Validatie van bioassays

Transcriptie

1 Validatie van bioassays Algemeen Binnen de analytische laboratoria worden veelvuldig analyses verricht in biologisch materiaal. Hierbij valt te denken aan onder andere klinisch chemische laboratoria en klinisch farmaceutische laboratoria welke respectievelijk lichaamseigen en lichaamsvreemde verbindingen bepalen in biologische materialen als bloed, bloedplasma en urine. Het traject tussen de monstername en de rapportage van de uitslagen is vaak complex en bestaat uit verschillende stappen. Een bloedmonster bijvoorbeeld, wordt na afname (1) opgestuurd naar het laboratorium (2) waarna het wordt gecentrifugeerd en het bloedplasma wordt overgebracht(2)in een andere buis waarna deze wordt ingevroren tot deze kan worden geanalyseerd. De analyse bestaat vervolgens weer uit een 3 voudige extractie en een HPLC analyse. Uiteindelijk is er een resultaat en als er geen rare dingen zijn gebeurd zal de analist zeggen dat het een goed resultaat is. De vraag is alleen hoe goed? Een tweede en eventueel een derde analist die hetzelfde monster analyseert zal ook met een resultaat komen en zeggen dat het een goed resultaat is terwijl er strikt genomen nu twee of drie verschillende getallen geproduceerd zijn. Ook al zouden de drie getallen (nagenoeg) gelijk zijn, is de uitkomst dan representatief voor het monster op het moment van afname? Indien men van mening is dat het er allemaal niet toe doet, omdat het bijvoorbeeld altijd al zo gegaan is, is er niets aan de hand en kan men gewoon verdergaan met waar men gebleven is. Wanneer het wel belangrijk is te weten hoe goed (betrouwbaar) een resultaat is welke geproduceerd is met een bepaalde analysemethode en of deze betrouwbaarheid voldoende groot is voor het doel waarvoor het gebruikt wordt, zal de methode "gevalideerd " moeten worden. Hier kunnen we gelijk een definitie van validatie plaatsen: " Validatie is het bepalen van de betrouwbaarheid van een methode met betrekking tot de beoogde toepassing" Door middel van validatie wordt onderzocht of een methode daadwerkelijk dat resultaat geeft van wat er ook werkelijk in het monster aanwezig is. Er kan tevens worden nagegaan of het traject tussen het verkrijgen van het monster en de analyse geen invloed heeft op het uiteindelijke resultaat. Om een idee te hebben of een methode betrouwbare resultaten levert hebben we van een aantal zaken gegevens nodig. Ten eerste willen we weten of het monster gedurende het transport en opslag stabiel is (denk aan de azathioprinemetaboliet 6 mercaptopurine die tijdens opslag en transport gestabiliseerd wordt met b.v. dithiothreitol). We moeten weten of het herhaaldelijk invriezen van een monster effect heeft op de uiteindelijke concentratie. Het betreft hier niet alleen ontleding van de stof maar het kan ook gebeuren dat een stof gedurende de invriesperiode uitkristalliseert of zich aan de wand van de container gaat hechten. We willen weten of een methode resultaten levert die dicht bij de werkelijke waarde liggen en of het resultaat werkelijk terug te voeren is naar de component waarnaar we op zoek zijn.

