Bijsluiter QuantiFERON -TB Gold (QFT ) ELISA 2 x 96 (catalogusnr )

Transcriptie

1 Bijsluiter QuantiFERON -TB Gold (QFT ) ELISA 2 x 96 (catalogusnr ) 20 x 96 (catalogusnr ) De volbloed IFN-γ-test meet reacties op peptide-antigenen ESAT-6, CFP-10 en TB7.7(p4) Voor in-vitrodiagnostisch gebruik , Cellestis, een bedrijf van QIAGEN Level 2, Office Tower 2, Chadstone Centre 1341 Dandenong Road, Chadstone, Victoria, 3148 Australië Telefoon: (Australië) QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse Hilden, DUITSLAND NL Rev

2

3 Inhoudsopgave 1. Beoogd gebruik 4 2. Samenvatting en uitleg van de test 4 Uitgangspunten van de test 5 Benodigde tijd voor het uitvoeren van de assay 5 3. Onderdelen en opslag 6 Benodigde maar niet meegeleverde materialen 7 Opslag en verwerking 7 4. Waarschuwingen en voorzorgsmaatregelen 8 Voor in-vitrodiagnostisch gebruik 8 Waarschuwingen 8 Voorzorgsmaatregelen 9 5. Specimenafname en -behandeling Richtlijnen voor gebruik 12 Fase 1 - Incubatie van bloed en verzamelen van plasma 12 Fase 2 Menselijk IFN-γ ELISA Berekeningen en interpretatie van de test 17 Genereren van de standaardcurve 17 Kwaliteitscontrole van de test Beperkingen Kwaliteitskenmerken 20 Klinisch onderzoek Technische informatie 23 Onbepaalde resultaten 23 Gestolde plasmamonsters 23 Handleiding voor het oplossen van problemen Literatuur Technische service Verkorte testprocedure 29 Fase 1 Incubatie van bloed 29 Fase 2 ELISA van IFN-γ 29 Belangrijke wijzigingen 31 Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/2013 3

4 1. Beoogd gebruik QuantiFERON-TB Gold (QFT ) is een diagnostische in-vitrotest waarbij gebruik wordt gemaakt van een peptidecocktail die de proteïnen ESAT-6, CFP-10 en TB7.7(p4) simuleert en cellen in gehepariniseerd volbloed stimuleert. Detectie van interferon-γ (IFN-γ) met ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) wordt gebruikt ter herkenning van in-vitro reacties op deze peptide-antigenen, die worden geassocieerd met een Mycobacterium tuberculosis-infectie. QFT is een indirecte test voor het aantonen van een M. tuberculosis-infectie (inclusief de actieve aandoening). De testresultaten zijn bedoeld om te worden gebruikt voor risicobeoordeling, röntgenonderzoeken en overige medische en diagnostische onderzoeken. 2. Samenvatting en uitleg van de test Tuberculose is een besmettelijke ziekte die wordt veroorzaakt door een infectie met organismen van het M. tuberculosis-complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum), die doorgaans naar nieuwe gastheren wordt overgebracht via druppelinfectie door personen die lijden aan tuberculose van de luchtwegen. Bij nieuw besmette patiënten kan de ziekte tuberculose binnen weken of maanden optreden, maar bij de meeste geïnfecteerden treden geen klachten op. Bij sommigen is sprake van een latente tuberculose-infectie (LTBI), een niet-besmettelijke, asymptomatische aandoening die pas na maanden of jaren kan uitbreken. Het hoofddoel van het diagnosticeren van LTBI is het in overweging nemen van medische behandeling ter voorkoming van de ziekte tuberculose. Tot voor kort was de tuberculine-huidtest (Tuberculin skin Test, TST) de enige beschikbare methode voor het diagnosticeren van LTBI. De gevoeligheid van de huid voor tuberculine ontstaat 2 tot 10 weken na de infectie. Sommige geïnfecteerde personen reageren echter niet op tuberculine, waaronder bijvoorbeeld patiënten met een ontregelde immuunreactie als gevolg van een breed scala van andere aandoeningen, maar ook patiënten zonder zulke storingen. Omgekeerd zijn er personen die met grote waarschijnlijkheid niet aan een M. tuberculosis-infectie lijden maar gevoelig zijn voor tuberculine en positieve TST-resultaten vertonen na vaccinatie met de bacillus Calmette-Guérin (BCG), na infectie met andere mycobacteriën dan M. tuberculosis-complex of andere onbekende factoren. LTBI moet worden onderscheiden van de ziekte tuberculose, waarvoor een meldplicht bestaat en die doorgaans de longen en de onderste luchtwegen aantast, hoewel er ook andere orgaansystemen kunnen worden aangetast. De ziekte tuberculose wordt gediagnosticeerd op grond van historische, fysieke, radiologische, histologische en mycobacteriologische bevindingen. QFT is een test voor celgemedieerde immuunreacties (CMI) op peptide-antigenen die mycobacteriële proteïnen simuleren. Deze proteïnen, ESAT-6, CFP-10 en TB7.7(p4), ontbreken in alle BCG-stammen en de meeste niet-tuberculeuze mycobacteriën met uitzondering van M. kansasii, M. szulgai en M. marinum.(1) In het bloed van personen die besmet zijn met organismen van het M. tuberculosiscomplex bevinden zich in het algemeen lymfocyten die deze en andere mycobacteriële antigenen signaleren. Bij dit herkenningsproces wordt het cytokine IFN-γ geproduceerd en afgescheiden. De detectie en de erop volgende kwantificering van IFN-γ vormen de grondslag voor deze test. De in de QFT-test gebruikte antigenen zijn een peptidecocktail die de proteïnen ESAT-6, GVB-10 en TB7.7(p4) simuleert. Talrijke studies hebben aangetoond dat deze peptide-antigenen de IFN-γ-reactie in de T-cellen stimuleren van personen die met M. tuberculosis zijn geïnfecteerd, maar niet de T-cellen van niet-geïnfecteerde of met BCG gevaccineerde personen zonder het risico van tuberculose of LTBI.(1 32) Wel kan de IFN-γ-reactie potentieel worden beperkt door medische behandelingen of aandoeningen die een nadelige invloed op de immuunfunctie hebben. Patiënten met bepaalde andere mycobacteriële infecties kunnen eveneens reageren op ESAT-6, CFP-10 en TB7.7(p4), 4 Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/2013

