Over huidige flowcytometers en nieuwe software. Vincent H.J. van der Velden Afdeling Immunologie, Erasmus MC, Rotterdam

Transcriptie

1 Over huidige flowcytometers en nieuwe software Vincent H.J. van der Velden Afdeling Immunologie, rasmus M, otterdam SKML, Woerden 30 oktober 2008

2 Multicolor flowcytometry Tot voor kort: 4 kleuren flow cytometrie Sinds enige jaren: nieuwe flowcytometers 3-4 lasers 6-17 kleuren Digitale electronica Waarom 6 kleuren analyses? Waar moet je op letten? Wat zijn de valkuilen? Wat verandert er in de analyse? Department of Immunology, rasmus M

3 Waarom multicolor flowcytometry? Minder buizen nodig Minder reagentia Sneller (inzettijd en meettijd) Meer informatie per buis (1x 6 kleuren = 15x 2 kleuren) Betere karakterisatie van (sub)populaties Betere analyse van differentiatie routes fficiënter gebruik van monsters met een klein volume (zoals SF, FNA) Department of Immunology, rasmus M

4 Waar moet je op letten? Welke fluorochromen? Instrument set-up: PMT instellingen ompensatie Samenstellen van antistofpanels Department of Immunology, rasmus M

5 Waar moet je op letten? Welke fluorochromen? Instrument set-up: PMT instellingen ompensatie Samenstellen van antistofpanels Department of Immunology, rasmus M

6 Fluorochromen xcitatie 488 nm missie (nm) FIT 518 Alexa Fluor P 575 P-Texas ed 615 P-Alexa Fluor P-y5 670 P-y PerP-y P-y7 760 n nog veel meer xcitatie 633 nm missie (nm) AP 660 Alexa Fluor y5 670 AP-y Alexa Fluor AP-y7 785 AP-H7 785 xcitatie 405 nm missie (nm) Alexa Fluor Pacific Blue 455 Amyan 491 Alexa Fluor Pacific Orange 551 Department of Immunology, rasmus M

7 Fluorochromen r is veel keus! Keuze o.a. afhankelijk van Type apparaat (lichtbron en optiek) Intensiteit fluorochroom PerP FIT << PerP-y5.5 AP-y7 < P P-y7< AP = P-y5 Nieuwe fluorochromen vaak zwak D56-AP D56-A700 Department of Immunology, rasmus M

8 Fluorochromen Valkuilen: Achtergrondkleuring (AP-y7 relatief plakkerig ) Achtergrondkleuring P-y7 (BD>oulter) Instabiliteit tandemfluorochromen o.i.v. licht (AP-y7 AP-H7) D19-P-y7 BD D19-P7 oulter Data verkregen van Juan Flores, Salamanca

9 Waar moet je op letten? Welke fluorochromen? Instrument set-up: PMT instellingen ompensatie Samenstellen van antistofpanels Department of Immunology, rasmus M

10 Waar moet je op letten? MFI beads PB: FIXD PB: ST Automatische correctie door gebruik S&T beads (ytometer Setup and Tracking; BD) Verloop in violette laser P: FIXD P: ST P-y7: FIXD P-y7: ST 0 dagen Department of Immunology, rasmus M

11 ompensation 4-color elatief eenvoudig FIT P PerP AP FIT P 0, PerP AP 0 0 3,5 Department of Immunology, rasmus M

12 ompensation 8-color omplex! 23,12 0,02 0 0,07 0,33 1,68 12,3 Amyan 23,93 0,08 0 0,01 0,05 0,01 0,26 PB 0,01 0,01 31,68 0, ,01 A-680 0,07 0,08 1 0,77 4,97 0,04 0,08 AP 0,06 0 0,04 0,07 4,72 1 0,31 P-y7 0, ,42 0 0,01 PerP 0,22 0 0,03 0,02 2,06 27,39 1,45 P 6,83 0 0,04 0,01 0,29 3,05 15,4 FIT Amyan PB A-680 AP P-y7 PerP P FIT Department of Immunology, rasmus M

