University of Groningen. Dystrophic epidermolysis bullosa van den Akker, Peter

Transcriptie

1 University of Groningen Dystrophic epidermolysis bullosa van den Akker, Peter IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2013 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Akker, P. C. V. D. (2013). Dystrophic epidermolysis bullosa: novel insights into the genotype-phenotype correlation and somatic mosaicism Groningen: s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Summary

3 The topic of this thesis is the heritable blistering disorder dystrophic epidermolysis bullosa (DEB). DEB is one of the four major types of epidermolysis bullosa (EB), a heterogeneous group of disorders that involve skin blistering after minor trauma or friction and that can be accompanied by a variety of extracutaneous manifestations. DEB is caused by mutations in the COL7A1 gene. This gene has 118 exons and encodes the non-fibrillar type VII collagen α1 precursor chain (pro-α1(vii) procollagen peptide), three of which assemble into procollagen VII homotrimers. After excretion from the basal keratinocyte, the major source of type VII collagen production, two of these homotrimers align in an antiparallel way to form mature type VII collagen dimers. Ultimately, large numbers of these dimers aggregate to form the anchoring fibrils. Anchoring fibrils conclude the hemidesmosomal epidermal-dermal adhesion complex at the dermal side and are involved in tightly anchoring of the epidermis to the underlying dermis. Defective type VII collagen leads to a weakened epidermal attachment and, consequently, to skin fragility and a DEB phenotype. DEB can be inherited either autosomal recessively (RDEB) or dominantly (DDEB). The DEB phenotype covers a spectrum from the most severe RDEB, severe generalized (RDEB-sev gen) subtype to the mildest DDEB, nails only (DDEB-na) subtype. RDEB-sev gen is characterized by neonatal-onset generalized blistering, extensive scarring that results in mitten deformities of the hands and feet due to fusion (pseudosyndactyly) of the digits in childhood, nail dystrophies, mucosal erosions, growth retardation, and a life expectancy that is reduced to years due to the exceptionally high risk of squamous cell carcinomas. The other subtypes are usually milder, and DDEB is usually less severe than RDEB. Previous research has shown that the precise effect of a COL7A1 mutation (i.e. the genotype) on protein function determines which subtypes of DEB a patient could develop (i.e. the phenotype), which has resulted in general genotype-phenotype correlation concepts. Mutations reducing the amount of wild-type type VII collagen act recessively and generally cause the severest RDEB phenotypes of the DEB spectrum, whereas missense and splice-site mutations that alter the structure of the protein can act either recessively or dominantly and cause milder phenotypes. DDEB is usually caused by a specific class of missense mutations, the glycine substitution, where an invariable glycine residue of one of the many collagenous Gly-Xaa-Yaa triplet repeats is mutated. Not all glycine substitutions, however, act dominantly and some can only cause RDEB. There are other exceptions to these general genotype-phenotype correlation rules and, moreover, for some of the rarer phenotypes the genotype-phenotype correlation is only now beginning to emerge. Many aspects of the pathogenesis of DEB remain elusive. The aims of this thesis The general aim of this thesis was to expand the understanding of the pathogenesis of DEB by exploring the Dutch EB database of the Groningen Centre for Blistering Diseases (head Prof. 282

4 Summary M.F. Jonkman). This is the EB Center of Expertise in the Netherlands and most of the Dutch EB patients have visited it at least once. Information about their clinical phenotype, family history, results of immunofluorescence and electron microscopy studies on skin biopsies, as well as results of mutation analysis, have been stored in the database since Per May 2013, the Dutch EB database contained data on 346 different families and is thus a valuable source for EB research. To achieve this aim, my project defined three major objectives. Part One of this thesis covers the first two objectives. The first objective was to assess the genotype-phenotype correlation for the major DEB subtypes in the Dutch population. A full understanding of the genotype-phenotype correlation is essential for accurate phenotype prediction, optimized and personalized genetic counseling, further unraveling the pathogenesis, substantiating the role of genetic and nongenetic disease-modifying factors, and selecting patients for clinical trials. The second objective of my thesis was to build a public, online database containing all available clinical and molecular information of published and unpublished DEB patients. Studying the genotype-phenotype correlation provides important insights into the disease, but these can only be utilized optimally if the information coming from such studies is collected in an online database that is accessible to all medical professionals and researchers worldwide. Part Two of this thesis covers my third objective: to substantiate the disease-modifying role of somatic mosaicism in DEB. Somatic mosaicism refers to the co-existence of mutant and wildtype cell populations in the body, which results in a mosaic disease distribution. In forward mosaicism, the germline is wild-type and a pathogenic mutation has arisen during embryonic development, which leads to a segmental disease phenotype. In revertant mosaicism the germline is mutant, but in a portion of cells the effect of the mutations is corrected by a somatic event, which leads to normal protein production and a healthy skin patch. Both forward and revertant mosaicism can thus be regarded as disease-modifiers. Introductory chapters 1 to 3 Before the three objectives are worked out, this thesis starts with three general, introductory chapters, in which I present and explain its context. Chapter 1 introduces basic concepts about the skin, its development and structure, and the hemidesmosomal adhesion complex. Next, it zooms in on EB as the group of heritable disorders that are caused by genetic defects in any of the genes encoding the molecules of this adhesion protein complex. The focus of this chapter is on the clinical and molecular aspects of DEB, its causative gene and the mutations therein, and the known genotype-phenotype correlation concepts. This chapter subsequently describes in 283

