Ontwikkeling van een snelle LC-MS/MS methode voor het bestuderen van tryptofaan-depletie bij patiënten met een chronische inflammatoire darmziekte

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Maat: px
Weergave met pagina beginnen:

Download "Ontwikkeling van een snelle LC-MS/MS methode voor het bestuderen van tryptofaan-depletie bij patiënten met een chronische inflammatoire darmziekte"

Transcriptie

1 Vakgroep Organische Chemie Onderzoeksgroep: Scheidingstechnieken Ontwikkeling van een snelle LC-MS/MS methode voor het bestuderen van tryptofaan-depletie bij patiënten met een chronische inflammatoire darmziekte Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in de Chemie door Pieter - Jan Sabbe Academiejaar Promotor: prof. dr. Patrick Sandra Copromotor: dr. Frédéric Lynen Begeleider: Vivienne Malanchin

2

3 WOORD VOORAF Welcome to the exciting world of chemistry..., herinner ik me als de eerste woorden die ik las toen ik 5 jaar geleden aan deze studie begon. Exciting is deze trip doorheen de wondere wereld der wetenschap op de Sterre zeker en vast geweest. Het is een periode geweest van vallen en opstaan, een periode waar obstakels niet vreemd waren en waar wat doorzettingsvermogen vereist was. Dit alles heeft geholpen tot het vormen van mezelf als wetenschapper, maar ook als jongvolwassene... Graag zou ik Prof. Dr. P. Sandra, mijn promotor, bedanken voor de geboden kans om deze thesis te kunnnen vervolmaken in zijn onderzoeksgroep. Speciale dank aan de dienst gastro-enterologie van het UZ Gent, o.l.v. Dr. Harald Peeters, voor het voorzien van de nodige plasmamonsters, die onontbeerlijk waren in het tot stand komen van deze scriptie. Frédéric zou ik hartelijk willen bedanken voor zijn grote hoeveelheid geduld, zijn véle verbeterwerk en zijn talloze antwoorden op mijn evenvele vragen. Vivienne, grazie tante! Senza il tuo aiuto e i tuoi consigli, non avrei potuto scrivere questa tesi. Thomas voor zijn geweldige introductie in de wondere wereld van den 2000 en voor zijn hóóg rots-in-de-branding gehalte op het vlak van troubleshooting ervan. i

4 I would also like to thank Kai for his elaborate work and extensive help he gave me on statistics and chemometrics. Seppe, Barbara en Júlia, mijn lotsgenoten in het PARC. Bedankt voor de vele ontspanning voor, tijdens en na de inspanning. Bedankt voor alles, Gràcies per tot! Graag zou ik alle andere collega s van het PARC bedanken voor de fijne tijd gedurende het ganse jaar. Deze scriptie vormt niet enkel en alleen het sluitstuk van mijn studie, maar vormt ook het eindpunt van een héél spannende periode als student in Gent. Ik zou mezelf niet zijn indien ik hierbij sommige mensen niet zou bedanken. De musketiers: Stijnie, Driesken, Tom en Montie. Bedankt voor de ongelofelijke periode samen op de Sterre! Gel, bro in crime, voor de vele LEGEN wait for it DARY nights in Gent! Bobon als mijn vaste vriendin op donderdagavond! Zus, Koenraad en de rest van mijn familie en vrienden voor hun onvoorwaardelijke steun. Merci! Als laatste, en evenzeer de belangrijkste, zou ik graag mijn ouders bedanken voor de geboden kans om deze periode te mogen meemaken. Mama en Papa, zonder jullie zou me dit nooit gelukt zijn! Bedankt voor álles! The end is not near, it s here! Gent 20 mei 2010 ii

5 INHOUDSOPGAVE Inleiding en doelstelling v 1 Fundamentele aspecten van de chromatografie Het begrip Chromatografie Geschiedenis Het chromatografisch proces Differentiële migratie: schotelmodel Resolutie Bandverbreding Instrumentele aspecten van HPLC Massaspectrometrie Principe Theoretische en instrumentele aspecten van LC-MS/MS Statistiek en chemometrie Standaarddeviatie Relatieve standaarddeviatie Detectielimiet Significantie: de t-toets Principale componenten analyse iii

6 INHOUDSOPGAVE 2.6 Kleinste-kwadraten regressie (PLS) Literatuurstudie Inleiding De ziekte van Crohn Colitis ulcerosa Pathogenese van IBD Tryptofaan-depletie en vermoeidheid bij IBD: een oorzakelijk verband? Tryptofaan-depletie bij verhoogde IDO-activiteit Emotionele gevolgen van tryptofaan-depletie Chromatografische bepaling van tryptofaan en kynurenine: een overzicht Gaschromatografie Vloeistofchromatografie Detectie van tryptofaan en kynurenine Monstervoorbereiding en kwantificatie Experimenteel Gedeelte Algemene Experimentele Aspecten Chemicaliën Instrumentatie Veiligheidsaspecten Ethische commissie Optimalisatie van de scheiding van de analieten op een Kinetex kolom Bereiden van de stockoplossing Ontwikkelen van een gradiënt elutiemethode Detectie van het testmengsel met de API 2000 massaspectrometer Optimalisatie van de MS-parameters Kwantificatie Kynurenine Tryptofaan iv

7 INHOUDSOPGAVE 4.5 Monstervoorbereiding Batchsamenstelling en resultaat Statische analyse Distributie van data T-Toets Kynurenine Tryptofaan KYN/TRP-Ratio Principale componenten analyse Kleinste-kwadraten regressie Conclusie 91 Appendix 93 Afkortingen 99 v

8 INHOUDSOPGAVE vi

9 Inleiding en doelstelling De ziekte van Crohn en colitis ulcerosa, de 2 meest uitgesproken voorbeelden van een chronische inflammatoire darmziekte (Inflammatory Bowel Disease, IBD), treffen ongeveer 0,1 tot 0,2 % van de Belgische bevolking. In absolute cijfers betekent dit tot patiënten in België en tot 4 miljoen wereldwijd. De incidentie (het aantal nieuwe gevallen per jaar) in België bedraagt gemiddeld 4 tot 10 per inwoners. Chronische ontstekingen op slijmvlies van het maagdarmkanaal ontstaan door het onophoudend werken van het intestinale immuunsysteem. Deze ziekten verlopen via opstoten (opflakkeringen) en remissies (een periode van tijdelijk herstel die soms enkele jaren kunnen duren). De symptomen van IBD s zijn vooral spijsverteringsklachten, gepaard gaande met buikpijn en diarree. IBD s kunnen ernstige gevolgen hebben voor de gezondheid, zoals sterk gewichtsverlies, ondervoeding, groeiachterstand bij kinderen,... Ondanks uitvoerige studies en klinische ervaringen gedurende de afgelopen decennia, blijven de etiologische oorzaken verantwoordelijk voor deze afwijking onzeker en het verloop van de pathogenese blijft onvolledig. Net zoals bij andere chronische ziektes, is vermoeidheid een frequent geuite klacht bij patiënten met een inflammatoir darmlijden en tevens één van de belangrijkste symptomen tijdens een opstoot van de ziekte. Opvallend is echter dat deze klacht ook nog prominent aanwezig kan zijn wanneer er geen objectiveerbare ziekte-activiteit meer is. Deze chronische vermoeidheid kan ernstige vormen aannemen en voor de patiënt als invaliderend worden ervaren, met belangrijke psychosociale en professionele implicaties tot gevolg. Studies over vermoeidheid in inflammatoir darmlijden en de oorzaak ervan zijn echter schaars tot onbestaande. Pogingen om de vermoeidheid bij IBD-patiënten te koppelen aan verstoorde mineraal- en vitamine-a concentraties (zoals bv. ijzer, foliumzuur, koper, zink, Vit B1, Vit B12,...) bleken weinig succesvol.

10 Dit project maakt deel uit van een ruimere studie in samenwerking met de dienst gastroenterologie van het UZ Gent o.l.v. Dr. Harald Peeters. Het doel van dit project bestaat uit het ontwikkelen van een scheidingsmethode om de concentraties van tryptofaan en zijn toxisch metaboliet kynurenine te bepalen in bloedplasma van IBD-patiënten en controlepersonen. Het idee dat hierachter schuilt is dat de kynurenine/tryptofaan-verhouding de activiteit van het enzyme Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) weerspiegelt. Eerder werd aangetoond dat een verhoogde IDO-activiteit het gevolg is van het in werking treden van het immuunssysteem bij IDB-patiënten. IDO katalyseert de snelheidsbepalende stap in het katabolische kynurenine-reactiepad van tryptofaan, met lagere tryptofaanconcentraties (tryptofaan-depletie) en hogere kynurenineconcentraties als gevolg. Tryptofaan dient als precursor voor serotonine (5-HT), een belangrijke centrale neurotransmitter. Verlaagde serotonineconcentraties, als gevolg van tryptofaan-depletie, in combinatie met de toxische activiteit van kynurenine (en zijn metabole producten) zouden een mogelijke verklaring kunnen bieden voor de voortdurende vermoeidheid bij IBD-patiënten. Ontwikkeling van een snelle analysemethode gebaseerd op omkeerfase LC-MS/MS voor niet-gederivatseerd tryptofaan en kynurenine in bloedplasma, in combinatie met een weinig arbeidsintensieve monstervoorbereiding werden vooropgesteld. 149 plasmamonsters, waarvan 104 afkomstig van IBD-patiënten en 45 controlepersonen, werden geleverd door de dienst gastro-enterologie van het UZ Gent. De specificiteit en gevoeligheid van LC- ESI-MS/MS werden optimaal benut om simultaan het tryptofaan- en kynureninegehalte in het bloedplasma van de 149 monsters te bepalen. Nadien werd de bekomen data onderworpen aan enkele standaard statische testen, zoals de t-toets, en enkele meer geavanceerde chemometrische technieken, zoals principale componenten analyse en kleinste-kwadraten regressie. In het ruimere kader van deze studie zal de IDO-activiteit, gebaseerd op de bekomen resultaten tijdens deze thesis, gecorreleerd worden met vermoeidheidsstudies uitgevoerd op de IBD-patiënten.