2 Wanneer is een resultaat goed? Dit is de belangrijkste vraag die we kunnen stellen als we het over betrouwbaarheid van resultaten hebben. We kunnen eindeloos discussiëren over betrouwbaarheidsintervallen en standaarddeviaties, als we geen referentiepunt hebben is het bijna zinloos. Stel dat een geneesmiddel voor een goede werking een plasmaconcentratie moet hebben tussen de 120 en 150 μg/l en dat het middel schadelijk is boven de 200 μg/l. Het maakt voor een patiënt die dit middel gebruikt wel degelijk uit, of we een resultaat vinden van 140 of 100 (als de theoretische concentratie b.v. 130 μg/l is). Wanneer we een patiënt hebben die veel te veel van dit middel geslikt heeft en we dit middel ook bepalen, maakt het voor de behandeling weinig uit of we 400 of 440 μg/l vinden, terwijl we in beide gevallen een verschil van 40 μg/l meten. Aan de andere kant moeten we ook reëel blijven en ons realiseren dat het een utopie is om getallen te produceren die tot in de tiende decimaal met elkaar en met de theoretische waarde overeenkomen. Het is wel belangrijk dat men hierover nadenkt voordat men met de validatie of eigenlijk voordat men met de methodeontwikkeling begint. We zijn nu eenmaal snel geneigd om achteraf bij gebrek aan tijd/beter de resultaten te accepteren. Eigenlijk is dit een vorm van 'naar het antwoord toewerken'. Indien er geen duidelijke criteria voorhanden zijn of wanneer de criteria moeilijk vast te stellen zijn, kunnen de 'Shah criteria' worden gebruikt Deze zijn begin jaren 90 gepubliceerd naar aanleiding van de conferentie: "Analytical Methods Validation: Bioavailability, Bioequivalence and Pharmacokinetic studies". Wat wordt er gevalideerd. In principe zijn er een aantal voorwaarden waaraan voldaan moet worden voor men kan spreken van een valide methode. 1. Een gedetailleerd voorschrift waarin de methode goed beschreven staat. Hierin staan b.v. de bereiding van gebruikte reagentia en chemicaliën, de instelling van de gebruikte apparatuur en de praktische uitvoering van de analyse beschreven. 2. Wanneer er op een later tijdstip wordt afgeweken van de beschreven methode, zal afhankelijk van de mogelijke invloed van de verandering, de methode op dit punt opnieuw onderzocht moeten worden. Wanneer bloedmonsters in een ander type glas worden afgenomen is er geen reden om opnieuw te valideren. Wanneer echter wordt overgegaan van heparine buizen op stolbuizen (verschil in antistollingsmiddel), Zal de matrix wezenlijk gaan veranderen en dienen deze matrices op z'n minst te worden vergeleken. 3. Iedere stap in de methode die invloed op het resultaat kan hebben, vanaf de monstername tot en met de analyse zal moeten worden onderzocht. Hierbij kan worden gedacht aan monsternamemateriaal, stabiliteit tijdens opslag en transport, extra verdunning van het monster, en natuurlijk de analysemethode zelf. 4. Een methode zal moeten worden gevalideerd voor het doel waarvoor hij bedoeld is, waarvoor de acceptatiecriteria bekend zijn. Alle uitgevoerde experimenten, resultaten en daaruit getrokken conclusies dienen te worden opgenomen in een validatierapport. 5. De monsters die worden gebruikt tijdens de validatie dienen voor zover mogelijk in dezelfde matrix te worden bereid als de werkelijke monsters. Indien dit niet mogelijk is dient een matrix gezocht te worden die de werkelijke matrix zo dicht mogelijk benadert. 6. Het concentratiebereik waarover de waarbinnen de component(en) bepaald worden dient goed gedefinieerd te zijn. 7. Het gebruikte calibratiemodel dient te worden omschreven en vastgelegd met voldoende standaarden.

3 Te valideren parameters Juistheid en precisie De mate waarin de resultaten afwijken van de theoretische (nominale) waarde en de mate van spreiding tussen de waarden onderling dient te worden bepaald. De precisie is onder te verdelen in een spreiding binnen de dag, de analysespreiding, en een spreiding tussen de dagen. Selectiviteit/Specificiteit Het meetsignaal dient alleen afkomstig te zijn van de te analyseren component ook al zijn er andere componenten in het monster aanwezig. In de praktijk betekent dit dat men moet vast stellen of een monster vrij van te bepalen component een storende res pons geeft. Detectiegrens De detectiegrens is de kleinste concentratie van een te bepalen stof men met een gedefinieerde waarschijnlijkheid kan aantonen. (LLD = LOD = Lower Limit of Detection) Bepalingsgrens De bepalingsgrens (LLQ = LOQ =Lower Limit of Quantitation) is de laagst te kwantificeren concentratie. Lineariteit De meeste bioanalytische methoden waarbij gebruik gemaakt wordt van HPLC, GC, of UV metingen gaan ervan uit dat er een rechtevenredig verband bestaat tussen de hoeveelheid stof en het detectorsignaal. In veel gevallen is deze aanname juist maar er kunnen zich problemen voordoen als het concentratiebereik te groot wordt b.v. : De detectorrespons is niet meer rechtevenredig met de hoeveelheid stof door verzadiging. De hogere concentraties hebben een te groot effect op regressie Stabiliteit De stabiliteit van de componenten is erg belangrijk. Immers, een monster met een instabiele component is niet meer representatief voor het moment van monstername. Daarnaast dient een opgewerkt monster stabiel te zijn tot het moment van analyse dus stabiel in het monstercompartiment van de autosampler. Verdunning In principe is extrapolatie buiten het calibratiegebied bij de concentratieberekening niet toegestaan omdat men getallen produceert in een concentratiegebied dat niet gevalideerd is. Om dit probleem op te lossen wordt het monster in de regel zodanig verdund dat deze wel binnen het calibratiegebied valt. Deze verdunningsstap kan van invloed zijn op de nauwkeurigheid omdat: 1. Er een extra handeling wordt uitgevoerd 2. Er een ander verdunningsmedium wordt gebruikt dan de matrix omdat een blanco matrix niet voorhanden is Recovery De absolute analytische recovery is het percentage aan te bepalen stof wat we overhouden na een complete monstervoorbewerking. Aan de recovery worden geen echte eisen gesteld hoewel het wenselijk is dat deze zo hoog mogelijk is. De recovery is echter wel een belangrijke parameter bij de troubleshooting gedurende de routineanalyses. Daarnaast blijkt het temperatuurseffect groot te zijn bij lagere recoveries iets wat aan het licht komt bij seriële automatische monsteropwerking.