5 detail the phenomena of forward and revertant mosaicism in general and in EB particularly. Throughout this chapter, the questions that formed the basis for the studies described in this thesis are introduced. The chapter concludes with the aims and outline of this thesis. Chapter 2 places the topics described in this thesis in a historical perspective. It summarizes the major historical landmarks and achievements in DEB research, from the very first publications on DEB in the late 19 th century to the discovery of the COL7A1 gene as the disease-causing gene in the early 1990s. This chapter explains many of the names and concepts frequently found in the DEB literature and throughout this thesis. It shows how much work needed to be done to reveal the cause and pathogenesis of DEB, to reach consensus about the classification of the disease subtypes, and to enable correct disease diagnosis and prenatal testing. And it highlights that there is still much to do! To study the pathogenesis of any genetic disease, it is crucial that the causative mutations have been identified in the families under study. For COL7A1 only a few mutations are specific to certain populations owing to founder effects and only a few mutational hotspots exist. Most mutations are, however, unique to families and are scattered throughout the entire 118 exons of the gene. This emphasizes the need for a sensitive, reliable, and efficient mutation scanning strategy. We therefore developed a conformation-sensitive capillary electrophoresis (CSCE) system for COL7A1 mutation scanning. In chapter 3, the design and analytical validation of this technique for use as a COL7A1 mutation pre-screening tool in a diagnostic molecular genetics service laboratory is described. The CSCE technique is based on the principle of heteroduplex formation when PCR-amplified DNA fragments containing heterozygous sequence changes are slowly re-annealed. These fragments have different migration characteristics than wild-type fragments and can be distinguished on a multi-capillary automated sequencer if fluorescently labeled. Validation of the CSCE system was performed by analysis of 29 known COL7A1 sequence changes, covering 33% of amplicons. After optimization of the conditions, all 29 sequence changes were detected by the system, irrespective of the length or CG-content of amplicons and position of sequence changes, reflecting an analytical sensitivity of 90.2%-100% (95% confidence interval). We concluded that this CSCE system is a rapid, reliable, cost-effective, and highly sensitive way of scanning for COL7A1 mutations in a molecular genetics service laboratory. When we developed the CSCE system, it was a state-of-the art technique fulfilling all the requirements of modern-day DNA-diagnostics. Nowadays, however, in the next-generation sequencing era, it is justified to question whether there is still room for such pre-screening techniques. 284

6 Summary Part One: the genotype-phenotype correlation for DEB Part One of this thesis comprises chapters 4-7 and goes on to focus on the genotype-phenotype correlation for the different subtypes of DEB and the database we built for this purpose. In chapter 4 the genotype-phenotype correlation study for RDEB is described. We studied the 33 Dutch RDEB families that were available at that time from the Dutch EB database. For all patients, extensive clinical follow-up data (up to 19 years), detailed type VII collagen immunostaining, electron microscopy results, and COL7A1 genotypes were available. We identified 20 novel COL7A1 mutations, further expanding the large number of unique mutations. In 14 out of 15 RDEB-sev gen patients, type VII collagen was completely absent and bi-allelic null mutations were found, as was expected from the current genotype-phenotype correlation rules. One RDEB-sev gen patient, carrying two null mutations, had strongly reduced, although not absent, type VII collagen staining, which is not expected in the presence of two null mutations. Five out of 11 patients with the RDEB, generalized other (RDEB-O) phenotype developed pseudosyndactyly of the fingers preceded by skin atrophy and flexion contractures in late childhood and adolescence. All five had esophageal involvement and growth retardation. Type VII collagen immunostaining ranged from strongly reduced to slightly reduced in RDEB-O patients with pseudosyndactyly, whereas RDEB-O patients without pseudosyndactyly had slightly reduced to normal type VII collagen staining. The strongly reduced type VII collagen staining intensity thus predicted an RDEB-O phenotype with pseudosyndactyly. Both groups did not differ markedly in genotypes, although we unexpectedly found bi-allelic null mutations in two out of five RDEB-O patients with pseudosyndactyly. mrna analysis could not reveal why these patients produced some type VII collagen that prevented the most severe phenotype. We therefore speculated that translational read-through was the rescue mechanism in these patients. Follow-up studies later showed that alternative splicing occurs in the region of their mutations, which rescued their phenotype slightly (chapter 11). We concluded that pseudosyndactyly occurs in approximately half of RDEB-O patients. The positive type VII collagen staining in three patients with bi-allelic null mutations, leading to a milder-than-expected phenotype in two, demonstrates that the phenotype in RDEB cannot always be simply predicted from the COL7A1 genotype. Skin biopsies should always be analyzed if the phenotype is different to that predicted from the genotype. In chapter 5, the results of our genotype-phenotype correlation study into the inversa subtype of RDEB (RDEB-I) are described. RDEB-I is a rare variant of DEB, characterized by blistering of the body flexures, trunk, and mucosae. Prior to our study, the cause of this subtype, with its typical distribution, was largely unknown and its genotype-phenotype correlation had not been studied extensively. Our aim was therefore to gain more insight into the pathophysiology of the intriguing RDEB-I phenotype by studying the genotype-phenotype correlation. This study was conducted in close collaboration with the group of Prof. J.A. McGrath, St. John s Institute for 285

