DETECTIE VAN SALMONELLA SPP. MET PCR DÉTECTION DES SALMONELLA SPP. SUIVANT LA MÉTHODE PCR

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1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen FLVVM Agence fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire LFSAGx I-MET MIC 036d-039 DETECTIE VAN SALMONELLA SPP. MET PCR DÉTECTION DES SALMONELLA SPP. SUIVANT LA MÉTHODE PCR Versie 03 Version 03 Datum van Date d application toepassing Opgesteld door : Rédaction par : Nazicht door : Révision par : Goedkeuring vrijgave door : Autorisation de publication par: E. Harnie sectieverantwoordelijke biologische analyses FLVVM; A.Dubois, responsable qualité LFSAGx; MC Wilem, responsable de la section microbiologie LFSAGx; Beheer & locatie geldende versie : Gestion et localisation de la version valide : N:\QAM-EMAS-OHSAS\Microbiologie\I-MET Bestemmelingen : Destinataires : Sectie biologische analyses: microbiologie Section microbiologie Trefwoorden : Mots clés Detectie Salmonella spp, PCR Détection Salmonella spp, PCR LAB I-MET MIC 036d-039 v.03 1/10

2 DÉTECTION DES SALMONELLA SPP. SUIVANT LA MÉTHODE PCR OVERZICHT WIJZIGINGEN APERCU DES REVISIONS (*) Herziening door/datum - Révision par/date* Reden van herziening - Motif de la révision SV 09/06/2010 Wijziging van de productnamen,, layout Tekstdeel / draagwijdte van de herziening - Partie de texte / portée de la révision MCW 01/11/2010 EH 11/10/2011 TVDS MCW Références documents 13 Duidelijker schema + toevoegen opmerking Nieuwe layout Nouveau mode d élimination des déchets Modification réf. documents Bijlage NL 7 13 * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. * L écart entre la date actuelle et la date de la dernière révision ne peut pas dépasser 5 ans. LAB I-MET MIC 036d-039 v.03 2/10

3 DÉTECTION DES SALMONELLA SPP. SUIVANT LA MÉTHODE PCR INHOUDSTABEL - TABLE DES MATIÈRES 1 DOEL OBJECTIF TOEPASSINGSGEBIED DOMAINE D APPLICATION WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DOCUMENTS LÉGAUX ET NORMATIFS DEFINITIES EN AFKORTINGEN DEFINITIONS ET ABREVIATIONS PRINCIPE PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN INDICATEURS DE PRESTATION VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN CONSIGNES DE SÉCURITÉ ET MESURES SPÉCIFIQUES CULTUURMEDIA MILIEUX DE CULTURE TOESTELLEN EQUIPEMENT WERKWIJZE MÉTHODE DE TRAVAIL KWALITEITSCONTROLE CONTRÔLE QUALITÉ BEREKENING EN RAPPORTERING CALCUL ET RAPPORTAGE BEREKENINGSWIJZE VAN DE RESULTATEN CALCUL DES RÉSULTATS UITDRUKKINGSWIJZE VAN DE RESULTATEN EXPRESSION DES RÉSULTATS VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURE, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN RÉFÉRENCE AUX PROCÉDURES, INSTRUCTIONS, DOCUMENTS, FORMULAIRES OU LISTES Y AFFÉRENTS PROCEDURES - PROCÉDURES INSTRUCTIES - INSTRUCTIONS FORMULIEREN - FORMULAIRES DOCUMENTEN - DOCUMENTS BIJLAGEN ANNEXES... 8 LAB I-MET MIC 036d-039 v.03 3/10

4 1 Doel Objectif Dit werkvoorschrift beschrijft een horizontale methode voor de detectie van Salmonella spp. met de PCR-methode. De beschreven methode is van toepassing op : - Voedingswaren - Dierenvoeders - Swabs afkomstig van karkassen. 2 Toepassingsgebied Domaine d application Cette instruction décrit une méthode pour la détection des Salmonella spp. selon la méthode PCR. La méthode décrite est applicable aux : - Produits destinés à la consommation humaine - Produits destinés à l alimentation animale - Prélèvements de carcasses par écouvillonnage 3 Wettelijke en normatieve documenten Documents légaux et normatifs Detectie volgens het AFNOR gevalideerde iq-check Salmonella II protocol (BRD 07/06 07/04). De bevestiging is conform de ISO norm 6579 : 2002 Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the detection of Salmonella spp. 4 Definities en afkortingen Définitions et abréviations Salmonella spp. : Micro-organismen die typische of minder typische kolonies vormen op selectieve vaste media en de beschreven biochemische en serologische karakteristieken bezitten bij het uitvoeren van dit werkvoorschrift. Cette instruction est conforme au protocole validé AFNOR iq- Check Salmonella II (BRD 07/06 07/04). La confirmation est conforme à la norme ISO 6579 : 2002 Microbiologie des aliments - Méthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp. Salmonella spp.: Micro-organismes formant des colonies typiques ou moins typiques sur des milieux sélectifs solides et possédant les caractéristiques biochimiques et sérologiques décrites lorsque l essai est effectué conformément à cette instruction. Detectie van Salmonella spp. : Bepaling van de aan- of afwezigheid van Salmonella spp. in een welbepaalde hoeveelheid monster bij het uitvoeren van dit werkvoorschrift. PCR: Polymerase Chain Reaction Recherche de Salmonella spp. : Détermination de la présence ou de l absence de Salmonella spp., dans une quantité déterminée de produit, lorsque l essai est exécuté conformément à cette instruction. PCR: Polymerase Chain Reaction LAB I-MET MIC 036d-039 v.03 4/10