5 zoals de genen die deze proteïnen coderen ook aanwezig zijn in M. kansasii, M. szulgai en M. marinum.(1, 23) De QFT-test is zowel een test voor LTBI als een handig hulpmiddel voor het diagnosticeren van infectie met M. tuberculosis-complex bij zieke patiënten. Een positief testresultaat ondersteunt de diagnose van tuberculose, maar kan ook zijn opgeroepen door infecties met andere mycobacteriën (bijv. M. kansasii). Andere medische en diagnostische onderzoeken zijn vereist om de ziekte tuberculose te kunnen bevestigen of uitsluiten. Uitgangspunten van de test Het QFT-systeem omvat speciale bloedafnamebuisjes, waarin de volbloedmonsters worden genomen. De aansluitende incubatie van het bloed in het buisje duurt 16 tot 24 uur. Daarna wordt het plasma geëxtraheerd en getest op de aanwezigheid van IFN-γ dat is gevormd in reactie op de peptideantigenen. De QFT-test bestaat uit twee stappen. Eerst wordt volbloed verzameld in de QFT-bloedafnamebuisjes, bestaande uit een buisje voor nulcontrole, een buisje voor TB-antigenen en een mitogeenbuisje. Het mitogeenbuisje wordt in de QFT-test gebruikt als een positieve controle. Dit kan in het bijzonder gerechtvaardigd zijn als er twijfel bestaat ten aanzien van de immuunstatus van de patiënt. Het mitogeenbuisje kan ook dienen ter controle van de correcte omgang met het bloedmonster en voor de juiste incubatie. De buisjes dienen zo snel mogelijk bij 37 C te worden geïncubeerd, maar beslist binnen 16 uur na de bloedafname. Na een incubatieperiode van 16 tot 24 uur worden de buisjes gecentrifugeerd, wordt het plasma verwijderd en wordt de hoeveelheid IFN-γ (IE/ml) gemeten met behulp van de ELISA-methode. Het testresultaat wordt als positief beschouwd voor de IFN-γ-reactie op het TB-antigeenbuisje als deze waarde aanmerkelijk boven de waarde van de nulcontrole (IFN-γ in IE/ml) ligt. Bij gebruik van het mitogeenbuisje dient het mitogeen-geactiveerde plasmamonster als IFN-γ-positieve controle voor elk getest monster. Een lage respons op mitogeen (<0,5 IE/ml) duidt op een gemiddeld resultaat wanneer een bloedmonster tevens een negatieve respons te zien geeft op de TB-antigenen. Dit beeld kan optreden bij onvoldoende lymfocyten, een verminderde lymfocytenactiviteit vanwege een onjuiste behandeling van de monsters, onjuist vullen of mengen van het mitogeenbuisje of het feit dat de lymfocyten geen IFN-γ kunnen produceren. Het nulmonster omvat een correctie voor nietspecifieke achtergrondreacties, heterofiele antilichaameffecten of niet-specifiek IFN-γ in bloedmonsters. De IFN-γ-waarde in het nulbuisje wordt afgetrokken van de IFN-γ-waarde voor het TB-antigeenbuisje en het mitogeenbuisje (indien gebruikt). Benodigde tijd voor het uitvoeren van de assay De geschatte benodigde tijd voor het uitvoeren van de QFT-assay wordt hieronder gegeven. Tevens wordt de tijd aangegeven voor het testen van meerdere gegroepeerde monsters: Incubatie bij 37 C van buisjes met bloed: ELISA: 16 tot 24 uur Circa 3 uur per ELISA-plaat (28 tot 44 individuen) <1 uur arbeidstijd 10 tot 15 minuten toevoegen voor elke extra plaat Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/2013 5

6 3. Onderdelen en opslag Blood Collection Tubes (Bloedafnamebuisjes)* 300 buisjes 200 buisjes 100 buisjes Catalogusnr. T T Aantal preparaten QuantiFERON Nil Tube (nulcontrolebuisje) (grijze dop, witte ring) 100 buisjes 100 buisjes QuantiFERON TB Antigen Tube (TB-antigeenbuisje) (rode dop, witte ring) QuantiFERON Mitogen Tube (mitogeenbuisje) (paarse dop, witte ring) 100 buisjes 100 buisjes 100 buisjes 100 buisjes Bijsluiter voor QFT-buisjes voor bloedafname High Altitude (HA) Blood Collection Tubes (High Altitude-buisjes voor bloedafname) (voor gebruik tussen 1020 en 1875 meter)* 300 buisjes 100 buisjes 100 buisjes Catalogusnr. T T QuantiFERON HA Nil Tube (nulcontrolebuisje) (grijze dop, gele ring) QuantiFERON HA TB Antigen Tube (TB-antigeenbuisje) (rode dop, gele ring) QuantiFERON HA Mitogen Tube (mitogeenbuisje) (paarse dop, gele ring) 100 buisjes 100 buisjes 100 buisjes 100 buisjes 100 buisjes 100 buisjes Bijsluiter voor QFT-buisjes voor bloedafname * Niet alle productconfiguraties zijn in alle landen verkrijgbaar. Raadpleeg de klantenzorg van QIAGEN (details op voor meer informatie over de configuraties die kunnen worden besteld. 6 Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/2013

7 ELISA-onderdelen ELISA-kit met 2 platen Referentiepakket voor laboratoria Catalogusnr Strips voor microtiterplaten (12 x 8 putjes) voorzien van een laagje murine anti-menselijk IFN-γ monoklonaal antilichaam Menselijk IFN-γ standaard, gelyofiliseerd (bevat recombinant menselijk IFN-γ, bovine caseïne, 0,01% vol. Thimerosal) 2 sets van strips voor microtiterplaten met 12 x 8 putjes 1 x flacon (8 IE/ml indien gereconstitueerd) 20 sets van strips voor microtiterplaten met 12 x 8 putjes 10 x flacons (8 IE/ml indien gereconstitueerd) Groene verdunningsoplossing (bevat bovine caseïne, normaal muizenserum, 0,01% vol. Thimerosal) 1 x 30 ml 10 x 30 ml Conjugaatconcentraat 100x, gelyofiliseerd (murine antimenselijk IFN-γ HRP, bevat 0,01% vol. Thimerosal) 1 x 0,3 ml (indien gereconstitueerd) 10 x 0,3 ml (indien gereconstitueerd) Spoelbufferconcentraat 20x geconcentreerd (ph 7,2 bevat 0,05% vol. ProClin 300) Enzymsubstraatoplossing (bevat H 2O 2, 3,3, 5,5 Tetramethylbenzidine) 1 x 100 ml 10 x 100 ml 1 x 30 ml 10 x 30 ml Enzymremmingsoplossing (bevat 0,5M H 2SO 4) 1 x 15 ml 10 x 15 ml Bijsluiter QFT ELISA 1 1 Bevat zwavelzuur. Zie pagina 9 voor voorzorgsmaatregelen. Benodigde maar niet meegeleverde materialen 37 C incubator. Geen CO 2 vereist Gekalibreerde pipetten met variabel volume voor toediening van 10 µl tot 1000 µl, met wegwerptips Gekalibreerde meerkanaalspipetten voor toediening van 50 µl tot 100 µl, met wegwerptips Schudapparaat voor microtiterplaten Gedeïoniseerd of gedestilleerd water, 2 liter Wasinstallatie voor microtiterplaten (automatische wasinstallatie aanbevolen) Leesapparaat voor microtiterplaten met 450 nm-filter en referentiefilter van 620 nm tot 650 nm Opslag en verwerking Bloedafnamebuisjes Bloedafnamebuisjes bewaren bij 4 C tot 25 C. Reagentia van kit Reagentia van kit gekoeld opslaan bij 2 C tot 8 C. De enzymsubstraatoplossing nooit in direct zonlicht opslaan. Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/2013 7