7 Dermatology, London, UK. We studied the genotypes of 20 Dutch and British RDEB-I patients, the largest cohort of RDEB-I patients ever studied, and of the genotyped RDEB-I patients reported in the literature. All 20 patients had generalized blistering at birth and during early infancy. The age of transition from generalized to inversa distribution was before the age of 4 years in most patients. We noted a spectrum of disease severity, ranging from the mildest mucosal only phenotype, in which there was no skin involvement, to the severest phenotype, in which there was also limited acral involvement. The 29 genotypes of our RDEB-I patients and those reported in the literature revealed that RDEB-I is associated with a specific set of recessive arginine and glycine substitutions in the triple-helix domain of type VII collagen. The p.arg2069cys mutation was the most frequent mutation identified and seems to be a specific inversa mutation. We could not identify clear differences in the location and nature of the substituting amino acids between these mutations and the recessive arginine and glycine substitutions causing other RDEB phenotypes. Why these specific arginine and glycine substitutions cause the inversa distribution thus remains unknown. The restriction of phenotypic expression to those body locations where the skin/mucosal temperature is higher than elsewhere on the body led us to hypothesize that the higher skin temperature in the affected areas plays an important role in the pathophysiology of RDEB-I. Permanent cooling of affected areas could be an interesting therapeutic option to test. Dominant DEB is usually caused by substitutions of one of the invariant glycine residues in the type VII collagen triple-helix domain, exerting dominant negative interference. Chapter 6 describes our genotype-phenotype correlations study on DDEB. In this study, we analyzed the clinical and molecular data of 72 DDEB patients from 35 families available from the Dutch EB database. We identified 19 different COL7A1 mutations, including five novel mutations and two Dutch founder mutations, p.gly2076val and p.gly2713asp. The two mutations most frequently reported in DDEB, p.gly2034arg and p.gly2043arg, together account for approximately 25% of Dutch DDEB families. In agreement with well-known genotype-phenotype correlation concepts, 18 mutations are typical dominant glycine substitutions in the type VII collagen triplehelix domain, 63% of which reside in the exon hotspot region. We were, however, unable to determine more specific genotype-phenotype correlation patterns, only some tentative ones. Marked interfamilial and intrafamilial variability was the rule for most of the mutations, which indicates that other modifying factors besides the causative mutation strongly influence the disease outcome. The one non-glycine substitution mutation was the c t>g transversion in intron 73. mrna analysis showed that this mutation led to in-frame skipping of exon 74. A recent observation of in-frame skipping of exon 74 caused by a deletion of the penultimate nucleotide of exon 74 in a Japanese DDEB family supports our idea that in-frame skipping of exon 74 has a dominant negative effect and causes a DDEB phenotype. 286