4 Validatiemodel Bij het kiezen van het validatiemodel dient er een middenweg gezocht te worden tussen de hoeveelheid werk en de te verkrijgen informatie. Door de opzet van het model goed te kiezen kan een grote hoeveelheid aan informatie worden gewonnen uit een minimum aantal analyses. Het voorgestelde model bestaat uit drie fasen: 1. Voorbereiding. Tijdens de voorbereiding worden de validatiemonsters bereid 2. Prevalidatie De prevalidatie bestaat uit een aantal experimenten die worden uitgevoerd om te evalueren of verdere analyse zin heeft. Hier wordt het calibratiemodel getoetst, de stabiliteit tijdens analyse getest en de specificiteit/selectiviteit bepaald. Wanneer blijkt dat een van bovengenoemde experimenten een negatief resultaat op te leveren dan moeten we terug naar de tekentafel en het probleem verhelpen. 3. Validatie De eigenlijke validatie bestaat uit een aantal meervoudige analyses waaruit de nauwkeurigheid, recovery, en stabiliteitsgegevens worden berekend. Validatieniveaus Het bereik waarover de methode gebruikt gaat worden dient nauwkeurig te worden vastgesteld aan de hand van de te verwachten concentraties. Denk hierbij ook aan top en dalspiegels. Bij geneesmiddelenstudies is vaak de vuistregel dat de maximaal te verwachten concentraties,cmax en 1%* Cmax moeten kunnen worden gemeten. Het calibratiegebied wordt omsloten door het laagste calibratiepunt (LLQ) en het hoogste calibratiepunt(hlq). Daartussen worden de punten verdeeld waarbij de nadruk in het lage gebied ligt. Een veelgebruikte manier om de calibratiepunten te verdelen is door de concentraties in het lage gebied vanaf de LLQ te "verdubbelen", b. v. 10, 20, 50, 100, 250, 500, 750, Om het gehele concentratiegebied te valideren worden de validatiemonsters op 4 niveaus bereid: 1. LLQ: dit is het concentratieniveau dat gelijk is aan dat van het laagste calibratiepunt. 2. X1: dit is het lage niveau, overeenkomend met 2 a 3 maal de LLQ; 3. X2: deze komt overeen met een concentratie in het middengebied van de calibratielijn 4. X3: dit is het hoge niveau overeenkomend met ongeveer 80% van de HLQ Alle validatiemonsters worden bereid uit een andere stockoplossing dan die waaruit de calibratiemonsters worden gemaakt. Dit is om eventuele weeg en verdunningsfouten uit te sluiten. Tevens geldt dat de concentraties van de validatiemonsters, behalve de LLQ, niet gelijk mogen zijn aan die van de calibratiemonsters.