8 Gereconstitueerde en niet-gebruikte reagentia Voor instructies voor het reconstitueren van de reagentia, zie hoofdstuk 6 (pagina 13) De gereconstitueerde kitstandaard kan tot 3 maanden bewaard blijven indien opgeslagen bij 2 C tot 8 C. Let op de datum waarop de kitstandaard is gereconstitueerd. Zodra het niet-gebruikte conjugaatconcentraat 100x is gereconstitueerd, moet het opnieuw worden opgeslagen bij 2 C tot 8 C en binnen 3 maanden worden gebruikt. Let op de datum waarop het conjugaat is gereconstitueerd. Gebruiksklaar conjugaat moet binnen 6 uur na bereiding worden gebruikt. Gebruiksklare spoelbuffer kan gedurende 2 weken bij kamertemperatuur worden opgeslagen. 4. Waarschuwingen en voorzorgsmaatregelen Voor in-vitrodiagnostisch gebruik Waarschuwingen Een negatief resultaat van de QFT-test sluit de mogelijkheid van een M. tuberculosisinfectie of van de ziekte tuberculose niet uit; fout-negatieve resultaten kunnen worden veroorzaakt door de infectiefase (bijvoorbeeld als het bloedmonster is genomen vóór de ontwikkeling van een cellulaire immuunreactie), storingen van de immuunfunctie door comorbide aandoeningen, een ondeskundige manier van omgaan met de buisjes na de bloedafname, een verkeerde uitvoering van de test of overige immunologische variabelen. Een positief resultaat van de QFT-test mag niet de enige of definitieve basis voor het vaststellen van infectie met M. tuberculosis zijn. Door een verkeerde uitvoering van de test is er een kans op een fout-positieve testuitslag. Een positief QFT-testresultaat dient te worden gevolgd door nader medisch en diagnostisch onderzoek. Alleen zo kan worden vastgesteld of er sprake is van actieve tuberculose (bijv. door een AFB-uitstrijkje en -cultuur alsmede een thoraxröntgenonderzoek). Weliswaar bevatten BCG-stammen en de meeste bekende niet-tuberculeuze mycobacteriën geen ESAT-6, CFP-10 en TB7.7(p4), maar een positief resultaat in de QFTtest kan ook worden toegeschreven aan een infectie met M. kansasii, M. szulgai of M. marinum. Bij het vermoeden van zulke infecties moeten alternatieve testmethoden worden gebruikt. 8 Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/2013

9 Voorzorgsmaatregelen Uitsluitend voor diagnostisch gebruik in vitro. Draag bij het werken met chemicaliën altijd een geschikte laboratoriumjas, wegwerphandschoenen en een veiligheidsbril. Raadpleeg de bijbehorende veiligheidsinformatiebladen (VIB's) voor meer informatie. Deze zijn als handige en compacte PDF beschikbaar op Hier kunt u ook de VIB voor elke QIAGEN-kit en elk onderdeel van de kit vinden, bekijken en afdrukken. VOORZICHTIG: Behandel menselijk bloed alsof het besmet zou kunnen zijn. Houd u aan de relevante richtlijnen voor behandeling. De volgende risico- en veiligheidszinnen zijn van toepassing op de onderdelen van de QuantiFERON-TB Gold ELISA-kit. QuantiFERON-enzymremmingsoplossing Xi Bevat zwavelzuur: Irriterend. Risico- en veiligheidszinnen: R36/38, S26-36/37/39 Groene verdunningsvloeistof bevat normaal muizenserum en caseïne, wat tot allergische reacties kan leiden. Vermijd contact met de huid. Bij noodgevallen met chemicaliën Morsen, lekken, blootstelling of ongeluk Bel CHEMTREC (24 uur per dag) In de VS en Canada: Buiten de VS en Canada: (collect calls worden geaccepteerd) Overige informatie Veiligheidsinformatiebladen: Afwijkingen van de bijsluiter van de QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA-kit kunnen tot onjuiste resultaten leiden. Lees voor gebruik zorgvuldig de instructies. Gebruik de kit niet als een flesje met reagens vóór gebruik tekenen van schade of lekkage vertoont. Strips voor microtiterplaten, menselijke IFN-γ standaard, groene verdunningsoplossing of conjugaatconcentraat 100x uit verschillende QFT-kitpartijen mogen niet worden gemengd of door elkaar gebruikt. Andere reagentia (spoelbuffer 20x geconcentreerd, enzymsubstraatoplossing en enzymremmingsoplossing) kunnen worden uitgewisseld tussen kits op voorwaarde dat de vervaldatum van de reagentia nog niet is verstreken en dat de partijgegevens worden geregistreerd. Gooi niet-gebruikte reagentia en biologische monsters weg volgens de plaatselijke of nationale regelgeving. R36/38: Irriterend voor de ogen en de huid; S26: Bij aanraking met de ogen onmiddellijk met overvloedig water afspoelen en deskundig medisch advies inwinnen; S36/37/39: Draag geschikte beschermende kleding, handschoenen en een bescherming voor de ogen/voor het gezicht. Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/2013 9

10 Gebruik geen bloedafnamebuisjes of ELISA-kits waarvan de vervaldatum is verstreken. Zorg ervoor dat laboratoriumapparatuur, zoals plaatspoelers en leesapparaten, is gekalibreerd en gevalideerd voor gebruik. 5. Specimenafname en -behandeling QFT maakt gebruik van de volgende bloedafnamebuisjes: 1. QuantiFERON Nil tubes (nulcontrolebuisjes) (grijze dop met witte ring; gebruik tussen zeeniveau en 810 m) 2. TB Antigen tubes (TB-antigeenbuisjes) (rode dop met witte ring; gebruik tussen zeeniveau en 810 m) 3. QuantiFERON Mitogen tubes (mitogeenbuisjes) (paarse dop met witte ring; gebruik tussen zeeniveau en 810 m) High Altitude Tubes (HA-buisjes): 4. QuantiFERON HA Nil tubes (HA-nulcontrolebuisjes) (grijze dop met gele ring; gebruik tussen 1020 m en 1875 m) 5. HA TB Antigen tubes (HA TB-antigeenbuisjes) (rode dop met gele ring; gebruik tussen 1020 m en 1875 m) 6. QuantiFERON HA Mitogen tubes (HA-mitogeenbuisjes) (paarse dop met gele ring; gebruik tussen 1020 m en 1875 m) De binnenzijde van de bloedafnamebuisjes is bedekt met gedroogd antigeen. Het is dus van belang dat de inhoud van de buisjes goed met bloed wordt gemengd. De buisjes dienen zo snel mogelijk, maar uiterlijk 16 uur na de afname, in een incubator van 37 C te worden geplaatst. Voor optimale resultaten dienen de volgende procedures te worden gevolgd: 1. Verzamel door middel van venapunctie van elke proefpersoon 1 ml bloed rechtstreeks in elk van de QFT-bloedafnamebuisjes. Deze procedure moet worden uitgevoerd door een daartoe opgeleide bloedafnemer. Tot een hoogte van 810 meter moet gebruik worden gemaakt van standaard QFT-bloedafnamebuisjes. Op een hoogte tussen 1020 en 1875 meter dienen HA-buisjes (High Altitude) te worden gebruikt voor bloedafname. Bij gebruik van QFT-bloedafnamebuisjes buiten deze hoogtebereiken of bij lage testvolumes kan het bloed ook worden afgetapt met een spuit; in dat geval wordt in elk van de drie buisjes 1 ml bloed gedaan. Uit veiligheidsoverwegingen kan men hiervoor het best de naald van de spuit verwijderen. Neem hierbij de gebruikelijke voorzorgsmaatregelen in acht. Verwijder de dop van de 3 QFT-buisjes en doe in elk buisje 1 ml bloed (tot aan de zwarte markering aan de zijkant van het etiket). Breng vervolgens de dop weer aan en meng zoals hieronder beschreven. 10 Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/2013