11 HOOFDSTUK 1 FUNDAMENTELE ASPECTEN VAN DE CHROMATOGRAFIE 1.1 Het begrip Chromatografie Chromatografie is in de loop der jaren uitgegroeid tot een grote verscheidenheid aan methoden en toegepaste technieken waardoor het niet simpel is om een éénduidige, allesomvattende definitie te verschaffen. De International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) geeft de volgende definitie (letterlijk vertaald uit het engels): Chromatografie is een fysische scheidingsmethode waarbij de te scheiden componenten verdeeld worden over twee fases, waarvan één fase stationair is (stationaire fase) terwijl de andere fase (mobiele fase) in welbepaalde richting beweegt.. [1] Volgens van Dale wordt chromatografie als volgt omschreven: scheidingsmethode voor mengsels (gas- of vloeistofmengsels) waarbij deze door een adsorberende kolom worden geleid. Een duidelijk onderscheid dient vooraf gemaakt te worden tussen Analytische Chromatografie en Preparatieve Chromatografie. Analytische Chromatografie is een micro-analytische methode waarbij de samenstelling van een monster doorgaans niet groter dan 10 2 g zowel kwalitatief als kwantitatief onderzocht worden. Daarnaast wordt chromatografie, vooral vloeistofchromatografie, toegepast voor het isoleren van zuivere verbindingen in grote hoeveelheden; een methode die preparatieve chromatografie genoemd wordt. [2] 3

12 Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie 1.2 Geschiedenis Hoewel de Duitse kleurchemist Carl Runge voor het eerst in 1856 een scheiding van kleurstoffen - gebaseerd op een techniek die nu vergelijkbaar is met papierchromatografie - publiceerde, wordt de Russiche Botanicus Mikhail Tswett (14 mei juni 1919) als de vader van de Chromatografie beschouwd. Tswett scheidde in 1903 voor het eerst plantenextracten (bladpigmenten) door gebruik te maken van een glazen kolom gepakt met CaCO 3 deeltjes en petroleumether (mengsel van laagkokende alifatische koolwaterstoffen) als eluens. De plantenextracten zakten onder invloed van de zwaartekracht met het eluens mee met als resultaat een serie van gekleurde banden op de kolom. Tswett kende elke band toe aan een verschillende component van het plantenextract.[3] Dit vormde meteen ook de basis voor de naam die hij aan de techniek gaf: Chromatografie. Etymologisch kan chromatografie ontleed worden in het Griekse chroma (kleur) en graphein (schrijven) en betekent dus letterlijk kleurschrijven. Dat de Russische betekenis van Tswett, kleur is, zal echter wel niet geheel ontoevallig zijn. Hoe baanbrekend Tswetts uitvinding ook was, veel erkenning van zijn tijdsgenoten kreeg hij er niet voor. Mede door de publicatie van zijn doctoraatsverhandeling in het Russisch werden zijn ideeën maar weinig verspreid waardoor de daaropvolgende 25 jaar de methode niet evolueerde.[4] Zoals het echter vaak voorkomt in de geschiedenis kreeg Tswett pas post mortem erkenning en vanaf 1930 werd kolomchromatografie een gevestigde techniek in laboratoria over de hele wereld. In 1931 werd nieuw leven in de chromatografie geblazen door Kuhn en Lederer.[5] Deze biochemici slaagden erin om de eerste goede preparatieve scheiding van carotenoïden te bekomen. Deze prestatie leverde hen in 1938 de Nobelprijs voor scheikunde op. Het was deze scheiding die het begin betekende van een nieuwe periode waarin de chromatografie een buitengewone bloei zou kennen. Tot op dit moment werd enkel adsorptiechromatografie toegepast. Hierbij wordt de scheiding bekomen door een affiniteitsverchil van de componenten voor de stationaire fase (een adsorbens). Het was wachten tot 1941 vooraleer de eerste scheiding gebaseerd op vloeistof-vloeistof-verdelingschromatografie plaatsvond. Martin en Synge [6] realiseerden 4

13 1.2. Geschiedenis een scheiding van carbonzuren door gebruik te maken van een met-water-beladen silicagelkolom als stationaire fase en chloroform als mobiele fase. Mede door dit experiment, leverde hun onderzoek hen de Nobelprijs op in Vloeistofchromatografie bleef, vooral door gebrek aan reproduceerbaarheid en automatisatie, weinig populair gedurende daaropvolgende decennia. Als uitvinders van de gaschromatografie, in de vorm waarin we die tegenwoordige in de analytische chemie terugvinden, worden over het algemeen Martin en James naar voor geschoven [2]. In 1952 werd de scheiding van een mengsel van lagere carbonzuren door hen voor het eerst tot een goed einde gebracht. Hierbij werd het mengsel op een glazen kolom, gevuld met diatomeeënaarde beladen met siliconenolie en stearinezuur, gebracht en werd stikstofgas (N 2 ) als mobiele fase gebruikt. De succesvolle scheiding betekende het begin van een stormachtig zoeken naar nieuwe ontwikkelingen in de gaschromatografie en tevens ook het startschot van de instrumentele scheidingsmethodes. Na 1970 echter heeft ook de vloeistofchromatografie zich snel ontwikkeld tot een volwaardige analytische scheidingstechniek. Aminozuuranalyse gebaseerd op ionenuitwisselingschromatografie [7] en de introductie van de eerste gelpermeatiechromatograaf (GPC) door Waters Associates [8] worden beschouwd als de voorloper van de hedendaagse hoge performantie vloeistofchromatografie (HPLC). In beide systemen werd de mobiele fase door een kolom bestaande uit kleine deeltjes gepompt onder hoge druk. De eluerende fracties werden continu gedetecteerd wat uiteindelijk resulteerde in een chromatogram bestaande uit een reeks pieken uitgezet in functie van de tijd. Onder invloed van Csaba Horvath en Joseph Huber werd eind jaren 60 de techniek verder ontwikkeld tot een volwaardig systeem dat niet enkel alleen aminozuur- of polymeermengsels kon scheiden [9]. In 1941 stelde Martin al dat: De meest efficiënte scheidingen worden bekomen door gebruik te maken van kolommen met kleine deeltjes en een groot drukinterval over de gehele lengte van de kolom. [10] Vanaf 1970 tot op heden was (en blijft) het een voortdurend optimaliseren van HPLC als scheidingstechniek. Scheidingstijden werden, zoals Martin had voorspeld, drastisch verlaagd door het ontwikkelen van pompen die hogere drukken aankunnen en het fabriceren van kolommen met een steeds kleinere partikeldiameter. 5

14 Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie De belangrijkste mijlpalen uit de geschiedenis van de Chromatografie werden samengevat in Tabel 1.1. Tabel 1.1: Geschiedenis van de chromatografie. Wanneer? Wie? Wat? 1903 Tswett Eerste beschrijvingen van vloeistofchromatografie op basis van adsorptiefenomenen in een kolom Lederer, Kuhn et. al. Eerste belangrijke preparatieve scheidingen Izmailov, Shraiber Dunlaagchromatografie (TLC) Martin, Synge Verdelingschromatografie (LC) Consden, Gordon, Martin Introductie van papierchromatografie (PC) dat nu hoofdzakelijk vervangen werd door TLC Spedding & Tompkins Ionenuitwisselingschromatografie 1952 James, Martin Gas-vloeistofchromatografie (GC) als begin van de instrumentele scheidingsmethodes Martin, Synge Nobelprijs voor Scheikunde 1957 Golay Capillaire GasChromatografie (CGC) 1958 Flodin, Porath Gel Permeatie Chromatografie (GPC) 1962 Klesper Eerste introductie van een Superkritische vloeistof als mobiele fase 1966 Piel Hoge Performantie VloeistofChromatografie (HPLC) 1980 Jorgenson Capillaire Zone Elektroforese (CZE) 1984 Terabe Micellaire Elektrokinetische Chromatografie 1.3 Het chromatografisch proces Na injectie van het monster vindt scheiding op de kolom plaats via evenwichtinstelling tussen twee verschillende fasen: een stationaire fase met een groot contactoppervlak en een mobiele fase. In HPLC wordt gebruik gemaakt van een kolom die gepakt is met kleine sferische deeltjes waarvan de diameter varieert tussen 1,5 en 5 µm. Deze deeltjes bestaan meestal uit poreuze silica waarvan de binnenwand van deze porie bezet is met stationaire fase, zoals weergegeven in Figuur 1.1. Afhankelijk van de scheidingsmode die aangewend wordt, zal de stationaire fase verschillen. In dit werk wordt omkeerfase chromatografie (Reversed Phase Chromatography, RPC) aangewend om de scheiding te bekomen. De principes van de verschillende scheidingsmodes in HPLC worden uiteengezet in Tabel 1.2 6

15 1.3. Het chromatografisch proces. Figuur 1.1: Schematische voorstelling van een individueel silicadeeltje waarbij aan de wand van de porie C 18 -groepen verankerd werden als stationaire fase. Tabel 1.2: Verschillende scheidingsmodes in HPLC. schei- Chromatografische dingsmode Normaalfase Chromatografie (Normal Phase Chromatography, NPC) Omkeerfase Chromatografie (Reversed Phase Chromatography, RPC) Scheidingsprincipe De kolom is polair (bv. ongebonden silica of polair gebonden functionele groepen zoals cyano-, amino- en diolgroepen) en de mobiele fase is apolair (bv. hexaan, heptaan,...). De scheiding gebeurt op basis van polariteit waarbij de meest polaire component de grootste retentietijd heeft. NPC wordt hoofdzakelijk gebruikt voor monsters die onoplosbaar zijn in water; voor preparatieve HPLC en voor de scheiding van isomeren. De kolom is apolair (silica gemodificeerd met bv. C 18 of C 8 ) en de mobiele fase is een mengsel van water en een organisch solvent (bv. acetonitril, methanol) en meestal een zuur of basisch additief. De scheiding gebeurt op basis van hydrofobiciteit, waarbij de meest hydrofobe (apolaire) componenten het meest geretenteerd zijn. RPC is de meest gebruikte mode in HPLC omwille van zijn brede toepasbaarheid en uitstekende reproduceerbaarheid, vooral voor de analyse van wateroplosbare monsters. 7

16 Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie Hydrofiele interactie Chromatografie (Hydrophilic Interaction Chromatography, HILIC) Size Exclusie Chromatografie (Size Exclusion Chromatography, SEC) Voor SEC wordt een inerte kolom bestaande uit een hars of zeoliet gebruikt in combinatie met een waterige of een organische mobiele fase. De scheiding gebeurt op basis van de grootte/moleculair gewicht van de analieten en wordt het meest gebruikt voor de analyse van grote biomoleculen of synthetische polymeren. Affiniteitschromatografie (Affinity Chromatography, AC) Ionenuitwisselingschromatografie (Ion Exchange Chromatography, IEC) Chirale Chromatografie (Chiral Chromatography) De kolom is polair (silica of silica gemodificeerd met amidegroep) en de mobiele fase bestaat uit een mengsel van water en hoofdzakelijk organisch solvent (bv. acetonitril). HI- LIC wordt vooral gebruikt voor de analyse van extreem polaire componenten die weinig geretenteerd zijn in RPC. De stationaire fase vertoont affiniteit voor welbepaalde componenten uit het mengsel op basis van specifieke sleutel/slot-interacties die de natuurlijke activiteit nabootsen. De kolom bevat een geladen groep die analietionen van de tegengestelde lading kan binden. De mobiele fase is meestal een waterige zoutoplossing in combinatie met een buffer. In IEC worden monsterionen uitgewisseld met ionen van de mobiele fase. IEC wordt gebruikt voor het scheiden van ioniseerbare componenten zoals zuren en basen en vooral voor de analyse van grote biomoleculen zoals proteïnen en DNA. De stationaire fase vertoont verschillende interactie met de enantiomeren van een component met asymmetrische koolstofcentra Differentiële migratie: schotelmodel Differentiële migratie (verschillende gemiddelde snelheid waarbij componenten doorheen de kolom bewegen) vormt de basis van een chromatografische scheiding. Zonder een verschil in migratiesnelheid kan een scheiding niet plaatsvinden [11]. Dit verschil in migratiesnelheid komt tot stand doordat de componenten van het mengsel op een dynamische manier verdeeld worden tussen de stationaire en de mobiele fase. 8

17 1.3. Het chromatografisch proces Volgens het schotelmodel (plate theory) kan een kolom opgedeeld worden in theoretische schotels. Wanneer een analiet doorheen de kolom beweegt ondergaat het een reeks sorptieen desorptieprocessen tussen de stationaire en de mobiele fase. Dit is een dynamisch proces dat gebeurt via tussenliggende evenwichtsinstellingen. X(mobielef ase) X(stationairef ase) De schotellengte H is dan de kolomlengte die een component nodig heeft om een evenwichtsinstelling met de mobiele fase te bereiken. Figuur 1.2: Evenwichtsinstelling van solvent- en analietmolecules tussen de mobiele en de stationaire fase. Het effect van dit dynamisch evenwicht is een verschil in migratiesnelheid. Zoals in Figuur 1.2 te zien is, bevindt molecule X zich op elk moment evenveel in de stationaire als in de mobiele fase. Molecule Z bevindt zich daarintegen meer in de stationaire fase. Er kan dus gesteld worden dat molecule Z meer geretenteerd is en bijgevolg trager door de kolom migreert. Het dynamische evenwicht en de migratiesnelheid van een component zijn afhankelijk van de moleculaire structuur van de component, de chemische samenstelling van zowel de mobiele als de stationaire fase en van de temperatuur. 9