8 Summary Chapter 7 presents the International DEB Patient Registry. A large number of unique COL7A1 mutations have been shown to underlie DEB and huge amounts of genotype-phenotype information has accumulated as a result of many studies in various populations, including ours (chapters 4-6). We felt that all the available information should be freely accessible from one central location to every medical professional and researcher working on DEB. Moreover, the genotype-phenotype correlation has still not been completely unraveled, especially for some of the rare subtypes. In further dissecting the genotype-phenotype correlation in DEB, it is crucial to have a central database that contains all the available information on DEB patients phenotypes and genotypes. We therefore constructed the International DEB Patient Registry ( aimed at worldwide collection and sharing of phenotypic and genotypic information on DEB. In May 2011 (the official release date), this MOLGENIS-based registry contained detailed information on 508 published and 71 unpublished patients, and their 388 unique COL7A1 mutations. Submission wizards allow users to quickly and easily share new information. This registry will be of great help in diagnosing the disease type accurately and for genetic counseling. It will also lead to novel insights, especially in the rare phenotypes. Altogether, this registry will greatly benefit the DEB patients. The registry currently contains data on 669 DEB patients and their 425 unique COL7A1 mutations, emphasizing the ongoing nature of this project. Recently, another online database, the COL7A1 Variant Database (www. col7.info), has been released by a Polish group with largely the same goals as our own. We have therefore agreed to collaborate closely to make these invaluable tools work for the best for the EB community. Part Two: somatic mosaicism in DEB Part Two of this thesis concerns the disease-modifying role of somatic mosaicism, both forward and revertant, and includes chapters 8, 9, and 10. In chapter 8, we report the first DEB family with proven forward somatic mosaicism. Apart from one report of germline mosaicism in a DDEB family, i.e. a form of forward mosaicism confined to the germ cells, forward mosaicism had not been described for DEB. We identified the dominant hotspot mutation p.gly2034arg in a patient with the pruriginosa subtype of DDEB. We meticulously examined the parents skin for any DEB symptoms, but both were completely negative. To our surprise, we identified the p.gly2034arg mutation in a proportion of the mother s lymphocytes. Additional studies using pyrosequencing revealed that she carried the mutation in 20-50% of her skin cells, equivalent to a proportion of 10-25% mutant pro-α1(vii) procollagen chains, compared to 50% in nonmosaic patients carrying the mutation in 100% of cells. Because the mother did not express any DEB symptom, the threshold for developing DDEB must be higher than 10-25% mutant pro-α1(vii) procollagen, although the exact threshold likely differs per mutation. 287

9 This case emphasizes that mutation analysis should always be performed in the parents of sporadic DDEB patients to confirm the diagnosis of DDEB and the de novo status of the mutation. Such tests will ultimately reveal the frequency of true de novo mutations and somatic mosaicism in carrier parents, which has important implications for genetic counseling as it makes a large difference in the recurrence risk between as high as 50% or less than 1%. We also recommend performing mutation analysis in a buccal swab once the mutation has been excluded in parental blood samples, as a mutation might be present in some tissues but not in others. If no mutation is found in either sample, the recurrence risk is likely to be low. A small probability of parental germline mosaicism should, nonetheless, always be kept in mind and the option of prenatal diagnosis should always be discussed. In chapter 9 we describe a 21-year-old man with RDEB carrying the homozygous germline nonsense mutation c.6508c>t (p.gln2170x). He reported an unaffected skin patch on his neck where blisters had never occurred, not even after scratching, and that had been there as long as he could remember. Immunofluorescent staining of type VII collagen was normal in 80% of the biopsy sections from his unaffected skin, but it was strongly reduced in biopsy sections from his affected skin. DNA and mrna analyses revealed that the somatic point mutation c.6510g>t reverted the germline nonsense codon to a tyrosine codon (p.gln2170tyr) in the unaffected skin patch. This reversion restored type VII collagen production, which, although harboring a missense mutation, appeared to be functionally stable, as the skin integrity in the unaffected skin patch was not impaired. This patient was the third RDEB patient in whom revertant mosaicism was identified within a short time and revertant mosaicism therefore seems to be more common in RDEB than previously anticipated. Systematic examination of patients with RDEB will likely reveal more patients with revertant patches. This is important because this natural gene therapy phenomenon may provide opportunities for revertant cell therapy. Using autologous revertant cells would circumvent the issues of immunorejection related to the treatment with allogenic wild-type skin grafts or bone marrow transplantations. If revertant cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (ipscs), they would provide an unlimited source of corrected patientspecific stem cells. Subsequent differentiation of these revertant ipscs into hematopoietic or mesenchymal stem cells would provide a patient-own alternative for allogenic bone marrow stem cell transplantation. Altogether, identifying revertant patches in an increasing number of patients may pave the way for an exciting new class of therapeutic opportunities. Because of the exciting therapeutic potential of revertant mosaicism, it is essential to identify revertant patches in EB patients. In recent years, revertant mosaicism has been identified in all major EB types. Moreover, it was proven to occur in 60% of Dutch patients with generalized non-herlitz junctional EB and, on clinical inspection, it seems to be present in all patients with this subtype. We therefore hypothesized that revertant mosaicism should be expected in all 288