11 Het verzamelen van 1 ml bloed gaat relatief langzaam. Houd het buisje daarom gedurende 2-3 seconden op de naald als het buisje helemaal vol lijkt te zijn om er zeker van te zijn dat het juiste volume is bereikt. De zwarte markering op de zijkant van de buisjes geeft een volume van 1 ml aan. QFT-bloedafnamebuisjes zijn gevalideerd voor volumes van 0,8 tot 1,2 ml. Als het bloedniveau in een buisje niet dichtbij de indicatorstreep staat, wordt aanbevolen een ander bloedmonster te nemen. Als voor het verzamelen van het bloed een vlindernaald wordt gebruikt, moet een afnamebuisje worden gebruikt om ervoor te zorgen dat het slangetje met bloed is gevuld voordat de QFT-bloedafnamebuisjes worden gebruikt. U kunt ook bloed afnemen in één generiek bloedafnamebuisje dat lithiumheparine als antistollingsmiddel bevat en dit vervolgens overbrengen naar QFT-buisjes. Gebruik alleen lithiumheparine als antistollingsmiddel voor het bloed aangezien andere antistollingsmiddelen de test kunnen verstoren. Vul een bloedafnamebuisje (minimaal volume 5 ml) en meng dit voorzichtig door het buisje meerdere keren om te draaien zodat de heparine oplost. Bloed moet bij kamertemperatuur (22 C ± 5 C) worden bewaard alvorens te worden overgebracht naar QFT-buisjes voor de incubatie, die binnen 16 uur na de bloedafname moet worden ingeleid. 2. Zodra de buisjes zijn gevuld, moeten deze minstens tien (10) maal net krachtig genoeg worden geschud om ervoor te zorgen dat de gehele binnenwand van de buisjes met bloed wordt bedekt en het antigeen op de binnenwand is opgelost. Tijdens het vullen met bloed moeten de buisjes op een temperatuur van 17 C tot 25 C worden gehouden. Te krachtig schudden kan tot afbraak van de gel en derhalve afwijkende resultaten leiden. Als bloed is afgetapt in een heparinebuisje, moeten monsters gelijkmatig worden vermengd voordat zij via pipetteren naar QFT-buisjes worden overgebracht. Zorg ervoor dat het bloed goed gemengd wordt via zachte inversie direct voorafgaand aan de pipettering. Pipetteer aliquots van 1,0 ml (één per QFT-buisje) naar een geschikt nulcontrole-, TB-antigeen- en mitogeenbuisje. Dit kan het beste aseptisch geschieden door, met inachtneming van de juiste veiligheidsprocedures, de doppen van de drie QFT-buisjes te verwijderen en 1 ml bloed aan elk buisje toe te voegen (tot aan de zwarte markering op het etiket aan de zijkant van het buisje). Bevestig de doppen weer stevig op de buisjes en meng zoals hieronder beschreven. 3. Voorzie de buisjes van passende etiketten. Zorg ervoor dat elk buisje (nulcontrole, TB-antigeen en mitogeen) herkenbaar is aan het etiket of andere middelen zodra de dop is verwijderd. 4. Na het vullen, schudden en etiketteren moeten de buisjes zo snel mogelijk, maar uiterlijk binnen 16 uur na de afname, in een incubator van 37 C ± 1 C te worden geplaatst. Bewaar de buisjes vóór de incubatie bij kamertemperatuur (22 C ± 5 C). Zet de bloedmonsters niet in de koelkast en vries ze niet in. Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/

12 6. Richtlijnen voor gebruik Fase 1 - Incubatie van bloed en verzamelen van plasma Meegeleverde materialen QFT-buisjes voor bloedafname (zie hoofdstuk 3). Benodigde maar niet meegeleverde materialen Zie hoofdstuk 3. Procedure 1. Als de bloedmonsters niet onmiddellijk na de bloedafname worden geïncubeerd, moeten de buisjes vlak voor de incubatie opnieuw worden gemengd door ze 10 maal te schudden. 2. Incubeer de buisjes RECHTOPSTAAND gedurende 16 tot 24 uur bij 37 C ± 1 C. CO 2 of bevochtiging is hierbij niet vereist. 3. Na de incubatie bij 37 C kunnen de bloedafnamebuisjes maximaal 3 dagen bij 4 C tot 27 C worden bewaard voorafgaand aan de centrifugering. 4. Na de incubatie van de buisjes bij 37 C worden deze voor het eenvoudiger extraheren van het plasma gedurende 15 minuten bij 2000 tot 3000 g (RCF) gecentrifugeerd. De cellen worden door een gelprop van het plasma gescheiden. Als de gelprop niet verschijnt, moeten de buisjes opnieuw worden gecentrifugeerd bij hogere snelheid. Het is mogelijk het plasma zonder centrifugeren te verzamelen, maar extra zorg is geboden om het plasma te scheiden zonder de cellen te verstoren. 5. Plasmamonsters mogen alleen met een pipet worden verzameld. Na het centrifugeren en voorafgaand aan het verzamelen moet op en neer bewegen van de pipet of mengen van het plasma te allen tijde worden vermeden. Zorg er altijd voor het materiaal aan het oppervlak van de gel niet te verstoren. Plasmamonsters kunnen rechtstreeks vanuit de gecentrifugeerde bloedafnamebuisjes worden overgebracht op de QFT ELISA-plaat, ook als geautomatiseerde ELISA-werkstations worden gebruikt. Plasmamonsters kunnen maximaal 28 dagen bij 2 C tot 8 C worden bewaard. Na extractie van het plasma kunnen ze bij 20 C of lager nog langer worden bewaard. Extraheer ten minste 150 µl plasma om zeker te zijn van voldoende testmonsters. 12 Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/2013

13 Fase 2 Menselijk IFN-γ ELISA Meegeleverde materialen QFT ELISA-kit (zie hoofdstuk 3). Benodigde maar niet meegeleverde materialen Zie hoofdstuk 3. Procedure 1. Alle plasmamonsters en reagentia, behalve conjugaatconcentraat 100x, dienen vóór gebruik op kamertemperatuur (22 C ± 5 C) te worden gebracht. Laat minimaal 60 minuten staan om evenwicht te bereiken. 2. Verwijder strips die niet nodig zijn van het frame, verzegel ze opnieuw in de folieverpakking en zet deze terug in de koelkast voor later gebruik. Neem minstens 1 strip voor de QFT-normen en voldoende strips voor het aantal proefpersonen dat wordt getest (zie afbeeldingen 2A en 2B voor indelingen met resp. 3 buisjes en 2 buisjes). Bewaar na gebruik het frame en het deksel om later met de resterende strips te gebruiken. 3. Reconstitueer de gevriesdroogde kitstandaard met de hoeveelheid gedeïoniseerd of gedestilleerd water zoals aangegeven op het etiket van de standaardflacon. Meng voorzichtig om schuimvorming zoveel mogelijk tegen te gaan en zorg dat volledige oplossing plaatsvindt. Reconstitutie van de standaard naar het desbetreffende volume geeft een oplossing met een concentratie van 8,0 IE/ml. Opmerking: Het reconstitutievolume van de kitstandaard verschilt van partij tot partij. Gebruik het gereconstitueerde kitstandaard om een 1 op 4 verdunningsreeks van IFN-γ te produceren in groene verdunningsoplossing (GD) (zie afbeelding 1). S1 (Standaard 1) bevat 4 IE/ml, S2 (Standaard 2) bevat 1 IE/ml, S3 (Standaard 3) bevat 0,25 IE/ml en S4 (Standaard 4) bevat 0 IE/ml (alleen GD). De standaarden moeten minstens dubbel worden getest. Aanbevolen procedure voor dubbele standaarden a. Geef 4 buisjes de etiketten S1, S2, S3 en S4. Aanbevolen procedure voor drievoudige standaarden a. Geef 4 buisjes de etiketten S1, S2, S3 en S4. b. Voeg 150 µl GD toe aan S1, S2, S3 en S4. b. Voeg 150 µl GD toe aan S1. c. Voeg 150 µl kitstandaard toe aan S1 en meng goed. c. Voeg 210 µl GD toe aan S2, S3 en S4. d. Breng 50 µl uit S1 over in S2 en meng goed. d. Voeg 150 µl van de kitstandaard toe aan S1 en meng goed. e. Breng 50 µl uit S2 over in S3 en meng goed. e. Breng 70 µl uit S1 over in S2 en meng goed. f. GD alleen dient als de nulstandaard (S4). f. Breng 70 µl uit S2 over in S3 en meng goed. g. GD alleen dient als de nulstandaard (S4). Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/