5 Voorbereiding Tijdens de voorbereiding worden de validatiemonsters bereid. Aan deze stap dient voldoende aandacht te worden besteed omdat de gehele validatie er vanaf hangt. Alvorens met de voorbereiding te beginnen wordt een logboek aangemaakt. Hierin word tenminste het volgende genoteerd: 1. Titel van de bepaling 2. Beschrijving en instellingen van de gebruikte apparatuur 3. Beschrijving van de methode (voorschrift) 4. Bereiding van de standaarden en testmonsters inclusief weegresultaten en verdunningstabellen 5. Beschrijving van de gebruikte reagentia inclusief bereiding 6. Beschrijving van de dagelijkse werkzaamheden a. Reagentiabereiding b. Opgewerkte monsters c. Resultaten van berekende monsters en eventuele uitzonderingen Benodigde hoeveelheid materiaal Bij de bereiding van de calibratie en validatiemonsters wordt uitgegaan van blanco materiaal. Het verdient de aanbeveling dit materiaal van tevoren te testen op storingen. De berekende hoeveelheid is de minimum benodigde hoeveelheid. In de praktijk komt het erop neer dat met een hoeveelheid van 1.5 tot 2 maal dit volume, afgerond naar een nabij gelegen maatkolfvolume, kan worden volstaan. Er kan altijd iets fout gaan tijdens de analyses (Murphy is alive!!) Calibratiecurve In dit model wordt uitgegaan van een calibratiecurve bestaande uit 8 punten zonder blanco. De curve wordt de eerste dag 3 maal opgewerkt en geanalyseerd om het calibratiemodel te testen. Vervolgens wordt iedere dag een calibratiecurve geanalyseerd om de validatiemonsters te berekenen. Dit houdt in dat ieder calibratiepunt ten minste 8 maal wordt opgewerkt. Dit komt dus overeen met tenminste 8 maal het monstervolume. De calibratielijn wordt opgewerkt zoals deze ook tijdens het routinematig gebruik opgewerkt zal gaan worden. Wanneer het bijvoorbeeld de bedoeling is om de calibratiemonsters iedere dag vers te bereiden door kleine hoeveelheden van een standaardoplossing toe te voegen aan een blanco monstermatrix, dan dient deze procedure ook tijdens de validatie gevolgd te worden. De validatiemonsters daarentegen, worden van tevoren bereid in blanco monstermatrix. Wanneer men gebruik wil maken van een éénpunts calibratie, dan wordt dit ook tijdens de validatie gedaan. Het is natuurlijk altijd mogelijk om wel een complete calibratielijn mee te nemen en vervolgens de concentraties zowel op één punt (HLQ) uit te rekenen als op de gehele curve. Specificiteit Om de specificiteit te bepalen worden 6 onafhankelijke blanco matrices geanalyseerd. Dit kunnen 6 monsters zijn van verschillende patiënten waarvan zeker is dat zij de te bepalen componenten niet hebben toegediend gekregen. Selectiviteit De selectiviteit wordt onderzocht door een representatief monster te analyseren waarin zich niet alleen de te onderzoeken component bevindt maar ook één of meerdere stoffen die bijvoorbeeld vaak als comedicatie worden gegeven. Een goed monster hiervoor is de desbetreffende KKGT standaard.

6 Lineariteit Voor de lineariteit worden dezelfde monsters geanalyseerd als voor de calibratie. In wezen komt het er op neer dat er een calibratielijn in triplo wordt geanalyseerd. Ook al maakt men gebruik van eenpunts calibratie (waarbij een lineair verband door de oorsprong wordt verondersteld), dan is de bepaling van de lineariteit des te belangrijker. Stabiliteit autosampler De autosampler stabiliteit wordt op twee niveaus bepaald, een hoog, X3, en een laag niveau, X1. Per niveau wordt er een zodanig aantal monsters opgewerkt dat er van de totale hoeveelheid te injecteren vloeistof (extract) tenminste 16 injecties gedaan kunnen worden. De extracten worden per niveau bij elkaar gevoegd, gemengd en daarna uitgevuld in 16 autosamplervaatjes. Deze vaatjes worden om en om in de autosampler geplaatst en elk uur wordt er een injectie gedaan. Dit houdt in dat er per niveau om de twee uur een injectie wordt gedaan. Door de extracten te poolen is variatie tijdens de opwerking uitgesloten. Nauwkeurigheid De nauwkeurigheid bestaat uit de juistheid, de intra dag spreiding en de inter dag spreiding. Deze worden bepaald op alle 4 niveaus. Gedurende 5 dagen wordt per dag elk niveau in triplo geanalyseerd. Dit houdt in dat er een hoeveelheid aan testmonster wordt aangemaakt moet worden van 3*5*monstervolume. Voor X1 en X3 geldt bovendien dat deze gebruikt gaan worden voor de ASstabiliteit. Het testmonster wordt zodanig uitgevuld in geëtiketteerde buisjes dat er gedurende de validatie dagelijks een onaangebroken buisje in behandeling kan worden genomen. Het restant kan na de validatie worden gebruikt als blijkt dat de stabiliteit gewaarborgd is. Recovery De recovery wordt bepaald door een opgewerkt monster te vergelijken met een oplossing met een concentratie die overeenkomt met 100% recovery. Voor de geëxtraheerde monsters worden de validatiemonsters X1, X2 en X3 gebruikt. De concentratie van de vergelijkingsoplossing is gelijk aan die van het validatiemonster gecorrigeerd voor eventuele verdunning of concentratiestappen en wordt bereid in het medium waarin ook het monster zich bevindt (b.v. eluens of her oplosvloeistof). Dit kan namelijk van invloed zijn op de piekvorm. Vries/Dooi stabiliteit De vries/dooi stabiliteit wordt bepaald op twee niveaus (hoog en laag). Van elk niveau wordt gedurende 5 dagen een triplo analyse uitgevoerd. Dit houdt in dat er een hoeveelheid monstermateriaal wordt aangemaakt overeenkomend met 5*3*monstervolume. Het totale volume wordt uitgevuld in een buis. Het meest correct is om het eerste monster te nemen voordat de buis is ingevroren. Vervolgens wordt de buis ingevroren en elke volgende dag ontdooid om er een (triplo )monster uit te nemen. Verdunning Het verdunningsexperiment wordt uitgevoerd door een hoeveelheid testmonster te verdunnen met blanco matrix tot het uiteindelijke monstervolume. Ook dit experiment wordt per te valideren verdunningsfactor gedurende 5 dagen in triplo uitgevoerd. De concentratie wordt zodanig gekozen dat deze na verdunning halverwege het calibratiegebied uitkomt. De hoeveelheid te bereiden testmonster komt per verdunningsniveau dan overeen met 5*3*( monstervolume/verdunningsfactor).