10 Summary patients with recessive EB, which would be good news with regard to the future application of revertant cell therapy. In chapter 10, we tested this hypothesis by using a mathematical developmental model. We estimated the probability that revertant patches will occur in the skin of patients with a recessive subtype of EB due to single nucleotide reversions. Our model shows that the probability that single nucleotide reversions occur in the skin of those patients asymptotically approaches 1. Reverse mutations are expected to occur frequently in their skin (estimated 216 ). However, they should occur early in embryogenesis to produce recognizable revertant patches, which are predicted to occur in only one per approximately 10,000 patients. This is a substantial underestimate compared to our clinical observations, which can only be partly explained by the limitations of our model, like ignorance of cell loss and hierarchy among basal keratinocytes. To explain this underestimation, we postulated the late-but-fitter revertant cell hypothesis: we believe that reverse mutations arise at later stages of development (at a stage where the probability that they occur has approached 1), but provide revertant cells with such a selective growth advantage over their mutant neighbors that they can develop recognizable patches. This hypothesis is supported by the growth patterns of revertant patches into adjacent Blaschko-lines, which indicate that revertant cells develop at a stage when embryonic skin organization has ended. The developmental model predicts that, in theory, revertant cells are also present in affected tissues in other genetic conditions. If these cells can be identified and isolated, this could also offer novel opportunities for autologic revertant cell therapy for other genetic disorders. Discussion and concluding remarks In chapter 11 the general discussion chapter I place all the results of the studies described in this thesis in a broader perspective. I also present recommendations and suggestions for future research to test the various hypotheses deduced from these results to further increase our insights into the pathogenesis of DEB, the role of genetic and non-genetic disease-modifiers, the role of somatic mosaicism, and the development of therapeutic options. This chapter also highlights the practical implications of our results with respect to phenotype prediction, genetic counseling, and therapy development. I hope the reader will contemplate on the ideas and hypotheses presented in this thesis, and that they will contribute to the emergence of new ideas that will ultimately be of benefit to the patients with DEB. 289

11

12 Nederlandse samenvatting

13 Het onderwerp van dit proefschrift is de erfelijke blaarziekte dystrofische epidermolysis bullosa (DEB). DEB is één van de vier hoofdtypen van epidermolysis bullosa (EB), een heterogene groep van erfelijke aandoeningen waarbij blaren ontstaan na minimale wrijving of frictie en waarbij verschillende extracutane verschijnselen kunnen optreden. DEB wordt veroorzaakt door mutaties in het COL7A1 gen, dat 118 exonen bevat. COL7A1 codeert voor het α1 voorloper molecuul (het pro-α1(vii) procollageen peptide) van het non-fibrillaire type VII collageen. Drie pro-α1(vii) procollageen ketens binden samen tot één procollageen VII homotrimeer. Nadat deze homotrimeren zijn uitgescheiden door de basale keratinocyten, de belangrijkste bron van type VII collageen, binden twee homotrimeren samen op een antiparallelle manier en vormen zo mature type VII collageen dimeren. Uiteindelijk vormen grote aantallen van deze dimeren de ankerfibrillen. Ankerfibrillen sluiten de rij van moleculen die samen het hemidesmosomale epidermale-dermale adhesie complex vormen. Ankerfibrillen zijn gelokaliseerd aan de dermale zijde van dit complex en spelen een belangrijke rol bij de stevige hechting van de epidermis aan de dermis. Afwijkingen in type VII collageen leiden tot een verzwakking van de epidermale hechting en dus tot zwakte in de huid en een DEB fenotype. DEB kan zowel autosomaal recessief (RDEB) als dominant (DDEB) overerven. Het DEB fenotype vormt een spectrum dat loopt van het meest ernstige RDEB, severe generalized (RDEB-sev gen) subtype tot aan het mildste DDEB, nails only (DDEB-na) subtype, waarbij alleen de nagels betrokken zijn. RDEB-sev gen kenmerkt zich door gegeneraliseerde blaarvorming vanaf de geboorte, uitgebreide verlittekening wat resulteert in vergroeiing van vingers en tenen (pseudosyndactylie) op kinderleeftijd, nagel dystrofieën, erosies op de slijmvliezen, groeivertraging, en een levensverwachting van slechts jaar als gevolg van een extreem hoog risico op plaveiselcel carcinomen. De andere subtypen verlopen in het algemeen milder en DDEB is meestal minder ernstig dan RDEB. Eerder onderzoek heeft laten zien dat het precieze effect van COL7A1 mutaties (het genotype) op de functie van het type VII collageen eiwit bepaalt welk subtype DEB (het fenotype) een patiënt kan krijgen. Dit heeft geleid tot enkele algemene genotype-fenotype verbanden. Mutaties die leiden tot een verlaagde hoeveelheid van structureel normaal type VII collageen in de huid zijn recessief en veroorzaken de meest ernstige RDEB fenotypen; missense en splicesite mutaties die de structuur van type VII collageen veranderen, kunnen zowel een recessief als een dominant effect hebben en veroorzaken meestal de minder ernstige fenotypen. DDEB wordt meestal veroorzaakt door een specifieke klasse van missense mutaties, namelijk de glycine substitutie. Dit zijn mutaties van het glycine aminozuur van één van de vele Gly-Xaa-Yaa aminozuur herhalingen in het triple-helix domein van type VII collageen. Niet alle glycine substituties hebben echter een dominant effect; er zijn er die alleen RDEB kunnen veroorzaken. Er zijn vele andere uitzonderingen op de algemene genotype-fenotype correlatie regels bekend en voor enkele van de zeldzame DEB subtypen is de genotype-fenotype correlatie kennis nog zeer beperkt. Veel aspecten van de pathogenese van DEB zijn dus nog niet opgehelderd. 292