18 Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie Resolutie De retentiefactor k Wanneer een analietmolecule doorheen de kolom migreert, spreiden de molecules zich uit over een bepaald volume in de kolom. Het volume in de kolom dat één soort component van het mengsel bevat wordt een band genoemd. Wanneer een band uit de kolom elueert en opgenomen wordt in het chromatogram wordt er van een piek gesproken. Een chromatogram bevat zowel kwalitatieve (retentietijd) als kwantitatieve (piekoppervlakte) informatie. Uit Figuur 1.3 kunnen enkele belangrijke parameters gehaald worden. Figuur 1.3: Schematische voorstelling van een chromatogram: t r, t r en t 0 samen met w b, w h en σ De retentietijd t r is de gemiddelde verblijftijd van het analiet in het systeem, startend vanaf de injectie tot elutie en detectie. De retentietijd t r is componentspecifiek voor een soort kolom onder welbepaalde omstandigheden en is bijgevolg een kwalitatief criterium. De dode tijd t 0 is de tijd die een niet weerhouden component nodig heeft om gedetecteerd te worden. Het is bijgevolg de tijd die de mobiele fase nodig heeft om het systeem te doorlopen. De netto retentietijd t r is de tijd dat de component in de stationaire fase verblijft. 10

19 1.3. Het chromatografisch proces De netto retentietijd kan als volgt berekend worden volgens vergelijking 1.1: t r = t r t 0 (1.1) De lineaire snelheid u van de mobiele fase kan bepaald worden met de retentietijd t r en de kolomlengte L volgens vergelijking 1.2: u = L t r (1.2) De retentiefactor k (capaciteitsfactor) wordt gedefinieerd als de verblijftijd van de component in de stationaire fase over de verblijftijd in de mobiele fase. k = t r t 0 t 0 = t r t 0 (1.3) Bij voorkeur wordt de k-waarde gebruikt om retentie aan te geven omdat deze waarde dimensieloos is en bijgevolg onafhankelijk van de kolomparameters (lengte en diameter, partikelgrootte). Zoals eerder vermeld is de plaattheorie gebaseerd op een evenwichtsproces waarbij het analiet dynamisch verdeeld wordt over de mobiele en de stationaire fase. Aan dit evenwichtsproces kan de evenwichtsconstante K (soms ook verdelingscoëfficiënt of distributieconstante) toegekend worden (vergelijking 1.4). K = c S c M (1.4) Hierbij zijn c S en c M de concentratie (in mol/l) van het analiet in respectievelijk de stationaire en de mobiele fase. De waarde van de evenwichtsconstante K wordt enerzijds bepaald door de chemische structuur van het analiet en anderzijds door de chemische natuur van de stationaire en de mobiele fase. Daar K een thermodynamische constante is, is K ook temperatuursafhankelijk. De evenwichtsconstante K en de retentiefactor k zijn gekoppeld volgens vergelijking 1.5: K = Q S/V S Q M /V M = Q S V M Q M V S = kβ (1.5) 11

20 Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie Hierbij zijn Q S = hoeveelheid (mol) van de component in de stationaire fase, Q M = hoeveelheid (mol) van de component in de mobiele fase, V S = volume van de stationaire fase, V M = volume van de mobiele fase. De evenwichtsconstante K wordt zo opgesplitst in : k = retentiefactor, β = faseratio; kolomafhankelijke constante. De selectiviteit α Om twee opeenvolgende pieken goed van elkaar te kunnen onderscheiden is het noodzakelijk dat hun retentiefactoren, en bijgevolg dus ook hun distributiefactoren, voldoende van elkaar verschillen. Een dimensieloze factor die het verschil in retentie tussen twee pieken weergeeft is de relatieve retentieverhouding of selectiviteit α en wordt gegeven door vergelijking 1.6. α = k 2 k 1 (1.6) Hoe groter de selectiviteit, hoe groter het verschil in de retentietijd en hoe verder de analietpieken van elkaar gelegen zijn. De selectiviteitsfactor α is voornamelijk afhankelijk van de stationaire fase en de chemie van de te scheiden componenten. De resolutie van een scheiding verbeteren gebeurt in de eerste plaats via de optimalisatie van de selectiviteit. De efficiëntie: schotelgetal N De efficiëntie van een chromatografische kolom is het vermogen van de kolom om piekverbreding tegen te gaan en dus een hoge resolutie te leveren. Het theoretisch aantal platen (schotels) is een maat voor de kolomefficiëntie. Een groter aantal platen geeft aanleiding 12

21 1.3. Het chromatografisch proces tot scherpere pieken en dus een betere scheiding. Uit een chromatogram (Figuur 1.3) kunnen de parameters gevonden worden die nodig zijn om het het schotelgetal N te berekenen. N wordt berekend volgens N = In geval van een gaussiaanse piek geldt: ( ) 2 ( ) 2 ( ) 2 tr tr tr = 5.54 = 16 (1.7) σ w h w b t r = retentietijd, σ = halve breedte van de piek op 60.7 % van de hoogte van de piek, w h = de breedte van de piek op halve hoogte (FWHM), w b = de breedte van de piek aan de basis. Wanneer de dode tijd in rekening gebracht wordt, wordt het effectieve plaatgetal N eff bekomen: ( ) 2 tr N eff = 5.54 (1.8) w h De efficiëntie van een kolom is invers gerelateerd met de schotellengte (height equivalent of a theoretical plate, H). H stelt hierbij de kortst mogelijke kolomlengte voor die vereist is zodat een evenwicht zich kan instellen voor de verdeling van een analiet over de twee fases. H kan berekend worden volgens vergelijking 1.9. H = L N (1.9) Hoe kleiner de H-waarde is, hoe meer platen de kolom bevat. Een kolom met een hoger aantal platen levert scherpere pieken en een betere resolutie. Voor gepakte kolommen kan aangetoond worden dat H 2d p en dat bijgevolg : N = 13 L 2d p (1.10)

22 Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie In dit werk werd gebruik gemaakt van een Kinetex-kolom (Phenomenex) waarvan de lengte 5 cm is en de deeltjesgrootte 1,7 µm wat in principe een typische plaatgetal van N = zou opleveren. De Kinetex-kolom is gepakt met partikels bestaande uit een harde kern van 1,25 µm en een poreuze buitenlaag van 0,23 µm, ook wel Halo-partikels genoemd. De poreuze silicalaag vormt hierbij de stationaire fase, waardoor de diffusieafstand een stuk korter is in vergelijking met klassieke poreuze deeltjes met dezelfde dimensies, waardoor een snellere massastransfer verkregen wordt. Een snellere massatransfer resulteert in een verlaagde C-term (zie verder) waardoor een hogere efficiëntie bereikt wordt. Snelle analyses kunnen met dit soort kolom verwezenlijkt worden omwille van de kleine partikelgrootte (1,7 µm) en de unieke harde deeltjes technologie. Dit type materiaal vereist minder tegendruk voor dezelfde efficiëntie, waardoor deze kolommen op conventionele HPLC-apparatuur kunnen gebruikt worden [12]. Het berekende plaatgetal (N = ) bij dergelijke partikels is dus onderschat. Resolutie R s De resolutie R s is een maat voor de scheiding van twee componenten op een bepaalde kolom (lengte, straal, stationaire fase, partikelgrootte) onder welbepaalde omstandigheden (aard en snelheid van de mobiele fase, temperatuur,...) [4]. De resolutie is componentafhankelijk en kan berekend worden volgens : R s = t r2 t r1 1/2(w b1 + w b2 ) (1.11) Hierbij zijn t r1 en t r2 de retentietijd van beide signalen en w b1 en w b2 de breedte van de piek aan de basis van beide signalen. Bij twee even grote pieken correspondeert R s = 1, 50 met ongeveer een volledige scheiding. Door invullen van vergelijking 1.3, 1.6 en 1.7 in vergelijking in 1.11 wordt de basisvergelijking van de chromatografie bekomen : R s = 1 4 ( ) ( ) α 1 k N α k + 1 (1.12) Deze basisvergelijking bevat alle relevante parameters van een chromatografische schei- 14

23 1.3. Het chromatografisch proces ding: kolomefficiëntie N, selectivititeitsefficiëntie α en retentiefactor k. Elke ingreep in het scheidingsproces die N, α of k doen toenemen heeft een gunstig effect op de resolutie. De selectiviteitsfactor α heeft de grootste invloed op de resolutie. α verhogen van 1, 05 tot 1, 10 resulteert bijna in een verdubbeling van R s. De keuze van de stationaire fase is dus essentieel in het ontwerp van de scheidingsmethode. Kolomefficiëntie heeft minder invloed op de resolutie (a.g.v. de vierkantswortel in de vergelijking) dan de selectiviteitsfactor, maar optimalisatie van N levert betere scheidingen voor alle componenten op waarbij optimalisatie van α doorgaans slechts een verbetering voor één piekpaar oplevert. De retentiefactor k heeft slechts een geringe invloed op de resolutie voor k-waarden die groter zijn dan 4. Optimalisatie van de retentiefactor kan gerealiseerd worden door de hoeveelheid stationaire fase te verhogen of door de temperatuur te verlagen Bandverbreding De kwaliteit van een chromatografische scheiding is sterk afhankelijk van de kolomefficiëntie N die op zijn beurt verbonden is met de breedte van de eluerende pieken in het chromatogram. Hoe groter de N-waarde is, des te scherper de pieken zijn en hoe beter de resolutie. In het ideale geval heeft de elutiepiek een Gaussiaanse klokvorm, waarbij het signaal symmetrisch rond het maximum is. De piek heeft een welbepaalde breedte, uitgedrukt door de parameters σ, w h en w b (zie Figuur 1.3) [13]. De realiteit toont echter altijd een afwijking van het ideale geval. Intra- als extra-kolom aspecten dragen bij tot bandverbreding (in het systeem) en leiden bijgevolg ook tot piekverbreding in het chromatogram. De piekbreedte neemt toe met de vierkantswortel van zijn afgelegde afstand, waardoor de variantie σx 2 lineair zal toenemen met de afgelegde weg [14]. Mathematisch wordt dit: H = dσ2 x dl (1.13) De afwijking van de ideale Gauss-curve wordt vaak uitgedrukt door de variantie σ 2 (bij een curve met standaardafwijking σ). Zoals hoger vermeld is de efficiëntie van de kolom evenredig met zijn lengte, waardoor het wenselijk is de afwijking uit te drukken in variantie 15

24 Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie σ 2 per eenheid van kolomlengte (zie vergelijking 1.14) N = L2 σ 2 x (1.14) Drie intra-kolom processen kunnen aanleiding geven tot intra-kolom bandverbreding. Deze zijn: Eddy diffusie (A), longitudinale diffusie (B) en massatransfer (C). Eddy diffusie (A) Als gevolg van onregelmatigheden in de pakking van een kolom en door het gebrek aan volledige uniformaliteit in de vorm en grootte van de silicadeeltjes kunnen verschillende vloeipaden in de kolom ontstaan (Figuur 1.4 ). Analietmoleculen die tot een sneller vloeipad behoren elueren sneller dan andere moleculen waardoor een variatie in de retentietijden optreedt. Hoe groter deze variatie, hoe groter de band- en piekverbreding. Deze bijdrage staat bekend als de Eddy diffusie en wordt gedefinieerd door de A-term: waarbij : A = 2λd p (1.15) λ = stapelingsfactor, d p = partikeldiameter. Figuur 1.4: Schematische voorstelling van het Eddy Diffusie fenomeen Daar variantie afhankelijk is van de lengte van de kolom (zie hoger) en de A-term een kolomkarakteristiek is geldt : 16