13 ompensatie instellen Instellen van de flowcytometer: Stel de PMT voltages in met ongekleurde cellen Stel de compensatie in met enkelvoudig-gekleurde cellen of ompbeads ellen: positieve en negatieve cellen nodig; autofluorescentie van beide populaties moet gelijk zijn BD TM Anti-mouse/at IgG ompbeads: toepasbaar voor elke antistof Software stelt automatisch de compensatie matrix samen Stel voor iedere antistof met tandem fluorochromen de compensatie apart in (lot-verschillen) Department of Immunology, rasmus M

14 ompensatie, digitale data en data spreiding nkelvoudige kleuring met D4-PerP-y5.5 ongecompenseerd gecompenseerd Digitale data processing data spreiding Department of Immunology, rasmus M

15 Data spreiding Spectrale overlap in: P-y7 AP AP-y7 Antistof/fluorochroom: D4 PerP-y5.5 D4 P 1. Fluorochroom afhankelijk (algemeen: hogere λ, meer spread) 2. De resolutie is afhankelijk van zowel de achtergrond als de data spread van de negatieve populatie Department of Immunology, rasmus M

16 ffect 10% verandering in PMT Amyan Spectrale overlap van D45-Amyan in FIT kanaal, gecompenseerd Originele MFI waarde D45-10 % MFI waarde D45 Data verkregen van Tomas Kalina, Praag

17 ffect 10% verandering in PMT Amyan Spectrale overlap van D45-Amyan in FIT kanaal, gecompenseerd Originele MFI waarde D % MFI waarde D45 Data verkregen van Tomas Kalina, Praag

18 Spectrale overlap van fluorochromen Grootste spectrale overlap: P PerPy5.5 30,1%-38,9% Pacific Blue Amyan 24,3%-31% Amyan FIT 24% PerPy5.5 P7 15,9%-18,8% Meer fluorochromen meer data spreiding verlies van resolutie Nog relatief weinig bekend over meest optimale combinatie! ombinatie FIT en Pacific Orange beter dan FIT en Amyan Department of Immunology, rasmus M

19 Waar moet je op letten? Welke fluorochromen? Instrument set-up: PMT instellingen ompensatie Samenstellen van antistofpanels Department of Immunology, rasmus M

20 Principes voor fluorochrome/marker selectie Gebruik de sterkste fluorochromen met de minste spectrale overlap problemen (i.e. P of AP) voor de zwakste antigenen (zoals activatie markers). Gebruik de zwakkere fluorochromen (o.a. P-y7 en AP-y7) met de grootste spectrale overlap problemen voor goed-gekarakteriseerde celpopulaties die danwel positief of negatief zijn (zoals D3, D19, ). Gebruik de zwakkere fluorochromen (FIT, PerP) voor antigenen die sterk tot expressie komen (zoals D4, D45, ). Gebruik de fluorochroom-paren met significante compensatie effecten en data spreiding (i.e. AP/AP-y7, P/P-y5.5) voor antigenen die binnen een populatie beiden positief of negatief zijn (zoals D19 en D20). Department of Immunology, rasmus M

21 onclusie 1 8 kleuren flowcytometrie is handig, maar ook complex! Keuze van fluorochromen Instellen van de flowcytometer, m.n. compensatie obuustheid van de lasers Keuze antistofpanels

22 uroflow netwerk Ontwerp van gestandardiseerde 8-kleuren panels voor alle hematologische maligniteiten en normale hematopoietsiche cellen AML; MDS; voorloper-b-all; T-ALL; NHL; LL; rijpe T/NK-celmaligniteiten; plasmacelmaligniteiten; screeningsbuizen) Definitieve panels gereed eerste helft 2009 (8 academic centers and 2 companies) Leeds otterdam Kiel Zabrze Prague Paris Salamanca Lisbon Department of Immunology, rasmus M

23 Wat verandert er in de analyse van data? norme toename van de hoeveelheid data

24 Analyse van data 4 kleuren Department of Immunology, rasmus M

25 Analyse van data 8 kleuren Department of Immunology, rasmus M

26 Wat veranderd er in de analyse van data? norme toename van de hoeveelheid data 8-kleuren flowcytometrie vraagt om echte multidimensionele analyse Nieuwe software voor data analyse nodig Pedreira et al, ytometry 2008;73:834