14 Nederlandse samenvatting De doelstellingen van dit proefschrift De algemene doelstelling van dit proefschrift was daarom om ons inzicht in de pathogenese van DEB te vergroten. Om deze doelstelling te bereiken werd de data uit de Nederlandse EB database geanalyseerd. Deze database wordt beheerd door het Blaarcentrum Groningen van het UMCG, het EB expertisecentrum in Nederland (hoofd: prof. dr. M.F. Jonkman). De meeste Nederlandse patiënten met EB hebben dit centrum tenminste eenmalig bezocht voor advies, uitleg, behandeling en erfelijkheidsvoorlichting. Informatie over hun klinische fenotype, familiegeschiedenis, uitslagen van immunofluorescentie en elektronen microscopie onderzoek op huidbiopten, en uitslagen van mutatie analyse zijn vanaf 1989 in deze database opgeslagen. Op het moment van verschijnen van dit proefschrift bevat deze database de gegevens van 346 verschillende families met EB. Deze database is dus een zeer waardevolle bron voor wetenschappelijk onderzoek naar EB. Om de algemene doelstelling te bereiken, werden drie hoofddoelstellingen geformuleerd. In Deel Eén van dit proefschrift worden de eerste twee hoofddoelstellingen uitgewerkt. De eerste hoofddoelstelling was het bepalen van de genotype-fenotype correlatie voor de belangrijkste subtypen van DEB in de Nederlandse populatie. Een volledig begrip van de genotype-fenotype correlatie van DEB is essentieel voor het nauwkeurig voorspellen van het fenotype, het optimaliseren en individualiseren van erfelijkheidsvoorlichting, het verder ontrafelen van de pathogenese, het beter begrijpen van de rol van genetische en niet-genetische ziekte-modificerende factoren, en het selecteren van patiënten voor klinisch onderzoek naar behandelmethoden. De tweede hoofddoelstelling van dit proefschrift was een online database te bouwen die publiekelijk toegankelijk is en alle beschikbare klinische en moleculaire informatie bevat, zowel van patiënten met DEB die in de medische literatuur zijn beschreven als van patiënten die (nog) niet beschreven zijn. Het bestuderen van de genotype-fenotype correlatie leidt tot belangrijke inzichten die alleen optimaal benut kunnen worden als alle informatie uit dergelijke studies opgeslagen wordt in een online database die wereldwijd beschikbaar is voor alle medische professionals en onderzoekers. In Deel Twee van dit proefschrift wordt de derde hoofddoelstelling van dit proefschrift uitgewerkt: het nader in kaart brengen van de ziekte-modificerende rol van somatisch mozaïcisme bij DEB. Somatisch mozaïcisme betekent dat mutante en wild-type ( normale ) cel populaties naast elkaar bestaan in het lichaam, wat resulteert in een mozaïekpatroon van de ziekte. Bij forward mozaïcisme ontstaat een pathogene mutatie in één van de cellen van het ontwikkelende embryo, dat in aanleg wild-type is. Dit zorgt ervoor dat de ziekte in een segmentaal patroon tot uiting komt, terwijl de rest van het lichaam gezond is. Bij revertant mozaïcisme is het embryo in aanleg juist mutant en treedt er een extra mutatie op in een deel van de cellen 293