25 1.3. Het chromatografisch proces σ 2 Eddy = 2λd pl (1.16) Invullen in vergelijking 1.14 levert dit: H Eddy = σ2 Eddy L = 2λd p = A (1.17) Deze bijdrage van de Eddy-diffusie tot plaathoogte en bijgevolg de bandverbreding is afhankelijk van de grootte van de silicadeeltjes en het pakken ervan. Bij open tubulaire kolommen kan deze term verwaarloosd worden. Longitudinale diffusie Als gevolg van verschillende concentratiezones in de mobiele fase zullen analietmoleculen diffunderen vanuit hoog geconcentreerde naar laag geconcentreerde zones. Indien deze diffusie radiaal verloopt heeft dit geen bijdrage tot bandverbreding, axiale diffusie daarintegen wel. Axiale of longitudinale diffusie wordt afgebeeld in Figuur 1.5 en is gegeven door: B = 2γD M (1.18) met γ = obstructiefactor, D M = diffusiecoëfficiënt in de mobiele fase. 17

26 Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie Figuur 1.5: Schematische voorstelling van de piekverbreding die optreedt als gevolg van longitudinale diffusie. De B-term is afhankelijk van de kolomlengte L en de snelheid van de mobiele fase u. Logischerwijs zullen analietmoleculen minder de kans hebben om te diffunderen bij een snellere solventstroom dan bij een tragere. De variantie σ 2 diff wordt gedefinieerd door: σ 2 diff = 2λD ML u (1.19) Analoog als voor A, wordt de bijdrage van de longitudinale diffusie aan de bandverbreding gegeven door: H diff = σ2 diff L = 2λD M u = B u (1.20) Hieruit blijkt dat een hogere snelheid van de mobiele fase en kleine diffusiecoëfficiënten een gunstig effect hebben op de piekverbreding als gevolg van longitudinale diffusie. Massatransfer Een derde proces dat bijdraagt aan band- en piekverbreding is massatransfer (C) tussen de stationaire en de mobiele fase. Bij gepakte kolommen wordt bv. een onvolledige evenwichtsinstelling bekomen doordat sommige analietmoleculen dieper in de porie van het silicadeeltje penetreren dan andere (voor C M ). Hierdoor zullen sommige analietmoleculen langer in het silicadeeltje verblijven dan andere waardoor die niet verder door de kolom kunnen migreren en uiteindelijk elueren. Bij open tubulaire kolommen, die vooral in 18

27 1.3. Het chromatografisch proces gaschromatografie (GC) gebruikt worden, is piekverbreding door de massatransfer vooral te wijten aan de trage diffusie doorheen de stationaire fase zelf. De massatransfer C kan dus opgedeeld worden in twee verschillende processen met elk hun verschillende snelheid (Vergelijking 1.21). C = C M + C S (1.21) Waarbij C M : het transport vanuit de mobiele fase naar het grensvlak tussen de mobiele en de stationaire fase. Deze factor is afhankelijk van processen die plaatsvinden aan de mobiele fase. C S : het transport vanuit de stationaire fase naar het grensvlak tussen beide fases. Deze factor is afhankelijk van de afgelegde afstand in de stationaire fase en processen eigen aan deze fase. De variantie σmassa 2 en dus de piekverbreding nemen toe met de snelheid van de mobiele fase u, daar er minder tijd is voor evenwichtsinstelling bij een hogere snelheid van de mobiele fase. σ 2 massa = CLu = (C M + C S )Lu (1.22) Met behulp van vergelijking 1.14 wordt de bijdrage van de C-term aan de piekverbreding gegeven door : van Deemter vergelijking H massa = σ2 massa L = CLu u = Cu (1.23) De totale bandverbreding is de som van de bijdragen geleverd door de Eddy diffusie, longitudinale diffusie en massatransfer : H = H Eddy + H diff + H massa = A + B u + Cu (1.24) 19

28 Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie Vergelijking 1.24 is beter bekend als de van Deemter vergelijking en beschrijft de piekverbreding in de kolom in functie van de snelheid van de mobiele fase. Figuur 1.6 is de voorstelling van een van Deemter curve waarbij de plaathoogte in functie van de mobiele fase snelheid u is weergegeven. De eigenlijke curve in stippellijn is een combinatie van de A-, B- en C-term en vertoont een minimum waar de efficiëntie maximaal is. Bijgevolg is de snelheid van de mobiele fase optimaal bij het minimum van deze curve. Figuur 1.6: Schematiche voorstelling van de invloed van de A, B en C-term op de van Deemter curve. De van Deemter vergelijking geeft de componenten weer die de oorzaak vormen van de intra-kolom piekverbreding. Naast deze 3 termen zijn er nog een aantal factoren die niet gerelateerd zijn aan de kolom, maar toch tot piekverbreding kunnen leiden. De belangrijkste extra-kolom effecten zijn : Tubings, fittings,... om de verschillende delen van het systeem met elkaar te verbinden. Ze bevatten een dood volume dat zo klein mogelijk gehouden moet worden om piekverbreding te beperken. Injectie: het geïnjecteerde volume wordt zo klein mogelijk gehouden (in dit werk : 5 µl) om het Gaussiaans karakter van de piek te behouden. 20

29 1.4. Instrumentele aspecten van HPLC Detectie: het volume van de doorstroomcel (flow cell) wordt in combinatie met de responstijd zo klein mogelijk gehouden. 1.4 Instrumentele aspecten van HPLC Figuur 1.7 geeft schematisch de opstelling van een HPLC-systeem weer. Volgende onderdelen zijn genummerd terug te vinden op de figuur en zijn essentieel in een modern HPLC-systeem. Alle onderdelen zijn tevens terug te vinden in het systeem waarmee dit werk tot stand gekomen is, nl. Waters Alliance Figuur 1.7: Schematische voorstelling van een HPLC-systeem. 1. Solventfles : Een reservoir voor de mobiele fase is een simpel toch essentieel onderdeel van een HPLC-systeem. Elke chromatgraaf bevat er tenminste 2, waarbij een aparte fles voorzien is voor zowel de waterige als de organische fase (indien er met omkeerfase LC gewerkt wordt). Vooraleer de mobiele fase de fles verlaat via één van de kanalen wordt het gefilterd via een inlet-filter. 2. Verbindingskanalen: Tubings en Fittings worden gebruikt om de verschillende componenten van het HPLC-systeem met elkaar te verbinden. Tubings zorgen voor het transport van het analiet en de mobiele fase door het systeem. Tubings vervaardigd uit PolyEther Ether Ketone (PEEK) worden vaak gebruikt omwille van hun flexibiliteit en gebruiksvriendelijkheid. Bij drukken hoger dan 7000 psi (482 bar) worden tubings uit roestvrij staal gebruikt. Essentieel is de kleine interne dia- 21

30 Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie meter van tubings om het extra-kolom volume zo klein mogelijk te houden en om bandverbreding tegen te gaan. 3. Ontgassingssysteem: De aanwezigheid van luchtbellen in de mobiele fase kunnen leiden tot een drukverval in het systeem en bijgevolg weinig betrouwbare en reproduceerbare metingen. Ontgassen van de mobiele fase vooraleer het in het systeem geïntroduceerd wordt is dus noodzakelijk. Ontgassen kan vooraf gebeuren door de mobiele fase in het ultrasoonbad te plaatsen, maar meestal gebeurt dit on-line. On-line ontgassen is gebaseerd op de selectieve permeabiliteit van een tubing die doorheen een geëvacueerde kamer loopt. Het vacuüm zuigt het opgeloste gas doorheen de polymere wand van de tubing terwijl het solvent verder naar de mengpomp wordt gezogen. 4. Pompsysteem & mengkamer: Een hoge druk pomp (tot 400 bar) levert de mobiele fase met een precies gecontroleerd debiet tot in de mengkamer. In de mengkamer worden de solventen gemengd in de gewenste verhouding en naar de kolom gestuurd. Afhankelijk van het te analyseren mengsel kan gekozen worden voor een isocratische elutie of voor een gradiënt elutie. Bij isocratische elutie blijft de mobiele fase, ofwel een zuiver solvent ofwel een mengsel, onveranderd gedurende de analyse [15]. Bij gradiënt-elutie verandert de samenstelling van de mobiele fase gedurende de scheiding volgens een vooraf ingesteld schema. Het pompsysteem bestaat uit een heen en weer bewegende zuiger (reciprocating piston) vervaardigd uit saffier of porselien, een rubberen afsluitring (pump seal), ventielen (check valve) en een motor om de zuiger heen en weer te laten bewegen. 5. Injectiesysteem: Het injectiesysteem wordt gebruikt om een bepaalde hoeveelheid van het analiet in de kolom te introduceren zonder een druk- of debietverval te creëren. Hiervoor wordt een zeswegkraan gebruikt (Figuur 1.8). In de laadpositie wordt de injectielus (loop) gevuld met het monster afkomstig van de injectienaald. De injectielus wordt volledig gevuld en het overtollige analiet wordt naar het afvalvat gestuurd. In deze positie is de kolom met de pomp verbonden waardoor er 22

31 1.4. Instrumentele aspecten van HPLC voortdurend mobiele fase door de kolom stroomt, dit om uitdroging te verkomen. Om het monster te introduceren in de kolom wordt de kraan 60 gedraaid naar de injectiepositie. In deze stand stuurt de pomp de mobiele fase door de loop naar de kolom waardoor het analiet samen met de mobiele fase op de kolom terecht komt. Figuur 1.8: Laadpositie (links) en injectiepositie (rechts) van de zeswegkraan. 6. De kolom & kolomoven: De kolom is het hart van het HPLC-systeem. De kolom bestaat uit een stalen omhulsel waarin silicadeeltjes gepakt zijn. De poriën van elk silicadeeltje bevat de stationaire fase, bv. een octadecyl-groep (C 18 ). In dit werk werd gebruik gemaakt van een kolom gepakt met 1,7 µm Kinetex C 18 -deeltes. Om de scheiding van het mengsel onder controle te houden is temperatuurcontrole van de kolom noodzakelijk. Een constante temperatuur wordt bekomen door de kolom in een kolomoven te plaatsen. 7. Detectiesysteem: Een detector wordt gebruikt om de gescheiden banden te visualiseren wanneer ze uit de kolom elueren en dusdanig het chromatogram te construeren. Verschillende detectiesystemen zijn beschikbaar op de markt met elk hun eigen voor- en nadelen. Enkele voorbeelden zijn UV-VIS detectie, Massaspectrometrie, fluorescentie-detectie (FLD), elektrochemische detectie, corona discharge detectie, light scattering detectie,... In dit werk werd massaspectrometrie (MS) gebruikt 23

32 Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie als detectiesysteem. De principes van deze detector worden uitvoerig beschreven in sectie Datasysteem: Een datasysteem met de nodige software is nodig om de elektronische signalen te verzamelen en om te zetten tot een bruikbaar chromatogram. In dit werk werd gebruik gemaakt van het Analyst pakket van Applied Biosystems In Figuur 1.9 is een afbeelding weergegeven van de gebruikte opstelling waarmee dit werk tot stand gekomen is. Figuur 1.9: Opstelling: Waters Alliance 2695 gekoppeld aan een API 2000 massaspectrometer van Applied Biosystems. 1.5 Massaspectrometrie Principe Massaspectrometrie (MS) is een analytische detectietechniek waarbij de gevormde gasvormige ionen van een monster gescheiden worden volgens hun verhouding van massa over lading, om vervolgens gedetecteerd en gekwantificeerd te worden. Als resultaat wordt een massaspectrum verkregen waarbij de absolute of relatieve intensiteit (in tellen) van de geproduceerde ionen in functie van hun massa over lading (m/z) uitgezet wordt. Een massaspectrum levert informatie over de moleculaire massa van het analiet en kan, desgewenst, ook structurele informatie geven uit het fragmentatiepatroon. De massaspectrometer is de 24

