University of Groningen. Modifications of collagen and chromatin in ECM-related disease Gjaltema, Rutger Almer Friso

Transcriptie

1 University of Groningen Modifications of collagen and chromatin in ECM-related disease Gjaltema, Rutger Almer Friso IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2016 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Gjaltema, R. A. F. (2016). Modifications of collagen and chromatin in ECM-related disease: Uncovering therapeutic targets for fibrosis and cancer [Groningen]: Rijksuniversiteit Groningen Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 CHAPTER 11 Nederlandse samenvatting

3 Chapter 11 Nederlandse Samenvatting De extracellulaire matrix (ECM) bestaat uit een complex web van proteïnes en glucose verbindingen dat zich buiten de cel tot een complex netwerk vormen. De matrix zorgt voor versteviging van weefsels en kan wel vergeleken worden met specie tussen de stenen van een huis. Alhoewel, in de laatste jaren hebben veel bevindingen aangetoond dat de functie van ECM veel verder gaat dan het bieden van ondersteuning en zoal zorgt voor communicatie tussen cellen, handhaven van cel identiteit en homeostase. Het meest voorkomende component van ECM zijn de collageen eiwitten. Van de 28 verschillende collageen types die voorkomen in het menselijk lichaam, zijn de fibrillaire collagenen zoals collageen type I het meest voorkomende en het meeste onderzocht. Collageen is essentieel voor het normaal functioneren van weefsel en een disbalans in de productie hiervan kan een scala aan verschillende ziekte genereren of bespoedigen. Een veel voorkomende pathologische aandoening is fibrose, wat met name gekarakteriseerd wordt door een excessieve productie van collageen type I. Fibrose is wereldwijd een grote last en er alleen al in VS wordt geschat dat van alle jaarlijkse overledenen 45% daarvan een fibrotische grondslag heeft. Gezien er op dit moment nog geen goedwerkende medicijnen beschikbaar zijn die fibrose kunnen stoppen, is er meer onderzoek nodig naar de onderliggende processen die deze ziekte veroorzaken en gaande houden. In dit proefschrift hebben we op verschillende niveaus onderzocht hoe fibrose geïnitieerd wordt en komen met nieuwe bevindingen hoe fibrose geremd zou kunnen worden. Een belangrijke eigenschap van collageen eiwitten is dat tijdens de aanmaak in de cel ze veelvuldig chemische modificaties ondergaan die essentieel zijn voor het genereren van de uiteindelijke structuur en biologische functies. Wanneer er fouten optreden in het aanbrengen van deze modificaties, o.a. door mutaties in genen die een rol spelen in die modificaties, kunnen er verschillende erfelijke ziekten ontstaan. In hoofdstuk 2 geven we aan de hand van de beschikbare kennis een overzicht over welke enzymen en modificaties nodig zijn voor correcte aanmaak van collageen en wat er gebeurd als deze processen door genetische mutaties geblokkeerd worden. Weefsels zoals botten en pezen die veelvuldig blootgesteld worden aan intensieve krachten, bevatten een hoge hoeveelheid collageen fibrillen die verknoopt worden voor extra benodigde stevigheid. In zacht weefsel zoals huid en interne organen komen deze collageen verknopingen normaliter niet of nauwelijks voor. Echter, wanneer deze zachte weefsels aangetast zijn door fibrose bevatten ze naast een verhoogde hoeveelheid collageen type I ook veelvuldig verknopingen. Dit zorgt er vervolgens voor dat het collageen in fibrotisch weefsel niet of nauwelijks afgebroken kan worden en er zo een onomkeerbare vorm van fibrose ontstaat met als consequentie het uiteindelijke verlies van orgaanfunctie. Het enzymatisch gedreven verknopen begint bij het hydroxyleren van het aminozuur lysine in de uiteinden van collageen door het enzym lysyl hydroxylase 2 (LH2). Het fundamenteel begrijpen hoe het LH2 enzym zijn activiteit heeft op collageen kan daarom van groot belang zijn voor het omkeren van fibrose. Een van de erfelijke collageen-gerelateerde ziekten is Bruck syndroom, en 280