14 150 µl 50 µl 50 µl Gereconstitueer de kitstandaard Standaard 1 4,0 IE/ml Standaard 2 1,0 IE/ml Standaard 3 0,25 IE/ml Standaard 4 0 IE/ml (Groene verdunningsoplossing) Afbeelding 1. Standaardcurve maken. Maak voor elke ELISA-bewerking nieuwe verdunningen van de kitstandaard. 4. Reconstitueer gevriesdroogd conjugaatconcentraat 100x met 0,3 ml gedeïoniseerd of gedestilleerd water. Meng voorzichtig om schuimvorming zoveel mogelijk tegen te gaan en zorg dat volledige oplossing van het conjugaat plaatsvindt. Gebruiksklaar conjugaat wordt bereid door de vereiste hoeveelheid gereconstitueerd conjugaat, concentraat 100x, te verdunnen met groene verdunningsoplossing, zoals beschreven in Tabel 1 - Bereiding conjugaat. Tabel 1. Bereiding conjugaat Aantal strips Hoeveelheid conjugaatconcentraat 100x Hoeveelheid groene verdunningsoplossing 2 10 µl 1,0 ml 3 15 µl 1,5 ml 4 20 µl 2,0 ml 5 25 µl 2,5 ml 6 30 µl 3,0 ml 7 35 µl 3,5 ml 8 40 µl 4,0 ml 9 45 µl 4,5 ml µl 5,0 ml µl 5,5 ml µl 6,0 ml Meng goed maar voorzichtig om schuimvorming tegen te gaan. Sla onmiddellijk na gebruik eventueel niet-gebruikt conjugaat, concentraat 100x, weer op bij een temperatuur van 2 C tot 8 C. Gebruik alleen groene verdunningsoplossing. 14 Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/2013

15 5. Plasmamonsters die zijn verkregen uit bloedafnamebuisjes en vervolgens gedurende meer dan 24 uur vóór de testen zijn bevroren of opgeslagen, moeten worden gemengd alvorens te worden toegevoegd aan het ELISA-putje. Als plasmamonsters rechtstreeks vanuit de gecentrifugeerde QFT-buisjes moeten worden toegevoegd, dient vermenging van het plasma te worden vermeden. 6. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 50 µl vers bereid, gebruiksklaar conjugaat toe aan de benodigde ELISA-putjes. 7. Voeg 50 µl van testplasmamonsters toe aan de juiste putjes met behulp van een meerkanaalspipet (zie aanbevolen plaatindeling op pagina 15, afbeeldingen 2A en 2B). Voeg tot slot 50 µl elk van de standaarden 1 t/m 4 toe A 1N 1A 1M S1 S1 S1 13N 13A 13M 21N 21A 21M B 2N 2A 2M S2 S2 S2 14N 14A 14M 22N 22A 22M C 3N 3A 3M S3 S3 S3 15N 15A 15M 23N 23A 23M D 4N 4A 4M S4 S4 S4 16N 16A 16M 24N 24A 24M E 5N 5A 5M 9N 9A 9M 17N 17A 17M 25N 25A 25M F 6N 6A 6M 10N 10A 10M 18N 18A 18M 26N 26A 26M G 7N 7A 7M 11N 11A 11M 19N 19A 19M 27N 27A 27M H 8N 8A 8M 12N 12A 12M 20N 20A 20M 28N 28A 28M Afbeelding 2A. Aanbevolen monsterindeling voor nulcontrole-, TB-antigeen- en mitogeenbuisjes (28 tests per plaat). S1 (Standaard 1), S2 (Standaard 2), S3 (Standaard 3), S4 (Standaard 4) 1N (Monster 1. Nulplasma), 1A (Monster 1. TB-antigeenplasma), 1M (Monster 1. Mitogeenplasma) A 1N 5N 9N 13N 17N S1 S1 25N 29N 33N 37N 41N B 1A 5A 9A 13A 17A S2 S2 25A 29A 33A 37A 41A C 2N 6N 10N 14N 18N S3 S3 26N 30N 34N 38N 42N D 2A 6A 10A 14A 18A S4 S4 26A 30A 34A 38A 42A E 3N 7N 11N 15N 19N 21N 23N 27N 31N 35N 39N 43N F 3A 7A 11A 15A 19A 21A 23A 27A 31A 35A 39A 43A G 4N 8N 12N 16N 20N 22N 24N 28N 32N 36N 40N 44N H 4A 8A 12A 16A 20A 22A 24A 28A 32A 36A 40A 44A Afbeelding 2B. Aanbevolen monsterindeling voor nulcontrole- en TB-antigeenbuisjes (44 tests per plaat). S1 (Standaard 1), S2 (Standaard 2), S3 (Standaard 3), S4 (Standaard 4) 1N (Monster 1. Nulplasma), 1A (Monster 1. TB-antigeenplasma) Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/

16 8. Meng het conjugaat goed gedurende 1 minuut met de plasmamonsters/standaarden met behulp van een schudapparaat voor microtiterplaten. 9. Dek elke plaat af met een deksel en incubeer gedurende 120 ± 5 minuten bij kamertemperatuur (22 C ± 5 C). Tijdens het incuberen mogen de platen niet aan direct zonlicht worden blootgesteld. 10. Verdun tijdens het incuberen één deel spoelbuffer, concentraat 20x, met 19 delen gedeïoniseerd of gedestilleerd water en meng goed. Er is voldoende spoelbuffer, concentraat 20x, aanwezig om 2 liter gebruiksklare spoelbuffer te maken. Spoel de putjes minstens gedurende 6 cycli met 400 µl gebruiksklare spoelbuffer. Er wordt een geautomatiseerde plaatspoeler aanbevolen. Zorgvuldig spoelen is erg belangrijk voor het uitvoeren van de test. Zorg dat elk putje voor elke spoelcyclus tot aan de rand volledig is gevuld met spoelbuffer. Er wordt een inweektijd van minstens 5 seconden tussen de cycli aanbevolen. Er dient een standaard desinfecterend middel voor laboratoria te worden toegevoegd aan het uitstroomreservoir en er moeten algemeen aanvaarde procedures worden gevolgd voor het ontsmetten van potentieel besmet materiaal. 11. Houd de platen omgekeerd boven een absorberende, niet-pluizende doek en tik erop om resterende spoelbuffer te verwijderen. Voeg 100 µl enzymsubstraatoplossing toe aan elk putje en meng goed met behulp van een schudapparaat voor microtiterplaten. 12. Dek elke plaat af met een deksel en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (22 C ± 5 C). Tijdens het incuberen mogen de platen niet aan direct zonlicht worden blootgesteld. 13. Voeg na een incubatie van 30 minuten 50 µl enzymremmingsoplossing toe aan elk putje en meng goed. De enzymremmingsoplossing dient in dezelfde volgorde en in het ongeveer hetzelfde tempo aan de putjes te worden toegevoegd als het substraat in stap Meet binnen 5 minuten na het stoppen van de reactie de absorptie of optische dichtheid (OD) van elk putje met een microtiterplaatlezer die is voorzien van een 450 nm-filter en een referentiefilter van 620 nm tot 650 nm. OD-waarden worden gebruikt om de resultaten te berekenen. 16 Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/2013

