hieronder kunnen zich weer ziekteverwekkende bacteriën bevinden. Gezien de meetproblematiek is er behoefte aan parallel onderzoek waarin de verschillende methoden naast elkaar worden getest. Dergelijk onderzoek gaat zeer veel tijd vragen en het RIZA zal dit om die reden niet doen. Dergelijk onderzoek kan beter in breder verband worden opgepakt waar sprake is van een bredere spin-off (drinkwatersector). Ook zou dit onderzoek van waarde zijn binnen een integrale aanpak van de Legionella problematiek van koeltorens door bijv. het bedrijfsleven. Daarmee wordt bedoeld het in kaart brengen van de hele keten: Legionella in het ingenomen oppervlaktewater, vermenigvuldiging in de koelsystemen, bestrijding en risico s voor de leefomgeving. Bij interpretatie van Legionella koloniecijfers is het belangrijk altijd de beperkingen ten gevolge van de bepalingsmethode erbij te betrekken. Meting met verschillende methoden leiden tot sterk uiteenlopende resultaten. Voor beperking van bacteriegroei in circulatiekoelsystemen, waaronder Legionella, zullen technische beheersingsprogramma s voor beperking van biofilmvorming de belangrijkste insteek dienen te zijn [Van Donk, 1996]. Als er in verband met legionellagroei toch verhoogde gehalten aan biociden noodzakelijk zijn kan dit leiden tot de lozing van biociden via de spui van de koelsystemen. De waterbeheerder zal dan moeten beoordelen onder welke voorwaarden deze extra lozing kan worden toegestaan. Soms zal het noodzakelijk zijn om het spuiwater te ontgiften alvorens tot lozing kan worden overgegaan [zie ook Baltus, 1999]. Op dit moment wordt in opdracht van het RIZA onderzoek verricht naar de verschillende neutralisatiemogelijkheden voor biocidehoudende stromen. 13

26 14

27 5 Referenties Baltus, C.A.M., Kerkum, L.C.M., Kienhuis, P.G.M. juni 1999, Acute toxiciteit van koelwaterlozingen uit recirculatiekoelsystemen, RIZA rapportnr , Lelystad,. Berbee, R.P.M Legionella in oppervlaktewater, in koelwater, in RWZI s, etc, RIZA nota nr , Lelystad. Berk, S.G Production of Respirable vesicles Containing Live Legionella pneumophila Cells by two Acanthamoeba spp., p , Applied and environmental Microbiology. Donk, M. van, Jenner, H.A., 28 mei, 1996 Optimisation of biofouling control in industrial cooling water systems with respect to the environment KEMA rapport nr KES/WBR , Arnhem. Fliermans, C.B Ecology of Legionella: From Data to Knowledge with a Little Wisdom, p Microbial Ecology. Grimm, D.; Merkert, H.; Ludwig, W.; Schleifer, K.H.; Hacker, J.; Brand, B.C.; 1998 Specific detection of Legionella Pneumophila: construction of a new 16S rrna-targeted Oligonucleotide probe, p ; Applied and Environmental Microbiology. Grimm, D; Univ. Würzburg; 2000: bericht aan In t Veld (WMO). Hussong, D; Colweli, R.R.; O Brien, M.; Weiss, E.; Pearson, A.D.; Weiner, R.M.; Burge, W.D.; 1987 Viable Legionella pneumophila not detectable by culture agar media, Biotechnology Volume 5; September In t Veld, S. (WMO); 2000 a: bespreking met RIZA d.d. 31 mei In t Veld, S.(WMO); 2000 b: Notitie bij analyseresultaten Legionellaonderzoek 36608/EM Jenner, H.; Veldhuis, L.; (Kema); 2001: bericht KIWA 2001 a: Omvang en preventie van vermeerdering van Legionella in koeltorens en luchtbehandelingsapparatuur, (Onderzoek in opdracht van de Ministeries Sociale Zaken en Werkgelegenheid, VROM en Welzijn en Sport). KIWA 2001 b: Risico s van blootsteling aan Legionella en darmpathogenen op rwzi s, Concept rapport, in samenwerking met STOWA. Kool, J.L. (RIVM); 2000: telefonische communicatie. Kooij, D. v.d.; 2001 a: KIWA, LUW Microbiologie; interview met RIZA d.d. 31 mei Kooij, D.v.d.; 2001 b: Presentatie op de Workshop Legionella, 20 juni Kooij, D.v.d.; 2001 c: Presentatie op de Workshop Legionella, 24 september Ministerie van VROM, 31 maart 1994 Meerjarenplan Hygiëne en Materiaalbescherming (MJP-H), Directoraat Generaal Milieubeheer. Obst, U. et al Colony Blot-Methode zum Nachweis von Legionelle - Ergebnisse einer Vergleichungsuntersuchung, Zeitblatt Hygiene 199, p. OSHA: 1993: Legionnaires Disease, Technical Manual Section III chapter 7. Palmer, C.J.; Yu-Li Tsai; Paszko-Kolva, C; Mayer, C; Sangermano, R.; 1993 Detection of Legionella species in sewage an ocean water by polymerase chain reaction, direct fluorescent antibody, and plate culture methods, Applied and Environmental Microbiology, p Paszko-Kolva, C., M. Shahamat, and R.R. Colwell Long term survival of Legionella pneumophila serogroup 1 under low nutrient 15

28 conditions and associated morphological changes. FEMS Microbial. Ecol.102: Paszko-Kolva, C.; Thio, C.; Yamashiro, C.T.; Danielson, R.; 1995 Advantages of the polymerase chain reaction for the rapid detection of Legionella species during outbreak investigations, Microbiology Europe, Volume 3, no. 1. Schotel, 2000, (Steunpunt Emissies RIZA) interne RIZA informatie Steinert, M.; Emödy, L.; Amann, R.; Hacker, J.; Resuscitation of viable but nonculturable pneumophila JR32 by Acanthamoeba castellanii, Applied and Environmental Microbiology, p Warnet, W; 2000 (RIVM) telefonische communicatie. Worst, D.J (Omegam) informatie verstrekt door Omegam 4 april