4 Nederlandse samenvatting wordt veroorzaakt door mutaties in zowel het gen voor FKBP65 (FKBP10) als voor LH2 (PLOD2). Interessant is dat mutaties in een van beide genen dezelfde lichamelijke karakteristieken lieten zien, namelijk vergroeiingen van bot en veelvuldige breuken. Op moleculair niveau wordt dit gelieerd aan een afwezigheid van collageen verknopingen. Echter, aangezien FKBP65 niet de enzymatische activiteit bezit voor het hydoxyleren van lysine bleef het lang een raadsel waarom mutaties in FKBP10 hetzelfde effect laten zien als in PLOD2. In hoofdstuk 3 hebben we ontrafeld dat LH2 en FKBP65 aan elkaar binden en dat de activiteit van FKBP65 ervoor zorgt dat LH2 in staat wordt gesteld om zijn actieve form aan te nemen. In feite geeft dit aan dat zonder FKBP65, LH2 geen collageen kan hydroxyleren en dus geen collageen verknopingen kunnen ontstaan. Dit maakt naast LH2, FKBP65 een optie om collageen verknopingen te verminderen tijdens fibrose met gangbare medicijnen zoals Tacrolimus. Naast fibrose, wordt LH2 veelvuldig gedetecteerd in vergevorderde kankers die hun oorsprong hebben in verscheidene organen. Wanneer de aanwezigheid van LH2 geblokkeerd wordt, verminderen tevens eigenschappen die belangrijk zijn voor verspreiding van kanker in het lichaam. Daarom wordt LH2 als een potentieel therapeutisch doel gezien voor verschillende types kankers. Verschillende onderzoekers hebben eerder gesuggereerd dat de collageen verknoping functie van LH2 een rol speelt in deze kankers, alleen miste sterk overtuigend bewijst voor deze hypothese. In hoofdstuk 4 hebben wij dit vraagstuk op een andere manier bekeken. Onze bevindingen tonen aan dat de cellulaire locatie van LH2 zich niet limiteert tot de plek waar het zich normaliter bezighoud met collageen lysine hydroxylatie, maar zich additioneel bevindt in de celkern waar DNA zich bevindt. Daarnaast hebben we aangetoond dat LH2 aan verscheidene kanker-gerelateerde genen bind en tevens hun activiteit veranderd. Hierbij bieden we de eerste doch essentiële bewijzen over het functioneren van LH2 tijdens kanker, wat uiteindelijk meer inzicht bied over de ontwikkeling van deze ziekte. Op dit moment zijn er nog geen farmaceutische middelen bekend die LH2 kunnen remmen, voor bijvoorbeeld behandeling van fibrose maar ook kanker. Een mogelijke manier om ervoor te zorgen dat de effecten van LH2 in deze ziekten verminderd worden is het inactiveren van het PLOD2 gen. Om dit te realiseren is het noodzakelijk om in kaart te brengen welke factoren een bijdrage leveren aan PLOD2 activatie. De groeifactor TGFβ1 is een belangrijke initiator van signaal routes die leiden tot fibrose. In hoofdstuk 5 hebben we daarom specifiek naar de TGFβ1 signaal route gekeken en hoe deze de aanwezigheid van LH2 verhoogd tijdens fibrose door veranderingen in de activiteit van het PLOD2 gen. Met name hebben we gezocht naar chemische modificaties aan eiwitten die DNA omwikkelen (histonen) en andere eiwitten die aan DNA binden en activiteit van een gen kunnen reguleren (transcriptie factoren). Zo hebben we twee transcriptie factoren gevonden die direct gerelateerd konden worden aan de aan verhoogde activiteit van PLOD2 en dus aanwezigheid van LH2. Tevens hebben we een aantal modificaties van histonen gevonden, die wanneer de daarvoor verantwoordelijke enzymen geïnactiveerd worden, wellicht ook mogelijke therapie kunnen vormen om LH2 en dus collageen verknopingen te verminderen in fibrose. 281