17 7. Berekeningen en interpretatie van de test QFT-analysesoftware wordt gebruikt voor het analyseren van de onbewerkte gegevens en het berekenen van de resultaten. Deze is verkrijgbaar op Zorg ervoor dat de meest recente versie van de software wordt gebruikt. De software voert een kwaliteitscontrole voor de test uit, genereert een standaardcurve en geeft voor elke proefpersoon een testresultaat, zoals verder is uitgewerkt in het gedeelte 'Interpretatie van de resultaten'. In plaats van met de QFT-analysesoftware kunnen de resultaten ook worden bepaald met de volgende methode. Genereren van de standaardcurve (als geen QFT-analysesoftware wordt gebruikt) Bepaal de gemiddelde OD-waarden van de kitstandaardreplicaten op elke plaat. Construeer een dubbellogaritmische standaardcurve door de log (e)van de gemiddelde OD (y-as) af te zetten tegen de log (e) van de IFN-γ-concentratie van de standaarden in IE/ml (x-as), waarbij de nulstandaard niet bij deze berekeningen moet worden betrokken. Bereken de best passende lijn voor de standaardcurve met behulp van regressieanalyse. Gebruik de standaardcurve om de IFN-γ-concentratie (IE/ml) vast te stellen voor elk testplasmamonster met behulp van de OD-waarde van elk monster. Deze berekeningen kunnen worden uitgevoerd met softwarepakketten die bij microtiterplaatlezers worden geleverd en een standaardspreadsheet of statistische software (zoals Microsoft Excel ). Het wordt aanbevolen deze pakketten te gebruiken voor het berekenen van de regressieanalyse, de variatiecoëfficiënt (%CV) van de standaarden en de correlatiecoëfficiënt (r) van de standaardcurve. Kwaliteitscontrole van de test De nauwkeurigheid van de testresultaten hangt af van het genereren van een accurate standaardcurve. Resultaten die van de standaarden worden afgeleid, dienen dus nader te worden bekeken voordat de resultaten van de testmonsters kunnen worden geïnterpreteerd. De ELISA is geldig als aan het volgende is voldaan: De gemiddelde OD-waarde voor standaard 1 moet 0,600 zijn. De %CV voor de OD-waarden van de replicaten van standaard 1 en standaard 2 dienen 15% te zijn. De OD-waarden van de replicaten van standaard 3 en standaard 4 mogen niet meer van het gemiddelde afwijken dan 0,040 eenheden optische dichtheid. De correlatiecoëfficiënt (r) van de gemiddelde absorptiewaarden van de standaarden dient 0,98 te zijn. De QFT-analysesoftware berekent deze parameters voor kwaliteitscontrole en rapporteert deze. Als niet aan bovenstaande criteria wordt voldaan, is de test ongeldig en moet deze worden herhaald. Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/

18 De gemiddelde OD-waarde van de nulstandaard (groene verdunningsoplossing) dient 0,150 te zijn. Als de gemiddelde OD-waarde > 0,150 is, dient de plaatspoelprocedure te worden gecontroleerd. Interpretatie van de resultaten QFT-resultaten worden geïnterpreteerd aan de hand van de volgende criteria: Opmerking: het diagnosticeren of uitsluiten van tuberculose en het beoordelen van de waarschijnlijkheid van een LTBI vereist een combinatie van epidemiologische, historische, medische en diagnostische bevindingen waarmee bij de interpretatie van de QFT-testresultaten rekening moet worden gehouden (tabellen 2 en 3). Tabel 2. Bij gebruik van nulcontrole-, TB-antigeen- en mitogeenbuisjes Nulcontrole (IE/ml) 8,0 TB-antigeen minus nulcontrole (IE/ml) Mitogeen minus nulcontrole (IE/ml)* QFT-resultaat Rapport/interpretatie < 0,35 0,5 Negatief M. tuberculosis-infectie NIET waarschijnlijk 0,35 en < 25% van waarde van nulcontrole 0,35 en 25% van waarde van nulcontrole 0,5 Negatief Elke waarde Positief < 0,35 < 0,5 Onbepaald 0,35 en < 25% van waarde van nulcontrole < 0,5 Onbepaald M. tuberculosis-infectie NIET waarschijnlijk M. tuberculosis-infectie waarschijnlijk Resultaten zijn onbepaald voor TB-antigeenreactiviteit Resultaten zijn onbepaald voor TB-antigeenreactiviteit > 8,0 Elke waarde Elke waarde Onbepaald Resultaten zijn onbepaald voor TB-antigeenreactiviteit * Reacties op de mitogeenpositieve controle (en soms TB-antigeen) kunnen zich gewoonlijk buiten het bereik van de microtiterplaatlezer bevinden. Dit is niet van invloed op de testresultaten. Als er geen vermoeden van een M. tuberculosis-infectie bestaat, kunnen aanvankelijk positieve resultaten worden bevestigd door de originele plasmamonsters in de QFT ELISA opnieuw dubbel te testen. Als de herhaalde test bij het eerste of tweede monster een positief resultaat oplevert, moet het testresultaat als positief worden beoordeeld. Raadpleeg het gedeelte 'Problemen oplossen' voor mogelijke oorzaken. In klinische studies had minder dan 0,25% van de proefpersonen IFN-γ-waarden van > 8,0 IE/ml bij de nulcontrole. 18 Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/2013

19 De hoogte van de gemeten IFN-γ-concentratie kan niet worden gecorreleerd aan het stadium of de mate van besmetting, de omvang van de immuunreactiviteit of de waarschijnlijkheid van progressie naar actieve ziekte. Interpretatie Nee TB-antigeen nulcontrole 0,35 IE/ml Ja Nee TB-antigeen nulcontrole 25% van IE/ml-waarde voor nulcontrole Ja Validatie Mitogeen nulcontrole < 0,50 IE/ml en/of nulcontrole > 8,0 IE/ml Ja Onbepaald Nee Nulcontrole 8,0 IE/ml Nee Ja Negatief Positief Afbeelding 3. Stroomdiagram voor interpretatie bij gebruik van nulcontrole-, TB-antigeen- en mitogeenbuisjes. Tabel 3. Wanneer alleen QuantiFERON nulcontrole- en TB-antigeenbuisjes worden gebruikt Nulcontrole (IE/ml) TB-antigeen minus nulcontrole (IE/ml) QFT-resultaat < 0,35 Negatief Rapport/interpretatie M. tuberculosis-infectie NIET waarschijnlijk 8,0 0,35 en < 25% van waarde van nulcontrole Negatief M. tuberculosis-infectie NIET waarschijnlijk 0,35 en 25% van waarde van nulcontrole Positief* M. tuberculosis-infectie waarschijnlijk > 8,0 Elke waarde Onbepaald Resultaten zijn onbepaald voor TB-antigeenreactiviteit * Als er geen vermoeden van een M. tuberculosis-infectie bestaat, kunnen aanvankelijk positieve resultaten worden bevestigd door de originele plasmamonsters in de QFT ELISA opnieuw dubbel te testen. Als de herhaalde test bij het eerste of tweede monster een positief resultaat oplevert, moet het testresultaat als positief worden beoordeeld. In klinische studies had minder dan 0,25% van de proefpersonen IFN-γ-waarden van > 8,0 IE/ml bij de nulcontrole. Raadpleeg het gedeelte 'Problemen oplossen' voor mogelijke oorzaken. Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/