7 Exta parameters Ionsuppressie LC MS Bij LC MS analyses kunnen we te maken krijgen met ionsuppressie. Dit houdt in dat de mate van ionisatie negatief beïnvloed wordt door een gelijktijdig eluerende component. De mate van ionsuppressie kan worden bepaald door een testmonster te bereiden met een concentratie gelijk aan die van de vergelijkingsoplossingen bij de recoverybepaling maar dan bereid in een extract welke verkregen is door de extractie van blanco matrixmateriaal. Om een beeld te vormen van de mate van ionsuppressie en of deze afhankelijk is van de mate van chromatografische scheiding is aan te tonen door het volgende experiment: Tezamen met het eluens wordt constant een kleine hoeveelheid van de te bepalen component in de MS geleid zodanig dat er een duidelijk stabiele basislijn ontstaat. Vervolgens wordt een blanco extract geïnjecteerd. Op de plaats waar bepaalde matrixcomponenten ionsuppressie veroorzaken is nu een dip in het signaal te zien. Dit betekent dat de retentietijd van de te bepalen component hiermee niet mag samenvallen. Crossreactiviteit Bij immunochemische bepalingen hebben we altijd te maken met crossreactiviteit voor een aantal vergelijkbare stoffen. Dit houdt in dat antilichamen die bij de bepaling gebruikt worden ook reageren met andere componenten dan die waartegen ze opgewekt zijn. In de praktijk betekent dit dat we willen weten of bepaalde co medicatie een storende invloed heeft op de bepaling. De mate van crossreactiviteit is te bepalen door een standaardreeks van b. v. de co medicatie te meten en deze te vergelijken met een reeks van de te analyseren component. Het verschil in helling is dan de mate van crossreactiviteit. Prevalidatie De prevalidatie wordt uitgevoerd door analyse van de volgende monsters: 1. Calibratiecurve in triplo 2. Autosampler stabiliteit: per niveau (X1 en X3) genoeg om 16 autosampler vaatjes te kunnen vullen onafhankelijke blanco matrix monsters 4. Monsters om eventuele ionsuppressie te meten Validatie De volgende 5 dagen worden dagelijks de volgende analyses uitgevoerd: 1. 1 calibratiecurve 2. 3 * LLQ 3. 3 * X * X * X * 0.1. X * 0.1. X3 + I.S * Verdunning 9. 3 * Vries/Dooi hoog * Vries/Dooi laag Het totale schema is weergegeven in tabel 1

8 Tabel 1 Schema validatiemodel Onderdeel Aantal injecties Dag 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4 Dag 5 Dag 6 Totaal Calibratiecurve Specificiteit 6 6 Selectiviteit 2 2 Lineariteit 3*8 24 Stabiliteit AS* 2*16 32 Nauwkeurigheid 3*4 3*4 3*4 3*4 3*4 60 Recovery 3*3 3*3 3*3 3*3 3*3 45 Vries/Dooi 3*2 3*2 3*2 3*2 3*2 30 Verdunning Totaal per dag * autosampler