33 1.5. Massaspectrometrie afgelopen eeuw geëvolueerd tot een hoogtechnologisch systeem. In zijn meest elementaire vorm bestaat de massaspectrometer uit : de ionenbron: productie van gasvormige ionen de massa-analysator: analyseert en scheidt de ionenbundel volgens hun m/z ratio. Een magneetsector scheidt de geproduceerde ionen in de ruimte, een time-of-flight (TOF) zondert de verschillende moleculen af volgens hun vluchttijd in de zogenaamde flighttube en een quadrupoolfilter treedt op als massafilter. Elk systeem heeft zijn eigen voor- en nadelen waarbij de kostprijs vaak de bepalende factor is. het detectiesysteem: zet de ionenbundel om in een meetbaar signaal Naast deze essentiële onderdelen zijn een geschikt monsterintroductie- en ionisatiesysteem (de interface), een systeem om de overgang van atmosferische druk naar hoog vacuüm te overbruggen en een dataverwerkingsysteem onontbeerlijk. Gekoppeld aan een HPLC-systeem wordt er gesproken van een hyphenated technique waarbij twee populaire opstellingen vaak onderscheiden worden: LC-MS en LC-MS/MS. Wanneer over LC-MS gesproken wordt, wordt het HPLC systeem gekoppeld aan een enkelvoudige MS (single stage detector). Hierbij wordt de ionaire vorm van elk analiet, meestal het geprotoneerde moleculaire ion, gemeten en geregistreerd. Bij LC-MS/MS wordt de HPLC gekoppeld met Tandem-MS. Hierbij worden ionen twee maal geanalyseerd, waarbij na de eerste massaselectie fragmentatie van het analietion plaatsvindt. In dit werk werd geopteerd voor LC-MS/MS daar deze modus operandi toelaat om in zeer complexe mengsels zoals plasma zeer selectief bepaalde molecules kwantitatief te bepalen Theoretische en instrumentele aspecten van LC-MS/MS In Figuur 1.10 wordt een vereenvoudigde weergave gegeven van de gebruikte massaspectrometer, nl. de API 2000 van Applied Biosystems. 25

34 Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie Figuur 1.10: Schematische voorstelling van de API 2000 massaspectrometer van Applied Biosystems. LC-MS interface: Atmosferische druk electrospray ionisatie (AP-ESI) De ontwikkeling van een robuuste interface om het eluens van een HPLC te introduceren in de MS, in combinatie met met een relatief hoge ionisatie efficiëntie, is de belangrijkste factor voor het hedendaagse succes van LC-MS. John B. Fenn en Koichi Tanaka werden dan ook de Nobelprijs chemie toegekend in 2002 voor de ontwikkeling van de ESI-interface [16]. Omdat een MS-detector slechts functioneert onder hoog-vacuüm moeten de geïoniseerde analietmoleculen in de gasvormige toestand voorkomen. Dit is de taak van de interface. Vandaag worden nog bijna uitsluitend ionisatiebronnen bij atmosferisch druk gebruikt (Atmospheric Pressure Ionisation, API). De twee bekendste zijn de elektrospray (ESI) en de atmosferische druk chemische ionisatiebron (APCI). In dit werk werd ESI aangewend en bijgevolg wordt enkel deze interface besproken [11, 17]. Figuur 1.11: Ionenbron 26

35 1.5. Massaspectrometrie Het eluens, afkomstig van het HPLC-apparaat of via directe injectie met een spuit, wordt naar de ionenbron geleid onder atmosferische druk (Figuur 1.11). Het proces waarbij gasvormige analietionen gevormd worden bij ESI is nog steeds een onderwerp van discussie. Algemeen kan het proces van electronspray ionisatie in vijf verschillende stappen omschreven worden. [18] 1. Ionisatie in oplossing. Hoewel dit niet noodzakelijk is voor ESI wordt de beste gevoeligheid verkregen wanneer er al ionen gevormd worden in de eluensstroom. Door een optimale solvent-, buffer- en dus ph-keuze worden reeds ionen gevormd in de oplossing. Ionaire analietmoleculen zijn makkelijker in staat om te verdampen uit de geladen druppeltjes dan neutrale moleculen. Componenten die nog niet geïoniseerd zijn in oplossing kunnen ook geanalyseerd worden omdat verneveling van het monster, desolvatatie van het gegenereerde aerosol en ionevaporatie in staat zijn een sterke elektrische lading op het oppervlak van de druppeltjes te creëren, wat ionisatie van de analietmoleculen teweeg brengt [15]. 2. Verneveling Verneveling ontstaat wanneer de analietoplossing in de ionisatiekamer geïntroduceerd wordt. Geladen solventdruppeltjes worden gecreëerd door het aanleggen van een sterk elektrisch veld op de tip van het capillair (tot 6000 V) waar het eluens naar gekanaliseerd wordt enerzijds, en de sterke afschuifspanning van het verstuivergas anderzijds [19]. Deze druppeltjes hebben een diameter van ongeveer 2 µm en bevatten circa ladingen. Afhankelijk van het teken van de aangelegde spanning (positieve of negatieve modus) worden ionen van tegengestelde polariteit preferentieel naar het oppervlak van de druppel getrokken. Resultaat is een fijne nevel van geladen druppeltjes, m.a.w. een elektrospray (Figuur 1.12). 27

36 Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie Figuur 1.12: Schematische voorstelling van het elektronspray fenomeen 3. Coulomb fissie: desolvatatie van geladen druppeltjes. Vooraleer de gevormde ionen de massa-analysator binnentreden moeten de omringende solventmoleculen verwijderd worden. Een tegenstroom van verwarmd drooggas (N 2 ) verdampt de solventmoleculen en zorgt voor een stijging van de lading/volumeratio binnenin de druppeltjes. De druppeltjes zullen kleiner worden totdat de elektrostatische Coulombkracht groot genoeg is om de oppervlaktespanning te overwinnen, op dit moment is de Rayleigh limiet bereikt. De Rayleigh desintegratie limiet is de maximum lading dat een druppeltje kan bevatten bij constant volume. Wanneer deze limiet overschreden wordt onstaat er een explosie van de druppeltjes (Figuur 1.13). Wat volgt is een cascade van druppelexplosies waardoor steeds kleinere druppels gevormd worden, een proces dat beter bekent staat als Coulomb fissie. Figuur 1.13: Schematische voorstelling van de desolvatatie via Coulomb fissie. 28

Cover Page. The handle http://hdl.handle.net/1887/19049 holds various files of this Leiden University dissertation.

Cover Page. The handle http://hdl.handle.net/1887/19049 holds various files of this Leiden University dissertation. Cover Page The handle http://hdl.handle.net/1887/19049 holds various files of this Leiden University dissertation. Author: Lindenburg, Petrus Wilhelmus Title: New electromigration-driven enrichment techniques

Nadere informatie

Nederlandse Samenvatting

Nederlandse Samenvatting Chromatografische analyse van kleine metabolieten in biologische matrixen Metabolieten zijn kleine moleculen (doorgaans < 1 kda) die het moleculair fundament van het leven vormen en het resultaat zijn

Nadere informatie

Ontwikkeling van een HPLC-MS methode voor de bepaling van ceramiden in de huid

Ontwikkeling van een HPLC-MS methode voor de bepaling van ceramiden in de huid Vakgroep Organische Chemie Onderzoeksgroep Scheidingstechnieken Ontwikkeling van een HPLC-MS methode voor de bepaling van ceramiden in de huid Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master

Nadere informatie

Uitwerkingen van de opgaven uit: CHEMISCHE ANALYSE ISBN , 1 e druk, Uitgeverij Syntax Media Hoofdstuk 19 Gaschromatografie bladzijde 1

Uitwerkingen van de opgaven uit: CHEMISCHE ANALYSE ISBN , 1 e druk, Uitgeverij Syntax Media Hoofdstuk 19 Gaschromatografie bladzijde 1 Hoofdstuk 19 Gaschromatografie bladzijde 1 Opgave 1 a Welke voordelen heeft een capillaire kolom ten opzichte van een gepakte kolom? Veel betere scheiding: hoger schotelgetal b Welk nadeel is aan een capillaire

Nadere informatie

Theorie GC. http://www.nano2.nl/theoriegc.pdf versie: 050515 2005 Frans Killian

Theorie GC. http://www.nano2.nl/theoriegc.pdf versie: 050515 2005 Frans Killian Theorie GC http://www.nano2.nl/theoriegc.pdf versie: 050515 2005 Frans Killian INHOUD blz. 1 Chromatografie 2 2 Vloeistofchromatografie 2 3 Gaschromatografie 2 4 De opbouw van de gaschromatograaf 3 5 De

Nadere informatie

Moderne Instrumentele Analyse

Moderne Instrumentele Analyse Moderne Instrumentele Analyse Niels Jonker Massa Spectrometrie Techniek waarbij de te onderzoeken stof wordt geïoniseerd en waarbij vervolgens van de gevormde (fragment)ionen de massa wordt bepaald. Klopt

Nadere informatie

GC of HPLC, that s the question?!

GC of HPLC, that s the question?! GC of HPLC, that s the question?! door Ir. Nico Vonk Avans+ Breda. Toepassingsgebied van de chromatografische technieken WP HT- GC Monster matrix Mengbaarheid met de mobiele fase (HPLC) Vluchtig (GC,

Nadere informatie

Meten en Maken 1. Toets Harris 26-04-2010

Meten en Maken 1. Toets Harris 26-04-2010 Meten en Maken 1 Toets Harris 26-04-2010 Deze toets bestaat uit vier opgaven die even zwaar tellen. De vier opgaven bestaan allemaal uit deelvragen. Maak elke opgave op een apart antwoordblad. Dit maakt

Nadere informatie

Citation for published version (APA): Hendriks, G. (2009). Theoretical models in bioanalytical method development s.n.

Citation for published version (APA): Hendriks, G. (2009). Theoretical models in bioanalytical method development s.n. University of Groningen Theoretical models in bioanalytical method development Hendriks, Geert IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from

Nadere informatie

Moderne Instrumentele Analyse

Moderne Instrumentele Analyse Moderne Instrumentele Analyse Niels Jonker Time of Flight Infrarood en Massa Spectrometrie 2 Time of flight Infrarood en Massa Spectrometrie 3 Time of flight Voordelen Nadelen Extreem Hoge Massa Range

Nadere informatie

Samenvatting Curriculum Vitae

Samenvatting Curriculum Vitae Curriculum Vitae Samenvatting Het is slechts vijftig jaar geleden dat de wetenschappers Watson en Crick, mede door kennis van het werk van Franklin, de structuur van DNA wisten te herleiden, en daarmee

Nadere informatie

TECHNIEKBLAD 17. Zeoliet adsorptie

TECHNIEKBLAD 17. Zeoliet adsorptie 89 TECHNIEKBLAD 17 Zeoliet adsorptie Synoniemen, afkortingen en/of procesnamen n.v.t. Verwijderde componenten - KWS - Solventen - NH 3 Principeschema 90 Procesbeschrijving Zeoliet is een aluminiumsilicaat

Nadere informatie

Inhoud. Scheidingsmethoden (onder- en bovenbouw)... 2 Massaspectrometrie(bovenbouw)... 3

Inhoud. Scheidingsmethoden (onder- en bovenbouw)... 2 Massaspectrometrie(bovenbouw)... 3 Scheidingsmethoden Samenvattingen Je kunt bij een onderwerp komen door op de gewenste rubriek in de inhoud te klikken. Wil je vanuit een rubriek terug naar de inhoud, klik dan op de tekst van de rubriek

Nadere informatie

Haloperidol in serum m.b.v. Triple Quad LC-MS

Haloperidol in serum m.b.v. Triple Quad LC-MS Haloperidol in serum m.b.v. Triple Quad LC-MS Richard van Rossen / Henk Trumpie Apotheek Haagse Ziekenhuizen Email: r.vanrossen@ahz.nl Inleiding Sinds februari 2007 heeft het lab van de AHZ de beschikking

Nadere informatie

ICP-MS: een veelbelovende tool in de detectie en analyse van nanodeeltjes

ICP-MS: een veelbelovende tool in de detectie en analyse van nanodeeltjes ICP-MS: een veelbelovende tool in de detectie en analyse van nanodeeltjes Nadia Waegeneers Unit Trace Elements Operational Department Chemical Safety of the Food Chain Veterinary and Agrochemical Research