20 De hoogte van de gemeten IFN-γ-concentratie kan niet worden gecorreleerd aan het stadium of de mate van besmetting, de omvang van de immuunreactiviteit of de waarschijnlijkheid van progressie naar actieve ziekte. Interpretatie Nee TB-antigeen nulcontrole 0,35 IE/ml Ja Nee TB-antigeen nulcontrole 25% van IE/ml-waarde voor nulcontrole Ja Validatie Onbepaald Nee Nulcontrole 8,0 IE/ml Ja Negatief Positief Afbeelding 4. Stroomdiagram voor interpretatie bij gebruik van nulcontrole- en TB-antigeenbuisjes. 8. Beperkingen De resultaten van de QFT-test dienen te worden gebruikt in combinatie met de epidemiologische voorgeschiedenis, de huidige medische status en andere diagnostische onderzoeken van elke patiënt. Individuen met nulwaarden groter dan 8 IE/ml worden geclassificeerd als 'onbepaald' omdat een 25% hogere respons op de TB-antigenen buiten het meetbereik van de test kan liggen. Onbetrouwbare of onbepaalde resultaten kunnen het gevolg zijn van: Afwijkingen van de procedure beschreven in de bijsluiter van QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Zeer hoge concentraties circulerend IFN-γ of aanwezigheid van heterofiele antilichamen Overschrijding van de termijn van 16 uur tussen bloedafname en incubatie bij 37 C 9. Kwaliteitskenmerken Klinisch onderzoek Aangezien er geen definitieve standaard bestaat voor latente tuberculose-infectie (LTBI), kan een schatting van de gevoeligheid en specificiteit van de QFT-test niet praktisch worden geëvalueerd. De specificiteit van de QFT-test is bij benadering vastgesteld door evaluatie van het percentage foutpositieve resultaten bij personen met gering risico van (d.w.z. zonder bekende risicofactoren voor) een tuberculose-infectie. De gevoeligheid is bij benadering vastgesteld door evaluatie van patiëntengroepen met actieve tuberculose die was bevestigd door een cultuur. 20 Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/2013

21 Specificiteit In een Amerikaanse studie waaraan 866 vrijwilligers deelnamen, werd bij de uitvoering van de TST bloed afgenomen voor de QFT-test. De demografische gegevens en risicofactoren voor TB zijn vastgesteld met behulp van een standaardenquête die tijdens de test werd gehouden. Van de 432 vrijwilligers zonder bekende risicofactoren voor M. tuberculosis-infectie, waren voor 391 personen de QFT- en TST-resultaten beschikbaar. Geen van deze personen was gevaccineerd met BCG. Een tweede specificiteitsonderzoek met de QFT-test is uitgevoerd in Japan onder deelnemers met gering risico; ongeveer 90% van deze personen was gevaccineerd met BCG. De resultaten van de 2 specificiteitsonderzoeken zijn weergegeven in tabel 4. Tabel 4. QFT-specificiteit: Resultaten voor personen zonder bekende risicofactoren voor M. tuberculosis-infectie Studie VS (ongepubliceerd) Totaal getest Aant. QFT onbepaald Aantal QFT positief/ aantal geldige tests BCG-status (% gevaccineerd) QFTspecificiteit (95% CI) 0% /390 99,2% (98 100) Aantal TST positief/ aantal getest TST*- specificiteit (95% CI) 6/391 98,5% (97 99) Japan (15) ~90% /162 98,8% (95 100) Totaal 559 7/559 (1,3%) 5/552 99,1% (98 100) * Met behulp van een TST-grenswaarde van 10 mm bij niet met BCG gevaccineerde personen. Geschatte TSTspecificiteit bedraagt 99,1% bij gebruik van een grenswaarde van 15 mm. Gevoeligheid voor actieve TB Proefpersonen met TB-verdenking uit de VS, Australië en Japan bij wie later M. tuberculosis-infectie werd bevestigd door middel van cultuur werden getest om de gevoeligheid van de QFT-test te beoordelen. Hoewel er nog geen definitieve standaardtest voor latente TB-infectie (LTBI) bestaat, vormt de microbiologische cultuur van M. tuberculosis een geschikt vervangingsmiddel omdat patiënten met ziekte per definitie zijn geïnfecteerd. De patiënten hadden minder dan 8 dagen behandeling ontvangen voorafgaand aan de bloedafname voor de QFT-test. Tabel 5 bevat een overzicht van bevindingen van de 3 groepen positieve patiënten op basis van M. tuberculosis-cultuur. De algehele gevoeligheid van de QFT-test voor actieve TB-ziekte bedroeg 89% (157/177). Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/

22 Tabel 5. QFT: Proefpersonen met door middel van cultuur bevestigde M. tuberculosis-infectie Studie Aantal QFT positief/aantal geldige tests QFT-gevoeligheid (95% CI) TB-patiënten Japan (15) 86/92 93% (86 97%) Australië 24/27 89% (70 97%) VS 47/58 81% (68 90%) Totaal 157/177 89% (83 93%) Diagnose van LTBI Er is een aantal studies gepubliceerd die de prestaties aantonen van de QFT-test in diverse risicopopulaties voor LTBI. De belangrijkste bevindingen van enkele specifieke studies zijn weergegeven in tabel 6. Tabel 6. Geselecteerde studies gepubliceerd over de QFT-test bij risicopopulaties voor LTBI Studie Healthcare workers in India (Pai, et al 2005) (26) Danish HIV+ patients (Brock, et al 2006) (5) Hospitalized children in India (Dogra, et al 2006) (10) Contact investigations in Germany (Diel, et al 2006) (9) Totaal getest Resultaten en bevindingen 726 Omgeving met zeer hoge TB-percentages. 40% QFT-positief en 41% TSTpositief bij grenswaarde van 10 mm. Hoge overeenstemming met TST, geen effect van BCG aan beide zijden. Beide tests hielden verband met de risicofactoren leeftijd en duur van het arbeidsverleden in de gezondheidszorg. 590 De algehele prevalentie van LTBI in de QFT bedroeg 4,6% (27/590) bij HIV-positieve personen. De positieve resultaten hielden verband met TBrisico's. Twee QFT-positieve proefpersonen ontwikkelden binnen 1 jaar actieve TB. Onbepaalde resultaten (n=20, 3,4%) waren nauw verbonden aan een CD4-aantal < 100/µl. 105 Kinderen met TB-verdenking of met een geschiedenis van TB-contact werden getest met QFT en TST; 10,5% QFT-positief en 9,5% TST-positief bij grenswaarde van 10 mm. Overeenstemming tussen de tests bedroeg in totaal 95,2% en 100% bij niet met BCG gevaccineerde proefpersonen. 309 De naaste contactpersonen van 15 verschillende indexgevallen werden getest: 51% was gevaccineerd met BCG, 27% in het buitenland geboren. 70% van de met BCG gevaccineerden en 18% van de niet met BCG gevaccineerden was TST-positief (5 mm) en 9% resp. 11% was QFTpositief. QFT werd in verband gebracht met het TB-risico. TST werd slechts in verband gebracht met de BCG-vaccinatie. De prestatie van de minder gevoelige vloeibare antigeenversie van QuantiFERON-TB Gold (de voorloper van QFT) en de QFT-test zijn in nog vele andere publicaties beschreven. Deze onderzoeken omvatten onder andere het gebruik van de test(s) bij contacten van actieve TBgevallen (9, 11, 19, 25), kinderen (6-10, 25, 28), HIV-positieve patiënten (2, 5, 20), medisch personeel (13, 26, 32), immunodeficiënte personen (3, 4, 22, 23, 27, 30, 31), alsmede personen met TB-verdenking (7, 8, 10, 18) en individuen met laag risico (15). 22 Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/2013