5 Chapter 11 De epigenetica omvat de leer van modificaties aan DNA en histonen (epigenetische modificaties) en hoe deze een effect hebben op de activiteit van genen. Uit veelvuldig onderzoek is gebleken dat verscheidene epigenetische modificaties invloed hebben op vele belangrijke cellulaire processen alsook ziekten. In hoofdstuk 6 hebben we specifiek gekeken naar lysine trimethylatie van histone H3 (H3K27me3) in relatie tot endotheel-tot-mesenchymaal transdifferentiatie (EndMT). Dit proces blijkt een bijdrage te leveren aan fibrose. We vonden dat de verminderde aanwezigheid en activiteit van het enzym EZH2, dat verantwoordelijk is voor H3K27me3, de activiteit van het TAGLN gen verhoogd door een eveneens vermindering van H3K27me3 op het TAGLN gen tijdens kunstmatige stimulatie van EndMT. Aangezien TAGLN nodig is voor bepaalde eigenschappen van fibrotische cellen kunnen deze bevindingen bijdragen aan het beter begrijpen hoe fibrose-gerelateerde genen geactiveerd worden vanuit EndMT. Eerdere bevindingen door derden hebben al aangetoond dat bepaalde epigenetische modificaties een basis vormen tijdens de ontwikkeling van fibrose. Aangezien nog weinig bekend was over de rol van DNA cytosine hydroxymethylatie (5hmC) in fibrose, hebben we in hoofdstuk 7 onderzocht of de enzymen die verantwoordelijk zijn voor deze modificatie, behorende tot de TET-familie, de ontwikkeling van fibrose beïnvloeden op gen niveau. Door middel van functie verlies experimenten hebben we kunnen aantonen dat met name TET2, maar ook TET1 een fibrose-bevorderende functie hebben. Beide enzymen reguleerden namelijk de activiteit van genen die coderen voor specifieke transcriptie factoren en ECM eiwitten die fundamenteel ten grondslag liggen aan ontwikkeling van fibrose. Screening van 5hmC toonde tevens aan dat deze modificatie sterk verhoogd is in fibrotische cellen en tevens op genen die een rol spelen in fibrose. We tonen dus in feite aan dat wanneer de aanwezigheid van TET1 en TET2 verminderd wordt in fibrotische cellen, het een mogelijkheid biedt om fibrose een halt toe te roepen. De kracht van epigenetische modificaties is dat ze zowel kort alsook langdurend effect kunnen hebben op gen activiteit. In tegenstelling tot mutaties aan het DNA zijn epigenetische modificaties omkeerbaar en kunnen daarmee genen zowel aan en uit zetten. Dit maakt deze modificaties potentieel geschikt om ziektegerelateerde genen gericht aan en uit te zetten door een biotechnologische innovatie genaamd epigenetisch editen. In hoofdstuk 8 hebben we epigenetisch editing tools ontworpen gebaseerd op zink vinger eiwitten die we fuseerden aan een DNA methylerend enzym en een katalytisch inactief repressief eiwit om gen repressie te induceren. De zink vinger eiwitten waren zo ontworpen dat we deze gericht op verschillende locaties van het PLOD2 gen konden laten binden met als doel het gen te inactiveren in fibrotische cellen en borstkanker cellen. Inderdaad, na toevoeging van deze editing tools aan deze cellen vond een sterke reductie van PLOD2 activiteit plaats. Maar nog belangrijker, deze effecten waren langdurig zichtbaar zelfs na de verwijdering van de editing tools. We vonden tevens dat dit gerelateerd was aan grote veranderingen van epigenetische modificaties aan het PLOD2 gen. Onze resultaten laten dus zien dan epigenetisch editen grote potentie heeft om ziekte-gerelateerde genen langdurig uit te zetten na een kortstondige blootstelling aan de tools. Daarmee opent ons onderzoek deuren naar nieuwe vormen van medisch ingrijpen waarbij 282

6 Nederlandse samenvatting slechts een enkele dosis nodig is. Tijdens verschillende vormen van kanker zijn er specifieke genen, genaamd tumor suppressor genen, inactief geworden die normaliter de ontwikkeling van kanker zouden remmen. Het reactiveren van dit soort type genen zou dus een gunstig effect kunnen hebben op de remming van kanker. In hoofdstuk 9 hebben we wederom gebruik gemaakt van epigenetisch editing tools om dit maal bepaalde inactieve genen te reactiveren. We hebben ten eerste gekeken naar de effecten van een herintroductie van de H3K4me3 modificatie op deze genen. We vonden dat inderdaad deze genen actief werden door blootstellen aan CRISPR/dCas9 dat gefuseerd was met een H3K4me4 enzym en het gericht naar de betreffende genen bracht. Interessant genoeg waren de effecten voor het model gen PLOD2 langdurig zichtbaar, maar voor het andere gen (EPCAM) niet. Dit bleek te komen door het aanwezige niveau van DNA methylatie dat het positieve effect van H3K4me3 op lange termijn neutraliseerde. Tevens zagen we dat wanneer we een andere modificatie (H3K79me3) tegelijkertijd introduceerde tezamen met H3K4me3, dit een versterkend effect gaf op de activiteit van beide genen. Voor EPCAM was dit met name het geval wanneer de DNA methylatie eerst verwijderd was van het gen. Met deze resultaten geven we niet alleen de mogelijkheid weer van reactivatie van inactieve genen, maar tevens tonen we aan hoe de verschillende modificaties hun rol hebben in het reguleren van genen. Het doel van dit proefschrift was om meer inzicht te vergaren welke moleculaire processen een rol spelen voor de ontwikkeling van ECM-gerelateerde ziekten zoals fibrose maar ook bepaalde kankers. Dit hebben we bewerkstelligt op drie verschillende niveaus, namelijk: het beter karakteriseren van collageen verknopingen, het ontdekken van epigenetische modificaties en enzymen die hierin een rol spelen, en gebruik maken van de kracht van epigenetische modificaties om voor bepaalde genen hun activiteit te moduleren. Dit alles zorgt voor verschillende nieuwe invalshoeken voor het beter begrijpen van de processen die leiden tot deze ziekten, maar ook nieuwe mogelijkheden om hierop in te grijpen. 283

7