9 Resultaatverwerking Wanneer de analyses volgens bovenstaande methode worden uitgevoerd kunnen de resultaten worden geëvalueerd m.b.v. onderstaande methoden. Lineariteit: Op de triplo calibratielijn wordt lineaire regressie uitgevoerd die vervolgens geëvalueerd wordt met behulp van ANOVA. Hiermee wordt de Lack Of Fit (LOF) en de Goodness Of Fit (GOF) berekend alsmede de variantiecoëfficiënten per triplo. Uit voorgaand voorbeeld is het volgende af te leiden: de Lack of Fit is significant de CV's van de triplo's zijn laag de afwijkingen t.o.v. de lijn vallen binnen de grenzen (15%, LLQ 20%) Conclusie: Ondanks de significante LOF voldoet het model. De LOF wordt veroorzaakt omdat de analysespreiding erg klein is. Een volgende keer wanneer de analyse wat "ruiger" wordt uitgevoerd en de spreiding in de triplo's groter is, is de LOF niet significant. In dit geval telt dus niet alleen de ANOVA statistiek maar ook de beoordeling van de andere parameters.

10 Stabiliteit De stabiliteit wordt uitgewerkt aan de hand van het volgende voorbeeld: De autosampler stabiliteit wordt uitgerekend door de gevonden responsies uit te zetten tegen de tijd en hier lineaire regressie op toe te passen. Aan de hand van de berekende lijn wordt de responsie op t=0 en op t=30 uur uitgerekend. Het verschil is hierbij een maat voor de stabiliteit. In de regel wordt een afname van 10% in 30 uur als acceptabel beschouwd.

11 Vries/dooi stabiliteit De vries/dooi stabiliteit wordt bepaald door de gevonden concentraties uit te zetten tegen het aantal vries/dooi cycli bijvoorbeeld op de volgende manier: De ANOVA wordt uitgevoerd om te bepalen of de spreiding wordt veroorzaakt door analyse of dat er ook hier werkelijk sprake is van spreiding tussen de vries/dooi cycli. Deze spreiding kan dan worden veroorzaakt door de dag tot dag spreiding en door het vries/dooi effect. Het is mogelijk om voor deze spreiding te corrigeren maar het criterium is in dit geval dat het gemiddelde van de waarnemingen niet meer dan 15% afwijken van het gemiddelde dat bij de precisie experimenten gevonden is. Dit gemiddelde wordt gekozen om een afwijking vast te stellen die niet meer afhankelijk is van de bias van de methode en de bereide validatiemonsters.

12 Juistheid en precisie De juistheid en precisie kunnen worden uitgerekend aan de hand van het volgende voorbeeld: Bij het uitvoeren van de ANOVA worden de berekeningen tot aan de Mean Squares op de gebruikelijke wijze uitgevoerd. Hierna vindt splitsing van de varianties plaats. De MS between is nl een samengestelde parameter en wel op de volgende manier: MS between =? n*? 1 Hierin is? 0 2 MS within de binnen de dag variantie en? 1 de werkelijke dag tot dag variantie. n is het aantal replica's, in ons geval 3. De werkelijke dag tot dag variantie kan dus berekend worden door:? 1 = (MS between MS within )/n Deze uitsplitsing is echter alleen zinvol (toegestaan) als uit de F test blijkt dat ze significant verschillen. In het bovenstaand voorbeeld wordt? 1 op 0 gesteld als blijkt dat: MS between MS wilhin? 0. De bias wordt berekend door het totaal gemiddelde te vergelijken met de nominale waarde. Met behulp van de totale standaarddeviatie kan de significantie van deze bias worden getoetst.

13 Recovery Een mogelijke benadering voor de berekening van de absolute analytische recovery is de volgende: De absolute recovery wordt per dag berekend uit de gemiddelden van de opgewerkte en niet opgewerkte analyses.