23 Herhaalbaarheid en effect van TST op latere QFT-tests In het kader van het Amerikaanse specificiteitsonderzoek werd een subgroep van de deelnemers 4 tot 5 weken na de oorspronkelijke QFT- en TST-test onderzocht. Voor 260 deelnemers waren resultaten van beide testtijdstippen uit de QFT-test beschikbaar en de overeenstemming bedroeg 99,6% (259/260). Een voorafgaande TST leidde niet tot toegenomen positieve resultaten in de QFT-test. 10. Technische informatie Onbepaalde resultaten Onbepaalde resultaten zouden slechts zelden moeten voorkomen en kunnen verband houden met de immuniteitsstatus van de geteste proefpersoon, maar kunnen ook verband houden met enkele technische factoren: Overschrijding van de termijn van 16 uur tussen bloedafname en incubatie bij 37 C Opslag van bloed buiten het aanbevolen temperatuurbereik (17 C tot 27 C) Onvoldoende mengen van het bloed in de afnamebuisjes Onvolledige spoeling van de ELISA-plaat Indien technische problemen worden vermoed bij het verzamelen of behandelen van de bloedmonsters, dient de gehele QFT-test te worden herhaald met een nieuw bloedmonster. Herhaling van de ELISA-test van gestimuleerde plasma's kan worden uitgevoerd als onvoldoende spoeling of andere procedurele afwijkingen van de ELISA-test worden vermoed. Onbepaalde resultaten ten gevolge van lage mitogeenwaarden of hoge nulcontrolewaarden zullen naar verwachting bij herhaling niet wijzigen, tenzij er een fout met de ELISA-test is opgetreden. Onbepaald resultaten dienen als zodanig te worden gerapporteerd. Artsen kunnen ervoor kiezen opnieuw een bloedmonster af te nemen of, indien nodig, andere procedures toe te passen. Gestolde plasmamonsters Indien bij een langduriger opslag van de plasmamonsters fibrinestolsels optreden, moeten de monsters worden gecentrifugeerd totdat sedimentatie heeft plaatsgevonden. Dit vereenvoudigt het pipetteren van plasma. Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/

24 Handleiding voor het oplossen van problemen Deze handleiding kan nuttig zijn bij het oplossen van allerlei voorkomende problemen. Raadpleeg voor meer informatie tevens de technische informatie op: Zie de achterzijde voor contactgegevens. Oplossen van problemen met ELISA Niet-specifieke kleurreactie Mogelijke oorzaak a) Onvolledige spoeling van de plaat b) Kruisbesmetting van ELISAputjes c) Kit/onderdelen over de vervaldatum d) Enzymsubstraatoplossing is verontreinigd e) Plasma in QFT-buisjes is gemengd voordat het is verzameld Oplossing Spoel de plaat minstens 6 maal met 400 µl spoelbuffer per putje. Er kunnen meer dan 6 spoelcycli nodig zijn, afhankelijk van de gebruikte spoelbuffer. Er dient een inweektijd van minstens 5 seconden tussen de cycli te worden aangehouden. Wees voorzichtig bij pipetteren en mengen van het monster om risico's te minimaliseren. Zorg dat de kit vóór de vervaldatum wordt gebruikt. Zorg dat gereconstitueerde standaard en conjugaatconcentraat 100x binnen drie maanden na de reconstitutiedatum worden gebruikt. Gooi het substraat weg indien blauwkleuring optreedt. Zorg voor schone reservoirs voor de reagentia. Na het centrifugeren en voorafgaand aan het verzamelen moet op en neer bewegen van de pipet of mengen van het plasma te allen tijde worden vermeden. Zorg er altijd voor het materiaal aan het oppervlak van de gel niet te verstoren. Aflezingen van lage optische dichtheden voor standaarden Mogelijke oorzaak Oplossing a) Fout met standaardverdunning Zorg dat de verdunningen van de kitstandaard volgens de QFT ELISAbijsluiter worden gemaakt. b) Pipetteerfout Zorg dat pipetten worden gekalibreerd conform de instructies van de fabrikant. c) Te lage incubatietemperatuur Incubatie van de ELISA moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (22 C ± 5 C) d) Te korte incubatietijd De incubatietijd van de plaat met het conjugaat, de standaarden en monsters bedraagt 120 ± 5 minuten. De enzymsubstraatoplossing wordt gedurende 30 minuten op de plaat geïncubeerd. e) Onjuist filter voor plaatlezer gebruikt De plaat moet bij 450 nm worden afgelezen met een referentiefilter tussen 620 en 650 nm. f) Reagentia zijn te koud Alle reagentia, met uitzondering van het conjugaat, concentraat 100 x, moeten voor het begin van de assay op kamertemperatuur worden gebracht. Dit duurt ongeveer één uur. 24 Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/2013

25 Oplossen van problemen met ELISA g) Kit/onderdelen over de vervaldatum Zorg dat de kit vóór de vervaldatum wordt gebruikt. Zorg dat gereconstitueerde standaard en conjugaatconcentraat 100x binnen 3 maanden na de reconstitutiedatum worden gebruikt. Sterke achtergrondkleuring Mogelijke oorzaak a) Onvolledige spoeling van de plaat Oplossing Spoel de plaat minstens 6 maal met 400 µl spoelbuffer per putje. Er kunnen meer dan 6 spoelcycli nodig zijn, afhankelijk van de gebruikte spoelbuffer. Er dient een inweektijd van minstens 5 seconden tussen de cycli te worden aangehouden. b) Te hoge incubatietemperatuur Incubatie van de ELISA moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (22 C ± 5 C). c) Kit/onderdelen over de vervaldatum d) Enzymsubstraatoplossing is verontreinigd Zorg dat de kit vóór de vervaldatum wordt gebruikt. Zorg dat gereconstitueerde standaard en conjugaatconcentraat 100x binnen 3 maanden na de reconstitutiedatum worden gebruikt. Gooi het substraat weg indien blauwkleuring optreedt. Zorg voor schone reservoirs voor de reagentia. Niet-lineaire standaardcurve en dubbele variabiliteit Mogelijke oorzaak a) Onvolledige spoeling van de plaat Oplossing Spoel de plaat minstens 6 maal met 400 µl spoelbuffer per putje. Er kunnen meer dan 6 spoelcycli nodig zijn, afhankelijk van de gebruikte spoelbuffer. Er dient een inweektijd van minstens 5 seconden tussen de cycli te worden aangehouden. b) Fout met standaardverdunning Zorg dat de verdunningen van de standaard volgens de QFT ELISAbijsluiter worden gemaakt. c) Slecht mengen Meng de reagentia grondig door meermaals omkeren of licht wervelen alvorens deze op de plaat worden aangebracht. d) Inconsistente pipetteertechniek of onderbreking tijdens het opzetten van de test De toevoeging van monster en standaard moet op constante wijze gebeuren. Alle reagentia moeten worden voorbereid voorafgaand aan het begin van de test. Een video met een demonstratie van de testmethode alsmede een oplossing voor de meeste technische problemen vindt u op Gnowee. Registreer u direct bij voor online toegang. Productinformatie en technische gidsen zijn gratis verkrijgbaar bij QIAGEN of uw leverancier, of via een bezoek aan Bijsluiter TB QuantiFERON Gold (QFT) ELISA 07/