Nadere informatie

Ontwikkeling van een HPLC-MS methode voor de bepaling van antioxidanten in natuurproducten

Ontwikkeling van een HPLC-MS methode voor de bepaling van antioxidanten in natuurproducten Vakgroep rganische Chemie Groep Scheidingstechnieken ntwikkeling van een HPLC-MS methode voor de bepaling van antioxidanten in natuurproducten Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master

Nadere informatie

Bloedalcoholen bepaling met GC-FID op een apolaire kolom

Bloedalcoholen bepaling met GC-FID op een apolaire kolom Bloedalcoholen bepaling met GC-FID op een apolaire kolom E Olijslager en R Langen Klinisch Farmaceutisch Laboratorium TweeSteden ziekenhuis Dr. Deelenlaan 5, 5042 AD Tiiburg. EOlyslager@zamb.tsz.nl Inleiding

Nadere informatie

Personal Purification System. 24 september 2010 Hans Sankar

Personal Purification System. 24 september 2010 Hans Sankar Personal Purification System 24 september 2010 Hans Sankar Ontwikkeling PLC 2020 Vanuit de Markt Vraag naar personalized purification system FLASH systemen werkbaar bij een hogere druk MPLC (Medium Pressure

Nadere informatie

Oefenopgaven ANALYSETECHNIEKEN

Oefenopgaven ANALYSETECHNIEKEN Oefenopgaven ANALYSETECHNIEKEN vwo Massaspectrometrie en IR-spectrometrie OPGAVE 1 MTBE is een stof die aan benzine wordt toegevoegd voor een betere verbranding (de klopvastheid wordt vergroot). Door middel

Nadere informatie

GridPix: Development and Characterisation of a Gaseous Tracking Detector W.J.C. Koppert

GridPix: Development and Characterisation of a Gaseous Tracking Detector W.J.C. Koppert GridPix: Development and Characterisation of a Gaseous Tracking Detector W.J.C. Koppert Samenvatting Deeltjes Detectie in Hoge Energie Fysica De positie waar de botsing heeft plaatsgevonden in een versneller

Nadere informatie

Geschikt voor grote monsteraantallen

Geschikt voor grote monsteraantallen ELISA (mg eiwit/kg) immunologische test PCR Flowcytometrische methoden (niet het eiwit zelf maar het DNA wordt gedetecteerd, moleculairbiologische test), DNA kwantitatieve analytische methode Specifieke

Nadere informatie

Gaschromatografie in de klas Frans Killian, ISW havo/vwo Naaldwijk, franskillian@hotmail.com

Gaschromatografie in de klas Frans Killian, ISW havo/vwo Naaldwijk, franskillian@hotmail.com Gaschromatografie in de klas Frans Killian, ISW havo/vwo Naaldwijk, franskillian@hotmail.com Waarom Gaschromatografie? Leerlingen die het voortgezet onderwijs verlaten denken vaak dat de analisten in een

Nadere informatie

Bio-farmaceutische bepaling van geneesmiddelen

Bio-farmaceutische bepaling van geneesmiddelen Bio-farmaceutische bepaling van geneesmiddelen Hoe doen we dit? Deel IIa H. Lingeman, Vrije Universiteit, Amsterdam Zoals in Deel I van deze serie is aangegeven begint de ontwikkeling van een vloeistofchromatografische

Nadere informatie

io ATerinzagelegging 7906913

io ATerinzagelegging 7906913 Octrooiraad io ATerinzagelegging 7906913 Nederland @ NL @ fj) @ @ Werkwijze en inrichting voor het tot stand brengen van een ionenstroom. Int.CI 3.: H01J37/30, H01L21/425. Aanvrager: Nederlandse Centrale

Nadere informatie

Nederlandse samenvatting

Nederlandse samenvatting Nederlandse samenvatting De afgelopen tien jaar is de belangstelling voor de levenswetenschappen sterk toegenomen en zijn de onderzoeksactiviteiten in dit veelomvattende gebied enorm gegroeid. Deze ontwikkelingen

Nadere informatie

Ontwerpen van sensoren voor de HPLC bepaling van organische anionen

Ontwerpen van sensoren voor de HPLC bepaling van organische anionen ntwerpen van sensoren voor de HPLC bepaling van organische anionen 1. Inleiding Kevin Hellemans 17 juni 2008 HPLC is een veelgebruikte methode in de analytische scheikunde en kent vele toepassingen in

Nadere informatie

Tentamen Chemische Analysemethoden. 25 oktober 2006 (14.00-17.00) Deel 2 Open boek (voor 78 punten) Beschikbare tijd: 140 minuten

Tentamen Chemische Analysemethoden. 25 oktober 2006 (14.00-17.00) Deel 2 Open boek (voor 78 punten) Beschikbare tijd: 140 minuten Tentamen Chemische Analysemethoden 25 oktober 2006 (14.00-17.00) Deel 2 Open boek (voor 78 punten) Beschikbare tijd: 140 minuten Vraag 1 Rekenen in de chemische analyse (18 punten) 1,1 Uit ruime ervaring

Nadere informatie

Studiedag : Ionenanalyse. Woensdag 24 november 2004 Hotel Serwir Koningin Astridlaan Sint-Niklaas

Studiedag : Ionenanalyse. Woensdag 24 november 2004 Hotel Serwir Koningin Astridlaan Sint-Niklaas Studiedag : Ionenanalyse Woensdag 24 november 2004 otel Serwir Koningin Astridlaan 57 9100 Sint-Niklaas Ionenchromatografie Principes en concepten E. Jooken Ion Paar hromatografie Is mogelijk met standaard

Nadere informatie

Optimalisatie van de eerste klinische studies in bi ondere patie ntengroepen: op weg naar gebruik van semifysiologische

Optimalisatie van de eerste klinische studies in bi ondere patie ntengroepen: op weg naar gebruik van semifysiologische Nederlandse samenvatting Optimalisatie van de eerste klinische studies in bi ondere patie ntengroepen: op weg naar gebruik van semifysiologische farmacokinetische modellen Algemene inleiding Klinisch onderzoek

Nadere informatie

Multi-residu analyse van geneesmiddelen in afvalwater

Multi-residu analyse van geneesmiddelen in afvalwater Multi-residu analyse van geneesmiddelen in afvalwater Leendert Vergeynst, Herman Van Langenhove, Kristof Demeestere EnVOC ENVIRONMENTAL ORGANIC CHEMISTRY & TECHNOLOGY RESEARCH GROUP ENVOC Vakgroep duurzame

Nadere informatie

Figuur 1. Representatie van de dubbele helix en de structuren van de verschillende basen.

Figuur 1. Representatie van de dubbele helix en de structuren van de verschillende basen. Het DNA molecuul is verantwoordelijk voor het opslaan van de genetische informatie die gebruikt wordt voor de ontwikkeling en het functioneren van levende organismen. Aangezien het de instructies voor

Nadere informatie

Van STIP chromatografie naar SPE extractie is een kleine stap...

Van STIP chromatografie naar SPE extractie is een kleine stap... Van STIP chromatografie naar SPE extractie is een kleine stap... Als het verhaal in het vorige extract begrepen is dan klinkt de titel van dit hoofdstuk niet zo vreemd. Uitgelegd is dat de zure/neutrale

Nadere informatie

Fractionatie van lipideklassen in biologische vloeistoffen

Fractionatie van lipideklassen in biologische vloeistoffen Vakgroep rganische Chemie nderzoeksgroep Scheidingstechnieken Fractionatie van lipideklassen in biologische vloeistoffen Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in de Chemie door

Nadere informatie

Nieuwe resultaten van de zoektocht naar het Higgs deeltje in ATLAS

Nieuwe resultaten van de zoektocht naar het Higgs deeltje in ATLAS Nieuwe resultaten van de zoektocht naar het Higgs deeltje in ATLAS Op 4 juli 2012 presenteerde het ATLAS experiment een update van de actuele resultaten van de zoektocht naar het Higgs deeltje. Dat gebeurde

Nadere informatie

Samenvatting. Samenvatting

Samenvatting. Samenvatting Samenvatting In dit proefschrift worden de ontwikkeling en validatie van LC-MS/MS methoden voor de kwantitatieve bioanalyse van cytostatica beschreven. Het bepalen van deze klasse van geneesmiddelen in

Nadere informatie

Samenvatting Zure gassen zijn veelvuldig aanwezig in verschillende concentraties in industriële gassen. Deze moeten vaak verwijderd worden vanwege corrosie preventie, operationele, economische en/of milieu

Nadere informatie

- Validatiedossier - Bepaling van de lipofiele groep toxinen in mosselen met gebruik van UPLC-MS/MS 1 INTRODUCTIE...1 2 MATRIX EFFECT...

- Validatiedossier - Bepaling van de lipofiele groep toxinen in mosselen met gebruik van UPLC-MS/MS 1 INTRODUCTIE...1 2 MATRIX EFFECT... 1 INTRODUCTIE...1 2 MATRIX EFFECT...1 3 LINEARITEIT...2 4 JUISTHEID EN HELHAARBARHEID...5 4.1 Juistheid... 5 4.2 Juistheid van meervoudige analyses van gecertificeerd referentiemateriaal (CRM)... 5 4.3

Nadere informatie

Eindronde Natuurkunde Olympiade 2014 theorietoets deel 1

Eindronde Natuurkunde Olympiade 2014 theorietoets deel 1 Eindronde Natuurkunde Olympiade 2014 theorietoets deel 1 Opgave 1 Fata Morgana (3p) We hebben een planparallelle plaat met een brekingsindex n(z), die met de afstand z varieert. Zie ook de figuur. a. Toon

Nadere informatie

Samenvatting S AMENVATTING

Samenvatting S AMENVATTING S AMENVATTING De beschikbaarheid van voldoende drinkwater kan een probleem zijn in dichtbevolkte of industriële gebieden, zodat waterzuiveringsinstallaties noodzakelijk zijn. Adsorptie technologie kan

Nadere informatie

Samenvatting. Samenvatting

Samenvatting. Samenvatting Samenvatting Het tablet is om vele redenen een populaire toedieningsvorm van geneesmiddelen. Het gebruikersgemak en het gemak waarmee ze grootschalig kunnen worden geproduceerd zijn slechts twee van de

Nadere informatie

Biofysische Scheikunde: NMR-Spectroscopie

Biofysische Scheikunde: NMR-Spectroscopie Chemische Uitwisseling Chemische Uitwisseling (Chemical Exchange) Vrije Universiteit Brussel 7 mei 2012 Chemische Uitwisseling Outline 1 Chemische Uitwisseling 2 Outline Chemische Uitwisseling 1 Chemische

Nadere informatie

toelatingsexamen-geneeskunde.be Vraag 2 Wat is de ph van een zwakke base in een waterige oplossing met een concentratie van 0,1 M?

toelatingsexamen-geneeskunde.be Vraag 2 Wat is de ph van een zwakke base in een waterige oplossing met een concentratie van 0,1 M? Chemie juli 2009 Laatste wijziging: 31/07/09 Gebaseerd op vragen uit het examen. Vraag 1 Geef de structuurformule van nitriet. A. B. C. D. Vraag 2 Wat is de ph van een zwakke base in een waterige oplossing

Nadere informatie

Samengesteld door Werner Poets. Nagelezen en aangevuld door het Belgische Instituut voor Ruimte-Aeronomie (BIRA), dr.