27 Infinicyte: fuseren van data files FIL FIL 1 TUB TUB FS-HIGHT FS-HIGHT SS-HIGHT SS-HIGHT D11b-FIT D11b-FIT D13-P D13-P D45-PerP D45-PerP D34-AP D34-AP D2-FIT D2-FIT D56-P D56-P HLAD-FIT HLAD-FIT D117-P D117-P D123-P D123-P D15-FIT D15-FIT D16-P D16-P D22-FIT D22-FIT D25-P D25-P D65-FIT D65-FIT 7.1-P 7.1-P D61-FIT D61-FIT D33-P D33-P D71-FIT D71-FIT Glyphorin-P Glyphorin-P Nine 4-color tubes Pedreira et al, ytometry 2008;73:834

28 Infinicyte: fuseren van data files Labelingen: 1. D16-D13-D45-D34-D117-D11b 2. D36-D33-D45-D34-D11b-D14 3. D15-D64-D45-D34-HLAD-D11b Gemeenschappelijke parameters: FS-SS-D45-D34 Tube 3 Tube 2 Tube 1 Department of Immunology, rasmus M

29 Fuseren van data files: eenmalig gaten én keer gaten voor 5 verschillende data files Pedreira et al, ytometry 2008;73:834

30 Simultane weergave van immunofenotype Pedreira et al, ytometry 2008;73:834

31 Multicolor analyse: bar code normaal MDS D36 D36 D33 Blast cellen (D34+/D117+) Department of Immunology, rasmus M

32 D61-FIT D33-P D71-FIT 7.1-P 1 FIL Glyphorin-P D65-FIT D25-P D22-FIT D16-P D15-FIT D123-P D117-P HLAD-FIT D56-P D2-FIT D34-AP D45-PerP D13-P D11b-FIT SS-HIGHT FS-HIGHT TUB Infinicyte: benadering van data D61-FIT D33-P D71-FIT 7.1-P FIL Glyphorin-P D65-FIT D25-P D22-FIT D16-P D15-FIT D123-P D117-P HLAD-FIT D56-P D2-FIT D34-AP D45-PerP D13-P D11b-FIT SS-HIGHT FS-HIGHT TUB 1 one 19-color tube 9 Files x 6 parameters x events 1 File x 21 parameters x events

33 Infinicyte: benaderen van data chte data Benaderde data Labelingen: 1. D16-D13-D45-D34-D117-D11b 2. D36-D33-D45-D34-D11b-D14 3. D15-D64-D45-D34-HLAD-D11b Department of Immunology, rasmus M

34 Infinicyte: gefuseerde en benaderde data D36-FIT (buis 2) D15-FIT (buis 3) D16-FIT (buis 1) D16-FIT (buis 1) Pedreira et al, ytometry 2008;73:834

35 Automatische identificatie van populaties Multidemsionele analyse: Automated Separation among different cell Populations (APS view) Department of Immunology, rasmus M

36 Automatische identificatie van populaties D8+ T-lymfocyten Monocyten B-cellen Neutrofielen D4+ T-lymfocyten NK-cells Department of Immunology, rasmus M

37 Automatische identificatie van populaties APS representatie van 3 pathologische populaties (gefuseerde file van 3 patienten) Typical B-LL FL ML Department of Immunology, rasmus M

38 Automatische identificatie van populaties APS representatie van 3 pathologische populaties (gefuseerde file van 3 patienten) Voeg een nieuwe gefuseerde en benaderde patient toe Typical B-LL Best passen bij een typische B-LL FL ML Department of Immunology, rasmus M

39 onclusie 2 Data analyse van 8 kleuren flowcytometrie is complex! chter: nieuwe software met echte multiparameter analyse zal interpretatie ondersteunen Door objectievere analyse mogelijk meer standarisatie mogelijk Door fuseren en benaderen geen noodzaak meer voor >8 kleuren en kleurrijke toekomst voor de immunofenotypering! Department of Immunology, rasmus M

40 Met dank aan: Immunologie, rasmus M laudia Hagens omana Jugooa elia Berenguer Perez Jeroen te Marvelde Henk Wind Herbert Hooijkaas Jacques van Dongen oordinators - J.J.M. van Dongen - A. Orfao Kiel Leeds Lisbon Paris - M. Kneba et al - S. ichards et al - P. Lucio et al -. MacIntyre et al Prague otterdam Salamanca Zabrze - O. Hrusak et al - V. van der Velden et al - A. Orfao et al - S. Szczepanski et al v.h.j.vandervelden@erasmusmc.nl