14 Verdunning Tenslotte kunnen de verdunningsresultaten op de volgende manier worden uitgerekend:

15 Beoordeling van de resultaten Wanneer de resultaten zijn ingevuld kunnen ze worden getoetst op eventuele uitbijters. Hiervoor zijn verschillende toetsmethoden voorhanden zoals de Grubbs test en de Dixons Q test. Het maakt niet uit welke wordt gebruikt als het maar consequent dezelfde is. Wanneer blijkt dat een parameter onverwachte resultaten oplevert moet worden nagegaan of het resultaat werkelijk dat aangeeft waar het voor beoogd is. Wanneer bijvoorbeeld blijkt de respons bij de autosampler stabiliteit afneemt kan al snel worden geconcludeerd dat de betreffende stof niet stabiel is. Het is daarentegen goed mogelijk dat we te maken hebben met adsorptie aan de autosamplervials en dat dit probleem is op te lossen door silaniseren of door een ander type vials te nemen bijvoorbeeld polipropyleen. We moeten tevens bedachtzaam zijn op resultaten die net binnen de grenzen vallen. Wanneer bijvoorbeeld blijkt dat een component na 30 uur in de autosampler 14.5% is afgenomen kan dit betekenen dat deze afname sneller gaat wanneer de omgevingstemperatuur hoger is. In dit geval dient extra aandacht te worden besteedt aan de conditionering van de autosampler temperatuur. Criteria De criteria worden vooraf vastgesteld en kunnen voor veel bepalingen verschillend zijn. Dit hangt af van de beoogde toepassing. Wanneer deze criteria onbekend zijn kunnen de criteria uit tabel 3 als uitgangspunt dienen. Deze worden internationaal geaccepteerd bij het uitvoeren van geneesmiddelenstudies. Tabel 2: validatiecriteria juistheid Bias +/ 15% Juistheid LLQ bias +/ 20% Precisie CV 15% Precisie LLQ CV 15% Recovery Bij voorkeur >70% Vries/dooi Visueel binnen 1 5% rond nominale waarde Verdunning Bias < 15, CV<10% Autosamplerstabiliteit < 10%

16 Hervalidatie Wanneer een methode is gevalideerd is dit slechts geldig wanneer de routinematige analyses op dezelfde manier worden uitgevoerd als tijdens de validatie. Wanneer men ervoor kiest of gedwongen word om iets aan de methode te veranderen, zal de methode (gedeeltelijk) opnieuw moeten worden gevalideerd. Welk gedeelte opnieuw moet worden gevalideerd hangt af van wat er veranderd is. In principe hoort iedere parameter waarop de verandering van invloed is opnieuw bepaald te worden Dit wordt duidelijk gemaakt in de volgende tabel. Tabel 3: Richtlijnen voor hervalidatie Verandering Selectiviteit Specificiteit Juistheid en precisie Recovery Vries/Dooi Verdunning Matrix O O O O O O Extractie O O O Volume reagens O O IS O(van I.S.) Verd. Medium Detector instelling O O O kolom O O O Indien de matrix wijzigt kan vaak worden volstaan met een matrixvergelijk. Dit kan worden uitgevoerd door in beide matrices één of meerdere calibratiecurves te bereiden en te analyseren. Van de hellingen en de asafsnedes wordt het betrouwbaarheidsinterval berekend en in geval van overlap van de betrouwbaarheidsintervallen wordt aangenomen dat de invloed van de matrix niet significant is. Indien er geen overlap is in de helling betekent dit dat de matrix van invloed is op de bepaling.

17 Hoe nu verder? Wanneer de validatie is afgerond worden de resultaten verwerkt in een validatierapport. Dit kan zeer uitgebreid maar de uiteindelijke resultaten kunnen ook worden opgenomen in het bepalingsvoorschrift. Het is belangrijk dat in het validatierapport een uitgebreide beschrijving van de methode is opgenomen, een beschrijving van de uitgevoerde validatie, de resultaten en conclusies. Tenslotte dient het rapport te worden geautoriseerd. Met het validatierapport in de hand kunnen we nu naar hartelust gaan analyseren. Maar..We moeten wel voldoen aan de beschreven methoden en werkwijzen zoals vermeld in het rapport. Wanneer we hiervan afwijken dienen we ons te realiseren dat de geproduceerde resultaten afkomstig zijn van een niet gevalideerde methode. Ook wanneer er wel aan alle eisen wordt voldaan dient de methode te worden gecontroleerd. Een goede werkwijze is om alvorens met de analyse te beginnen om het gehele systeem te testen middels een testoplossing. Deze oplossing bevat alle voor de methode relevante componenten (hoofdcomponenten, metabolieten, interne standaard) in een bekende concentratie, liefst overeenkomend met de concentratie van een calibratie of controle monster. Hiervoor is de analytische oplossing met de I.S. van de recoverybepaling uitstekend geschikt. Na één injectie hebben we informatie over retentietijd van de pieken, de resolutie, en de gevoeligheid van het systeem. In geval van storing kan deze oplossing gebruikt worden om het probleem te isoleren omdat ze in vergelijking met een opgewerkt controle of calibratiemonster ook informatie geeft over de extractierecovery. Vervolgens moeten er zoveel calibratiepunten worden meegenomen als er ook tijdens de validatie meegenomen zijn. Sommige laboratoria prefereren éénpuntscalibratie. In dit geval moeten de validatieresultaten opnieuw worden uitgerekend op één punt en vervolgens weer worden geëvalueerd Om te beoordelen of een methode nog steeds binnen de specificaties valt worden controlemonsters geanalyseerd. Hierbij is het aan te bevelen om deze QC monsters evenredig te verdelen tussen de routinemonsters met tenminste een aan het einde van de serie. De resultaten van de QC monsters worden uitgezet in Sheward charts. De grenzen van deze charts kunnen worden gebaseerd op de resultaten van de precisie berekeningen of op basis van de maximaal geaccepteerde afwijking. Hiervoor wordt als richtlijn 10% of 15% gekozen. Cross check monsters In veel gevallen waarbij men analyses uitvoert voor een externe opdrachtgever kan deze zelf een aantal monsters bereiden met voor hun bekende concentraties. Deze monsters dienen dan geanalyseerd te worden en de resultaten worden met de opdrachtgever overlegd. Deze monsters bestaan vaak uit replica's van een aantal concentraties verdeeld over het gehele concentratiebereik. Daarnaast kunnen er monsters met veel hogere concentraties voorkomen die dus later moeten worden verdund. Vaak komen ook blanco matrices voor veelal na een hoge concentratie. Dit dient ervoor om de selectiviteit te testen en de carry over. Dit soort testen worden uitgevoerd vanuit de opdrachtgever om het gehele traject van monsterverzending tot en met de rapportage te valideren.