5 RVS: Rappaport Vassiliadis broth met soja MKTTn: Muller-Kauffman tetrathionate/novobiocin broth XLD: Xylose Lysine Deoxycholaat BPW : gebufferd peptoonwater RVS: Rappaport Vassiliadis avec soja MKTTn: Muller-Kauffman au tetrathionate-novobiocine XLD: Xylose Lysine Deoxycholate EPT : Eau peptonée tamponnée 5 Principe Principe De detectie van Salmonella spp. bestaat uit de volgende stappen: - Vooraanrijking in BPW - DNA extractie - Uitvoeren van PCR - Bevestiging van positieve stalen: - Aanrijking in MKTTn en RVS - Isolatie op de selectieve media XLD en Brilliance Salmonella - Bevestiging van verdachte kolonies via biochemische en serologische testen. 6 Prestatiekenmerken Indicateurs de prestation Detectielimiet: 10 cfu/25g (of ml). Voor details omtrent de berekeningen van de prestatiekenmerken: zie validatiedossier. La recherche de Salmonella spp. nécessite les étapes suivantes : - Pré-enrichissement dans de l eau peptonée tamponnée - Extraction de l ADN - Réalisation de la PCR - Confirmation des résultats positifs: - Enrichissement dans les milieux MKTTn et RVS - Isolement sur milieux sélectifs XLD et Brilliance Salmonella - Confirmation des colonies suspectes par tests biochimiques et sérologiques. Limite de détection : 5 ufc/25g (ou ml). Pour les détails, voir le dossier de validation. 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen Consignes de sécurité et mesures spécifiques Al het gebruikte materiaal en geënte media moeten verzameld worden in de gele containers voor selectieve ophaling. Werk steeds onder de laminaire flow. Tout le matériel ayant servi à la manipulation, les cultures positives et les échantillons positifs sont autoclavés avant leur élimination dans le container à déchets placés dans les containers jaunes pour collecte sélective. LAB I-MET MIC 036d-039 v.03 5/10

6 - BPW - IQ CHECK Salmonella II kit - RVS - MKTTn - XLD - Brilliance Salmonella - Nutriënt-agar - Salmonella Latex testkit - Salmonella Omni O - API 20E - API 20E reagentia Algemene apparatuur van het labo. Thermocycler. Zie bijlage schema. Zie LAB 24 P 005 Kwaliteitscontrole. Niet van toepassing. 8 Cultuurmedia Milieux de culture 9 Toestellen Equipement 10 Werkwijze Méthode de travail - Eau peptonée tamponnée - Kit iq Check Salmonella II - Bouillon RVS - Bouillon MKTTn - Gélose XLD - Gélose Brilliance Salmonella - Nutrient Agar - Test d agglutination - Galeries api 20E - Réactifs API 20E Matériel courant de laboratoire Thermocycler Voir le schéma en annexe. 11 Kwaliteitscontrole Contrôle qualité 12 Berekening en rapportering Calcul et rapportage 12.1 Berekeningswijze van de resultaten Calcul des résultats Voir instruction «Contrôles qualité en microbiologie internes». Pas d application. LAB I-MET MIC 036d-039 v.03 6/10

7 12.2 Uitdrukkingswijze van de resultaten Expression des résultats Volgens de interpretatie van de resultaten, noteer de aan- of afwezigheid van Salmonella spp. in x g of ml of op x cm 2 monster. Noteer in geval van een positief resultaat het resultaat van de serotypering. Selon l interprétation des résultats, indiquer la présence ou l absence de Salmonella spp. dans une prise d essai de x g ou ml ou sur x cm² de produit. En cas de présence, indiquer le résultat du sérotypage et en cas d application les résultats du phagetype. 13 Verwijzing naar bijhorende procedure, instructies, documenten, formulieren of lijsten Référence aux procédures, instructions, documents, formulaires ou listes y afférents 13.1 Procedures - Procédures - LAB 24 P 005 Kwaliteitscontrole 13.2 Instructies - Instructions - LAB 24 P 007 Algemene handleiding Microbiologie - «Préparation des échantillons, de la suspension mère et - LAB 24 P 007 I 002 Voorbereiding van monsters en aanmaken van des dilutions décimales suivantes en vue de l examen verdunningen voor microbiologisch onderzoek microbiologique» (LAB-21-I-MIC-001) - «Contrôles qualité en microbiologie internes» (LAB-21-I- QUAL-001-CQI) 13.3 Formulieren - Formulaires - LAB 24 I-MET 039 F 351 Werkblad PCR plaat (Salmonella spp.). - «Cahier des prélèvements» (LAB-21-F-MIC-001) - LAB 24 I-MET 039 F 349 Werkblad (1) Detectie van Salmonella spp. - «Recherche des Salmonelles suivant la méthode PCR» (PCR methode) (LAB-21-F-MIC-36bd #1) - LAB 24 I-MET 039 F 350 Werkblad (2) Detectie van Salmonella spp. - «Confirmation Salmonella PCR» (LAB-21-F-MIC-36bd #2) (PCR methode) - «Confirmation de la présence de Salmonella spp.» (LAB- 21-F-MIC-36-2) 13.4 Documenten - Documents Document : LAB-21-D-MIC-36d LAB I-MET MIC 036d-039 v.03 7/10