Samengesteld door Werner Poets. Nagelezen en aangevuld door het Belgische Instituut voor Ruimte-Aeronomie (BIRA), dr. 1 Rosetta, een venster op onze oorsprong, een springplank naar de toekomst Samengesteld door Werner Poets Nagelezen en aangevuld door het Belgische Instituut voor Ruimte-Aeronomie (BIRA), dr. Johan De

Nadere informatie

Gassnelheid en volume metingen. Deze code van goede meetpraktijk beschrijft de toegepaste. werkwijze bij de meting voor gassnelheid en volume

Gassnelheid en volume metingen. Deze code van goede meetpraktijk beschrijft de toegepaste. werkwijze bij de meting voor gassnelheid en volume Code van goede meetpraktijk van de VKL (Vereniging Kwaliteit Luchtmetingen) Wat doet de VKL? De Vereniging Kwaliteit Luchtmetingen (VKL) heeft ten doel, binnen de kaders van de Europese en Nationale wet-

Nadere informatie

Tentamen Statistische Thermodynamica MS&T 27/6/08

Tentamen Statistische Thermodynamica MS&T 27/6/08 Tentamen Statistische Thermodynamica MS&T 27/6/08 Vraag 1. Toestandssom De toestandssom van een systeem is in het algemeen gegeven door de volgende uitdrukking: Z(T, V, N) = e E i/k B T. i a. Hoe is de

Nadere informatie

BEPALING VAN DOXYCYCLINE, TETRACYCLINE, OXYTETRACYCLINE EN CHLOORTETRACYCLINE IN

BEPALING VAN DOXYCYCLINE, TETRACYCLINE, OXYTETRACYCLINE EN CHLOORTETRACYCLINE IN Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-091 I-MET-FLVVT-091 BEPALING VAN DOXYCYCLINE, TETRACYCLINE, OXYTETRACYCLINE EN CHLOORTETRACYCLINE IN DIERENVOEDERS

Nadere informatie

Three-Dimensional Visualization of Contact Networks in Granular Material C.E. Carpentier

Three-Dimensional Visualization of Contact Networks in Granular Material C.E. Carpentier Three-Dimensional Visualization of Contact Networks in Granular Material C.E. Carpentier Samenvatting 10 190 Hoofdstuk 10 Driedimensionale visualisatie van contactnetwerken in granulair materiaal Het onderzoek

Nadere informatie

Viscositeit. par. 1 Inleiding

Viscositeit. par. 1 Inleiding Viscositeit par. 1 Inleiding Viscositeit is een eigenschap van vloeistoffen (en van gassen) die aangeeft hoe ondoordringbaar de vloeistof is voor een vast voorwerp. Anders gezegd met de grootheid viscositeit

Nadere informatie

Cover Page. The handle http://hdl.handle.net/1887/23854 holds various files of this Leiden University dissertation.

Cover Page. The handle http://hdl.handle.net/1887/23854 holds various files of this Leiden University dissertation. Cover Page The handle http://hdl.handle.net/1887/23854 holds various files of this Leiden University dissertation. Author: Marel, Sander van der Title: Gene and cell therapy based treatment strategies

Nadere informatie

Bepaling van de elektrische geleidbaarheid

Bepaling van de elektrische geleidbaarheid Bepaling van de elektrische geleidbaarheid april 2006 Pagina 1 van 8 WAC/III/A/004 INHOUD 1 TOEPASSINGSGEBIED... 3 2 DEFINITIES... 3 2.1 SPECIFIEKE GELEIDBAARHEID, ELEKTRISCHE GELEIDBAARHEID (γ)... 3 2.2

Nadere informatie

10 Materie en warmte. Onderwerpen. 3.2 Temperatuur en warmte.

10 Materie en warmte. Onderwerpen. 3.2 Temperatuur en warmte. 1 Materie en warmte Onderwerpen - Temperatuur en warmte. - Verschillende temperatuurschalen - Berekening hoeveelheid warmte t.o.v. bepaalde temperatuur. - Thermische geleidbaarheid van een stof. - Warmteweerstand

Nadere informatie

Hertentamen Statistische en Thermische Fysica II Woensdag 14 februari 2007 Duur: 3 uur

Hertentamen Statistische en Thermische Fysica II Woensdag 14 februari 2007 Duur: 3 uur Hertentamen Statistische en Thermische Fysica II Woensdag 14 februari 2007 Duur: 3 uur Vermeld op elk blad duidelijk je naam, studierichting, en evt. collegekaartnummer! (TIP: lees eerst alle vragen rustig

Nadere informatie

Intermezzo, De expressie van een eiwit.

Intermezzo, De expressie van een eiwit. Samenvatting Bacteriën leven in een omgeving die voortdurend en snel verandert. Om adequaat te kunnen reageren op deze veranderingen beschikken bacteriën over tal van sensor systemen die de omgeving in

Nadere informatie

ANORGANISCHE ANALYSEMETHODEN/WATER GELEIDBAARHEID

ANORGANISCHE ANALYSEMETHODEN/WATER GELEIDBAARHEID 1 TOEPASSINGSGEBIED GELEIDBAARHEID Deze procedure beschrijft de bepaling van de elektrische geleidbaarheid in water (bijvoorbeeld grondwater, eluaten, ). De beschreven methode is bruikbaar voor alle types

Nadere informatie

Vitaminen. Definitie. Classificatie en functie

Vitaminen. Definitie. Classificatie en functie Vitaminen Definitie Vitaminen zijn essentiële organische voedingsstoffen, die in tegenstelling tot andere voedingsstoffen (koolhydraten, vetten, eiwitten) geen energie of bouwstoffen leveren, maar die

Nadere informatie

Chromatografische experimenten met een SPE kolom

Chromatografische experimenten met een SPE kolom Chromatografische experimenten met een SPE kolom Frans Killian, juni 2007 www.nano2.nl/spe.pdf Kleine Solid Phase Extraction kolommetjes voor preparatieve vloeistofchromatografie zijn te koop met verschillende

Nadere informatie

Nederlandse samenvatting voor geïnteresseerden buiten dit vakgebied

Nederlandse samenvatting voor geïnteresseerden buiten dit vakgebied Nederlandse samenvatting voor geïnteresseerden buiten dit vakgebied Modellen Lego voor het leven Wij mensen houden van modellen. Als kinderen beginnen wij de opbouw van dingen te begrijpen door ze met

Nadere informatie

BEPALING VAN LASALOCID-NATRIUM IN DIERENVOEDERS (HPLC)

BEPALING VAN LASALOCID-NATRIUM IN DIERENVOEDERS (HPLC) Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-005 I-MET-FLVVT-005 BEPALING VAN LASALOCID-NATRIUM IN DIERENVOEDERS (HPLC) Versie 04 Datum van toepassing 2014-01-27

Nadere informatie

XIII. Samenvatting. Samenvatting

XIII. Samenvatting. Samenvatting XIII In dit werk wordt de invloed van dimethyldisulfide (DMDS) en van zeven potentiële additieven op het stoomkraken van n-hexaan onderzocht aan de hand van experimenten in een continu volkomen gemengde

Nadere informatie

b In plaats van een CN-kolom gebruikt men een C-18-kolom. Stationaire fase minder polair: retentietijd langer.

b In plaats van een CN-kolom gebruikt men een C-18-kolom. Stationaire fase minder polair: retentietijd langer. Hoofdstuk 20 Hoge druk vloeistofhromatografie (HPLC) bladzijde 1 pgave 1 In welke volgorde elueren de onderstaande omponenten bij normal phase? a otaanzuur C 7H 15CH langste apolaire staart: alkyl met

Nadere informatie

Vloeistof-vloeistof. Vriesdrogen E.a. Chromatografie

Vloeistof-vloeistof. Vriesdrogen E.a. Chromatografie Bio-analytische strategieën met behulp van hoge druk vloeistofchromatografie: deel I H. Lingeman vakgroep Analytische Chemie, Vrije Universiteit, De Boelelaan 1083, 1081 HV Amsterdam In deel I van dit

Nadere informatie

Theory DutchBE (Belgium) De grote hadronen botsingsmachine (LHC) (10 punten)

Theory DutchBE (Belgium) De grote hadronen botsingsmachine (LHC) (10 punten) Q3-1 De grote hadronen botsingsmachine (LHC) (10 punten) Lees eerst de algemene instructies in de aparte envelop alvorens te starten met deze vraag. In deze opdracht wordt de fysica van de deeltjesversneller

Nadere informatie

Bloedalcoholenbepaling met GC-FID en de medium polaire DB-6

Bloedalcoholenbepaling met GC-FID en de medium polaire DB-6 Bloedalcoholenbepaling met GC-FID en de medium polaire DB-6 Hai Holthuysen, Hay Janssen, Josje Hermkens-Laemers Laboratorium apotheek Viecuri Medisch Centrum voor Noord-Limburg Tegelseweg 210 5912 BL Venlo

Nadere informatie

Meten en Monitoren. Weet wat je meet. Startsymposium Expertisecentrum PFOS. Virtualisatie project Omegam Eline Klooster.

Meten en Monitoren. Weet wat je meet. Startsymposium Expertisecentrum PFOS. Virtualisatie project Omegam Eline Klooster. Meten en Monitoren Weet wat je meet Inhoud presentatie Omegam Laboratoria Proces ontwikkelen analyse methoden De analyse /PFOA Prestatiekenmerken /PFOA bij Omegam De praktijk : Weet wat je meet Omegam

Nadere informatie

Gearchiveerde versie

Gearchiveerde versie Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen FLVVT I-MET-FLVVT-124 I-MET-FLVVT-124 BEPALING VAN COCCIDIOSTATICA IN DIERENVOEDER MET LC- MS-MS Versie 06 Datum van toepassing 2014-01-21 Opgesteld

Nadere informatie

De twee snelheidsconstanten hangen op niet identieke wijze af van de temperatuur.

De twee snelheidsconstanten hangen op niet identieke wijze af van de temperatuur. In tegenstelling tot een verandering van druk of concentratie zal een verandering in temperatuur wel degelijk de evenwichtsconstante wijzigen, want C k / k L De twee snelheidsconstanten hangen op niet

Nadere informatie

NATIONALE SCHEIKUNDEOLYMPIADE

NATIONALE SCHEIKUNDEOLYMPIADE NATINALE SHEIKUNDELYMPIADE RRETIEMDEL VRRNDE 1 (de week van) woensdag 4 februari 2009 Deze voorronde bestaat uit 24 meerkeuzevragen verdeeld over 5 onderwerpen en 3 open vragen met in totaal 13 deelvragen

Nadere informatie

Glyfosaat in al zijn toestanden

Glyfosaat in al zijn toestanden Glyfosaat in al zijn toestanden S. Goscinny en V. Hanot Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid Dienst pesticiden Een succesvolle molecule Sinds glyfosaat in 1974 voor het eerst op de markt kwam, is

Nadere informatie

QUARK_5-Thema-01-elektrische kracht Blz. 1

QUARK_5-Thema-01-elektrische kracht Blz. 1 QUARK_5-Thema-01-elektrische kracht Blz. 1 THEMA 1: elektrische kracht Elektriciteit Elektrische lading Lading van een voorwerp Fenomeen: Sommige voorwerpen krijgen een lading door wrijving. Je kan aan

Nadere informatie

Dimensies, eenheden en de Maxwell vergelijkingen

Dimensies, eenheden en de Maxwell vergelijkingen Dimensies, eenheden en de Maxwell vergelijkingen Alexander Sevrin 1 Inleiding De keuze van dimensies en eenheden in het elektromagnetisme is ver van eenduidig. Hoewel het SI systeem één en ander ondubbelzinnig

Nadere informatie

Samenvatting. Het gebruik van ultrafiltratie (UF) membranen als oppervlakte water zuiveringstechnologie

Samenvatting. Het gebruik van ultrafiltratie (UF) membranen als oppervlakte water zuiveringstechnologie Samenvatting Het gebruik van ultrafiltratie (UF) membranen als oppervlakte water zuiveringstechnologie is in de laatste vijftien jaar enorm toe genomen. Ultrafiltratie membranen zijn gemakkelijk op te