15 van het embryo die het effect van de ziekteaanleg compenseert in die cellen. Dit leidt bij huidziekten tot een gezonde huidplek te midden van aangedane huid. Zowel forward als revertant mozaïcisme kunnen dus beschouwd worden als ziekte-modificerende factoren. Inleidende hoofdstukken 1 tot en met 3 Alvorens de drie hoofddoelstellingen te behandelen, begint dit proefschrift met drie algemene, inleidende hoofdstukken, waarin ik het kader neerzet waarbinnen het proefschrift zich afspeelt. Hoofdstuk 1 is een inleidend hoofdstuk, dat begint met een introductie van enkele basisprincipes over de huid en haar ontwikkeling en structuur, en over het hemidesmosomale epidermale-dermale adhesie complex. Vervolgens zoomt dit deel in op EB als de groep van erfelijke aandoeningen die veroorzaakt worden door genetische defecten in de genen die coderen voor de moleculen van dit adhesie complex. De focus van dit hoofdstuk ligt op de klinische en moleculaire aspecten van DEB, het COL7A1 gen en mutaties daarin, en de algemene genotypefenotype verbanden. Vervolgens geeft dit hoofdstuk een gedetailleerd overzicht over forward en revertant mozaïcisme in het algemeen en bij EB in het bijzonder. In dit hoofdstuk zet ik de vragen neer die de basis vormden voor de studies die in dit proefschrift beschreven worden. Het hoofdstuk sluit af met een beschrijving van de doelen van dit proefschrift. Hoofdstuk 2 plaatst de onderwerpen die in dit proefschrift beschreven worden in een historisch perspectief. Het vat de belangrijkste historische mijlpalen en successen in het DEB onderzoek samen, vanaf de allereerste beschrijvingen van DEB aan het einde van de 19 e eeuw tot aan de ontdekking van het COL7A1 gen als de oorzaak voor DEB in de vroege jaren 90 van de 20 ste eeuw. Dit hoofdstuk laat duidelijk zien hoeveel werk er verricht moest worden om de oorzaak en pathogenese van DEB te ontrafelen, om consensus te bereiken over een classificatie van de DEB subtypen, en om het stellen van een juiste diagnose en prenatale diagnostiek mogelijk te maken. Het laat ook duidelijk zien dat er nog veel verder onderzoek noodzakelijk is! Om de pathogenese van een erfelijke aandoening te kunnen bestuderen is het cruciaal dat de oorzakelijke mutaties gevonden zijn in de te bestuderen families. Slechts een klein aantal COL7A1 mutaties wordt vaker gevonden als gevolg van founder effecten en er zijn slechts enkele mutatie hotspots bekend. De meeste families hebben echter unieke mutaties die bovendien verspreid zijn over alle 188 exonen van het gen. Dit benadrukt de grote behoefte aan een mutatie detectie strategie die hoge sensitiviteit, betrouwbaarheid en efficiëntie met kosteneffectiviteit combineert. In hoofdstuk 3 worden de technische ontwikkeling en analytische validatie van een conformation-sensitive capillary electrophoresis (CSCE) strategie voor COL7A1 als mutatie prescreening strategie in een laboratorium voor moleculair genetische diagnostiek beschreven. 294

16 Nederlandse samenvatting De CSCE techniek is gebaseerd op het principe van heteroduplex detectie. Heteroduplexen worden gevormd wanneer enkelstrengs DNA fragmenten met heterozygote sequentie veranderingen na een PCR reactie weer langzaam afgekoeld worden en aan elkaar hechten. Deze heteroduplex fragmenten migreren anders door een gel dan de wild-type fragmenten en kunnen onderscheiden worden op een multi-capillaire geautomatiseerde sequencer als ze fluorescent gelabeld zijn. De validatie is gedaan door 29 bekende COL7A1 sequentie veranderingen te analyseren met de CSCE techniek. Deze 29 veranderingen omvatten 33% van alle voor de CSCE ontwikkelde amplicons. Nadat alle technische condities geoptimaliseerd waren, werden alle 29 sequentie veranderingen teruggevonden, onafhankelijk van de lengte of het CG-percentage van de amplicons en de positie van de veranderingen binnen de amplicons. Dit komt overeen met een analytische sensitiviteit van 90,2-100% (95% betrouwbaarheidsinterval). Onze conclusie was dat de CSCE techniek een snelle, betrouwbare, kosteneffectieve en sensitieve methode is voor mutatie pre-screening van COL7A1 in een laboratorium voor moleculair genetische diagnostiek. Op het moment dat wij de CSCE ontwikkelden, was dit een zeer moderne methode die voldeed aan de eisen van verantwoorde diagnostiek. In het licht van de snelle technische ontwikkelingen op het gebied van next generation sequencing van de laatste jaren, kan op dit moment zeer terecht de vraag gesteld worden of er nog wel plaats is voor dergelijke pre-screening technieken. Deel Een: de genotype-fenotype correlatie voor DEB Deel Eén van dit proefschrift omvat de hoofdstukken 4 tot en met 7 en richt zich op de genotype-fenotype correlatie voor de verschillende DEB subtypen en de database die we voor dit doel gebouwd hebben. Hoofdstuk 4 beschrijft de genotype-fenotype correlatie studie voor RDEB. Op het moment van de studie waren 33 RDEB families bekend in de Nederlandse EB database. Voor alle patiënten waren uitgebreide klinische follow-up gegevens over een periode tot 19 jaar beschikbaar en tevens de uitslagen van immunofluorescentie onderzoek van type VII collageen, elektronen microscopie onderzoek van de anker fibrillen en COL7A1 mutatie analyse. We vonden 20 nieuwe COL7A1 mutaties, waarmee het grote aantal unieke mutaties verder uitgebreid werd. Bij veertien van de 15 patiënten met RDEB-sev gen was type VII collageen in de huid volstrekt afwezig en vonden we nulmutaties op beide allelen, zoals voorspeld door de algemene genotype-fenotype verbanden. Er was één RDEB-sev gen patiënt met twee nulmutaties, maar toch onverwacht zeer licht positieve type VII collageen aankleuring bij immunofluorescentie onderzoek van de huid. Vijf van de 11 patiënten met RDEB, generalized other (RDEB-O) ontwikkelden op de latere kinderleeftijd of in de tienerjaren ook een gedeeltelijke pseudosyndactylie van de vingers die voorafgegaan werd door atrofie van de huid en flexie contracturen. Alle vijf hadden ze ook oesofagus problemen en groeiretardatie. Type VII collageen aankleuring in de huid varieerde van sterk tot gering 295