8 Schema werkwijze. 14 Bijlagen Annexes Schéma du mode opératoire. LAB I-MET MIC 036d-039 v.03 8/10

9 Bijlage : Schema werkwijze Detectie van Salmonella spp. (PCR methode) Monstername x g of ml + 9x ml BPW * Incubatie 21±1h; 37±1ºC 100 µl µl lyse reagens Voorzie een blanco staal (100 µl steriel water) Vortex Incubeer 10 min bij C Vortex Centrifugeer 2 bij rpm *** 45 µl PCR mix per well ** + 5 µl supernatans Sluit de wells af Centrifugeer 1 min bij 4000 rpm Screening met PCR *** 0.1ml cultuur + 10ml RVS broth Incubatie 24±3h; 41.5±1ºC 1ml cultuur + 10ml MKTTn broth Incubatie 24±3h; 37±1ºC XLD Incubatie 24±3h; 37±1ºC Brilliance Salmonella Incubatie 24±3h; 37±1ºC XLD Incubatie 24±3h; 37±1ºC Brilliance Salmonella Incubatie 24±3h; 37±1ºC **** Als API 20E en de agglutinatietest positief is Nutriënt-agar Incubatie 24±2h; 37±1ºC API 20E Incubatie 18±3h; 37±1ºC Agglutinatietesten Bepalen van het serotype en indien van toepassing faagtypering en bepaling van antibioticaresistentie bij het W.I.V. * Voor swabs : + 100ml BPW ** Voorbereiding PCR mix: reagens C (amplificatiemix) + reagens B (fluorescente probes). Aan te maken in functie van het aantal stalen en controles (1 positieve controle en 1 negatieve controle per reeks) *** Indien PCR positief **** 1 typische kolonie van één medium en als deze niet bevestigd wordt, 4 bijkomende kolonies bevestigen Opmerking : Voor meer details in verband met de uitvoering zie LAB 24 P 007 Algemene handleiding microbiologie LAB I-MET MIC 036d-039 v.03 9/10

10 PCR DETECTIE VAN SALMONELLA SPP. MET PCR Annexe : Schéma d analyse Détection des Salmonella spp. (méthode PCR) Prise d essai Prise d essai x g ou ml + 9x ml d eau peptonée tamponnée * Incubation 21±1h; 37±1 C Extraction de l ADN *** 100 μl μl de réactif de lyse Prévoir un éch. blanco (100 μl d eau stérile) Vortexer Incubation 10 min.à C Vortexer Centrifuger 2 à rpm 45 μl de Mix PCR par puits ** + 5 μl du surnageant Sceller les puits Screening par PCR *** Isolement Enrichissement 0,1ml de culture + 10ml de bouillon RVS Incubation 24 ±3h; 41,5±1 C XLD Incubation 24 ±3h; 37 ±1 C Brilliance Salmonella Incubation 24 ±3h; 37 ±1 C 1ml de culture + 10ml de bouillon MKTTn Incubation 24 ±3h; 37±1 C XLD Incubation 24 ±3h; 37 ±1 C Brilliance Salmonella Incubation 24 ±3h; 37 ±1 C Si galerie API 20E et tests d agglutination positifs **** Nutrient agar Incubation 24 ±2h; 37 ±1 C Confirmation Galerie API 20E Incubation 18 ±3h; 37 ±1 C Tests d agglutination Détermination du sérotype et si d application du phagetype et de l antibiorésistance à l ISP * Pour les swabs : ml d eau peptonée tamponnée ** Préparation du Mix PCR : réactif C (solution d amplification) + réactif B (sondes fluorescentes). À préparer en fonction du nombre d échantillons à analyser et des contrôles à effectuer (1 contrôle positif et 1 contrôle négatif par série) *** Si PCR positive **** 1 colonie typique d un des milieux et si celle-ci n est pas confirmée, confirmation sur 4 colonies supplémentaires LAB I-MET MIC 036d-039 v.03 10/10