Nadere informatie

5 Water, het begrip ph

5 Water, het begrip ph 5 Water, het begrip ph 5.1 Water Waterstofchloride is een sterk zuur, het reageert als volgt met water: HCI(g) + H 2 0(I) Cl (aq) + H 3 O + (aq) z b Hierbij reageert water als base. Ammoniak is een zwakke

Nadere informatie

Compendium Lucht. Validatie Dossier De kwantitatieve bepaling van op XAD-7 geadsorbeerde DIOLEN met GC-FID

Compendium Lucht. Validatie Dossier De kwantitatieve bepaling van op XAD-7 geadsorbeerde DIOLEN met GC-FID Compendium Lucht Validatie Dossier De kwantitatieve bepaling van op XAD-7 geadsorbeerde DIOLEN met GC-FID M. Spruyt, D. Poelmans, L. Verbeke 2005/MIM/R/xxx Expertisecentrum Milieumetingen April 2005 INHOUDSTAFEL

Nadere informatie

The Color of X-rays. Spectral Computed Tomography Using Energy Sensitive Pixel Detectors E.J. Schioppa

The Color of X-rays. Spectral Computed Tomography Using Energy Sensitive Pixel Detectors E.J. Schioppa The Color of X-rays. Spectral Computed Tomography Using Energy Sensitive Pixel Detectors E.J. Schioppa Samenvatting Het netvlies van het oog is niet gevoelig voor deze straling: het oog dat vlak voor het

Nadere informatie

7 College 01/12: Electrische velden, Wet van Gauss

7 College 01/12: Electrische velden, Wet van Gauss 7 College 01/12: Electrische velden, Wet van Gauss Berekening van electrische flux Alleen de component van het veld loodrecht op het oppervlak draagt bij aan de netto flux. We definieren de electrische

Nadere informatie

De kwantitatieve bepaling van op koolstof moleculaire zeef geadsorbeerde alcoholen met GC-MS

De kwantitatieve bepaling van op koolstof moleculaire zeef geadsorbeerde alcoholen met GC-MS Compendium voor de monsterneming, meting en analyse van lucht De kwantitatieve bepaling van op koolstof moleculaire zeef geadsorbeerde alcoholen met GC-MS Versie mei 2013 LUC/IV/009 INHOUD Inhoud 1 Toepassingsgebied

Nadere informatie

Pesticidenanalyse: methodevertaling van bodem naar appel. Marina Vanhecke Lab 4 U

Pesticidenanalyse: methodevertaling van bodem naar appel. Marina Vanhecke Lab 4 U Pesticidenanalyse: methodevertaling van bodem naar appel Marina Vanhecke Lab 4 U Kerncijfers KHLim 6000 studenten en 700 personeelsleden 4 campussen 6 departementen 30 bacheloropleidingen + 11 masters

Nadere informatie

Samenvatting in het Nederlands

Samenvatting in het Nederlands Samenvatting in het Nederlands SAMENVATTING IN HET NEDERLANDS Geavanceerde scheidingstechnieken zijn niet meer weg te denken uit de hedendaagse analytische chemie en spelen een centrale rol in de farmaceutische

Nadere informatie

Nederlandse samenvatting

Nederlandse samenvatting Nederlandse samenvatting Nederlandse samenvatting Om te kunnen overleven moeten micro-organismen voedingsstoffen opnemen uit hun omgeving en afvalstoffen uitscheiden. Het inwendige van een cel is gescheiden

Nadere informatie

/14 /28 /28 /30 /100. Naam:.. Studentnr.:.. Resultaten: Totaal: Opgave 1 Opgave 2 Opgave 3 Opgave 4

/14 /28 /28 /30 /100. Naam:.. Studentnr.:.. Resultaten: Totaal: Opgave 1 Opgave 2 Opgave 3 Opgave 4 Tentamen: Fysische Chemie en Kinetiek (4052FYSCK-1415FWN) Datum: 17-4-2015 Tijd/tijdsduur: 9:00-12:00; 3 uur Plaats: Grote en Kleine Pastizaal, ChemE, Delft Docent(en) en/of tweede lezer: Prof. dr. M.T.M.

Nadere informatie

KWANTITATIEVE BEPALING VAN UBIQUINONE IN

KWANTITATIEVE BEPALING VAN UBIQUINONE IN Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-152 I-MET-FLVVT-152 KWANTITATIEVE BEPALING VAN UBIQUINONE IN Versie 03 Datum van toepassing 2014-01-17 Opgesteld

Nadere informatie

Examen C.I.T. - Eerste zit 2002-2003. Theorie

Examen C.I.T. - Eerste zit 2002-2003. Theorie Examen C.I.T. - Eerste zit 2002-2003 Theorie Geef van alle grootheden de betekenis en de dimensie!!! 1. Destillatie Deze vraag handelt over een multicomponentrectificatie. - Definieer de begrippen sleutelcomponenten

Nadere informatie

1. Weten wat potentiaal en potentiaalverschil is 2. Weten wat capaciteit en condensator is 3. Kunnen berekenen van een vervangingscapaciteit

1. Weten wat potentiaal en potentiaalverschil is 2. Weten wat capaciteit en condensator is 3. Kunnen berekenen van een vervangingscapaciteit Hoofdstuk 2 Elektrostatica Doelstellingen 1. Weten wat potentiaal en potentiaalverschil is 2. Weten wat capaciteit en condensator is 3. Kunnen berekenen van een vervangingscapaciteit 2.1 Het elektrisch

Nadere informatie

De waterconstante en de ph

De waterconstante en de ph EVENWICHTEN BIJ PROTOLYSEREACTIES De waterconstante en de ph Water is een amfotere stof, dat wil zeggen dat het zowel zure als basische eigenschappen heeft. In zuiver water treedt daarom een reactie van

Nadere informatie

Nederlandse samenvatting

Nederlandse samenvatting In dit hoofdstuk zal ik voor niet-ingewijden uitleggen wat ik tijdens mijn promotie-onderzoek heb bestudeerd en wat de resultaten en perspectieven van het onderzoek zijn. Elk levend organisme bestaat uit

Nadere informatie

Verschillen tussen capillaire en gel electroforese. Joke Boonstra Corrie de Kat Angelino Janneke Ruinemans-Koerts Ina Klasen.

Verschillen tussen capillaire en gel electroforese. Joke Boonstra Corrie de Kat Angelino Janneke Ruinemans-Koerts Ina Klasen. Verschillen tussen capillaire en gel electroforese Joke Boonstra Corrie de Kat Angelino Janneke Ruinemans-Koerts Ina Klasen 13 oktober 2009 1 M-Proteïne diagnostiek Technieken Gel electroforese (AGE) Principe

Nadere informatie

Viscositeit. par. 1 Inleiding

Viscositeit. par. 1 Inleiding Viscositeit par. 1 Inleiding Viscositeit is een eigenschap van vloeistoffen (en van gassen) die aangeeft hoe ondoordringbaar de vloeistof is voor een vast voorwerp. Anders gezegd met de grootheid viscositeit

Nadere informatie

Studentnummer: Schrijf je naam en studentnummer op elk vel. Omcirkel het juiste antwoord.

Studentnummer: Schrijf je naam en studentnummer op elk vel. Omcirkel het juiste antwoord. Naam: Studentnummer: FLP1 Tentamen 31 05 2013, 14:00 17:00h Dit tentamen bestaat uit 25 opgaven op 6 bladzijden. Schrijf je naam en studentnummer op elk vel. Omcirkel het juiste antwoord. Je mag boek,

Nadere informatie

Eindronde Natuurkunde Olympiade 2015 theorietoets deel 1

Eindronde Natuurkunde Olympiade 2015 theorietoets deel 1 Eindronde Natuurkunde Olympiade 2015 theorietoets deel 1 Opgave 1 Botsend blokje (5p) Een blok met een massa van 10 kg glijdt over een glad oppervlak. Hoek D botst tegen een klein vastzittend blokje S

Nadere informatie

Samenvatting Vrij vertaald luidt de titel van dit proefschrift: "Ladingstransport in dunne- lm transistoren gebaseerd op geordende organische halfgeleiders". Alvorens in te gaan op de specieke resultaten

Nadere informatie

5.1.2. Hoge druk vloeistofchromatografie

5.1.2. Hoge druk vloeistofchromatografie 5.1.2. Hoge druk vloeistofchromatografie Analytische vloeistofchromatografie gebeurt meestal in stalen kolommen met kleine partikels onder hoge druk. Deze techniek, aangeduid als 'High Pressure Liquid

Nadere informatie

Chromatografie Auteur: Michel Eppink (Wageningen Universiteit)

Chromatografie Auteur: Michel Eppink (Wageningen Universiteit) Chromatografie Auteur: Michel Eppink (Wageningen Universiteit) Basisprincipe van chromatografische scheidingen Scheidingen van componenten (b.v. eiwitten) kan gebeuren via twee verschillende fasen zoals

Nadere informatie

Aanvulling hoofdstuk 1 uitwerkingen

Aanvulling hoofdstuk 1 uitwerkingen Natuur-scheikunde Aanvulling hoofdstuk 1 uitwerkingen Temperatuur in C en K Metriek stelsel voorvoegsels lengtematen, oppervlaktematen, inhoudsmaten en massa Eenheden van tijd 2 Havo- VWO H. Aelmans SG

Nadere informatie

CHAPTER 10 NEDERLANDSE SAMENVATTING

CHAPTER 10 NEDERLANDSE SAMENVATTING CHAPTER 10 NEDERLANDSE SAMENVATTING Chapter 10 156 Dit proefschrift bestaat uit een aantal studies waarin de veranderingen in het vermogen van plasma om de uitstroom (efflux) van cholesterol uit cellen

Nadere informatie

Autobiografisch geheugen in longitudinaal perspectief

Autobiografisch geheugen in longitudinaal perspectief Samenvatting Autobiografisch geheugen in longitudinaal perspectief Stabiliteit en verandering in gerapporteerde levensgebeurtenissen over een periode van vijf jaar Het belangrijkste doel van dit longitudinale,

Nadere informatie

GEPE. Deeltoets 1 CURSUSJAAR 2015-2016. 28 september 2015. 13.30-16.00 uur

GEPE. Deeltoets 1 CURSUSJAAR 2015-2016. 28 september 2015. 13.30-16.00 uur GEPE Deeltoets 1 CURSUSJAAR 2015-2016 28 september 2015 13.30-16.00 uur Naam: (in blokletters) Registratienummer 1. Begin met je naam en overige gegevens in te vullen. 2. Gebruik voor de beantwoording

Nadere informatie

Thermische Desorptie als alternatief voor Solventextractie

Thermische Desorptie als alternatief voor Solventextractie Perspectieven in de Organische Milieuanalyse Grobbendonk - 14 oktober 2005 Thermische Desorptie als alternatief voor Solventextractie Dr. Gilbert Desmet Vlaamse Milieumaatschappij Labo Gent Krijgslaan

Nadere informatie

Analysemethoden voor voeding

Analysemethoden voor voeding Analysemethoden voor voeding Recente ontwikkelingen 170 x 240 mm ca. 240 pagina s verschijnt in september 2005 prijs: 34,95 euro ISBN 90 209 6140 3 INHOUD Hoofdstuk 1. Monstervoorbereiding 1.1 Belang van

Nadere informatie

natuurkunde Compex natuurkunde 1,2 Compex

natuurkunde Compex natuurkunde 1,2 Compex Examen VWO 2010 tijdvak 1 vrijdag 21 mei totale examentijd 3 uur tevens oud programma natuurkunde Compex natuurkunde 1,2 Compex Vragen 1 tot en met 13 In dit deel van het examen staan vragen waarbij de

Nadere informatie

Versie 03 Datum van toepassing 2014-04-28

Versie 03 Datum van toepassing 2014-04-28 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-055 I-MET-FLVVT-055 BEPALING VAN RUW VET IN DIERENVOEDERS Versie 03 Datum van toepassing 2014-04-28 Opgesteld

Nadere informatie