18 Ten slotte Er zijn veel meer vragen dan er antwoorden zijn. Iedereen kan wel iets verzinnen dat niet goed kan gaan en waarom dat niet is meegenomen in de validatie. Er zijn laboratoria die een gedeelte van de validatie overdoen wanneer men van batch methanol verandert. Het is aan een ieder zelf of aan de opdrachtgever hoe ver de experimenten door te voeren. Externe opdrachtgevers kunnen zelf ook validatiemonsters bereiden die geanalyseerd moeten worden en door de opdrachtgever beoordeeld worden. Het is belangrijk om van tevoren vast te stellen welke parameters met wil bepalen en met welke nauwkeurigheid. Hieruit wordt bepaald welke en hoeveel gegevens er nodig zijn om tot dat te kunnen berekenen. Tenslotte worden de experimenten hierop afgestemd. Veel informatie en ideeën over validatie is te vinden in de literatuur maar men dient zich hier niet blind op te staren omdat veel problemen met een paar simpele experimenten kunnen worden opgelost of door gewoon het gezonde verstand te gebruiken.

19 Literatuur Miller, JC en Miller JN, Statistics for analytical chemistry, 3rd edition, Bodbin GB, 1993 Shah e.a., 'Analytical Methods Validation: Bioavailability, Bioequivaience, and Pharmacokinetic Studies. Report presented at Conference held in Washington D.C. USA, December 3 5, 1990', J. Pharm.Sci. 81 (1992), C. Hartman e.a., 'An analysis of the Washington Conference Report on bioanalytical method validation', Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol. 12, 1994, No11, , J.R. Lang and S. Bolton, 'A comprehensive method validation strategy for bioanalytical applications in the pharmaceutical industry 1. Experimental considerations.', Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol. 9, 1991, No. 5, J.R. Lang and S. Bolton, 'A comprehensive method validation strategy for bioanalytical applications in the pharmaceutical industry 2. Statistical analyses.', Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol. 9, 1991, No. 6, Ph. Hubert e.a, The SFSTP guide on the validation of chromatographic methods for drug bioanalysis: from the Washington conference to the laborator/, Analytica Chimica Acta, 391, 1999, D. Dadgar, e.a., 'Application issues in bioanalytical method validation, sample analysis and data reporting', Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol. 13, 1995, No.2, S. Braggio e.a., 'A strategy for validation of bioanalytical methods', Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol 14, 1996, A.R. Buick e.a., 'Method validation in the bioanalytical laborator/, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol 8, 1990, J.W.A. Findlay e.a., 'Validation of immunoassays for bioanalysis : a pharmaceutical industry perspective', Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol 21, 2000, P.Chiap e.a. Validation of an automated method for the liquid chromatofraphic determination of atenolol in plasma: application of a new validation protocol', Analytica Chimica Acta, 391, 1999, C. Muller e.a., 'Ion suppression effects in liquid chromatography electrospray ionisation transportregion collission induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries', Journal of chromatography B, 773, 2002,

20