17 verlaagd bij deze vijf patiënten, terwijl type VII collageen aankleuring bij de RDEB-O patiënten zonder pseudosyndactylie gering verlaagd tot zelfs normaal was. Een RDEB-O fenotype waarbij pseudosyndactylie ontstaat wordt dus voorspeld door sterk verlaagde type VII collageen aankleuring in de huid. Er was geen duidelijk verschil in genotype tussen de RDEB-O patiënten die wel en geen pseudosyndactylie ontwikkelden, hoewel we onverwacht twee stopmutaties vonden bij twee van de vijf patiënten met RDEB-O met pseudosyndactylie. mrna analyse op RNA uit huidbiopten bracht niet aan het licht waarom deze twee patiënten toch een kleine hoeveelheid type VII collageen maakten waardoor ze niet het meest ernstige RDEB-sev gen fenotype hadden. We speculeerden dat translational read-through het reddingsmechanisme zou zijn. Omdat dit moeilijk te bewijzen is, zijn na publicatie de mrna analyses uitgebreid. Die lieten zien dat er in de regio van hun stopmutatie alternatieve splicing optreedt, waardoor het effect van de stopmutatie enigszins gecompenseerd wordt (hoofdstuk 11). Onze conclusies waren dat pseudosyndactylie optreedt bij ongeveer de helft van de patiënten met RDEB-O. De gering positieve type VII collageen aankleuring bij drie patiënten met twee stopmutaties en een milder dan verwacht fenotype bij twee van hen, laat zien dat het fenotype bij RDEB niet altijd direct en juist door het genotype voorspeld kan worden. Huidbiopten moeten altijd afgenomen en bestudeerd worden als het fenotype anders is dan wat de verwachting was op basis van het genotype. In hoofdstuk 5 worden de resultaten van onze genotype-fenotype correlatie studie naar het inversa subtype van RDEB (RDEB-I) beschreven. RDEB-I is een zeldzame vorm van DEB die gekenmerkt wordt door blaarvorming in de grote lichaamsplooien en op de romp en slijmvliezen (de inversa distributie). Bij de start van deze studie was er weinig bekend over de oorzaak van dit subtype met zijn typische distributie en de genotype-fenotype correlatie was nog niet eerder uitgebreid bestudeerd. Het doel van onze studie was daarom om meer inzicht te krijgen in de pathofysiologie van RDEB-I door de correlatie tussen genotype en fenotype te onderzoeken. Dit onderzoek werd uitgevoerd in nauwe samenwerking met de groep van prof. J.A. McGrath, St. John s Institute for Dermatology, Londen. In het onderzoek werden de genotypen van de 20 Nederlandse en Britse patiënten met RDEB-I op een rij gezet en vergeleken met het genotype van de patiënten met RDEB-I die in de literatuur beschreven zijn. Dit cohort is het grootste cohort dat ooit beschreven is. Alle 20 patiënten hadden gegeneraliseerde blaarvorming vanaf de geboorte en op de vroege kinderleeftijd. Voor het 4 e jaar vond een transitie plaats van gegeneraliseerde blaarvorming naar blaarvorming in de inversa distributie. Er viel een spectrum in uitgebreidheid van de RDEB-I op: van het mildste mucosal only fenotype, waarbij de huid niet aangedaan was, tot het meest uitgebreide fenotype, waarbij er ook enige betrokkenheid was van de handen en voeten (hoewel de inversa blaarvorming duidelijk op de voorgrond stond). Het totale aantal van 29 genotypen van onze patiënten en die uit de literatuur liet zien dat RDEB-I geassocieerd is met een specifieke set van recessieve arginine en glycine substituties in het triple-helix domein van type VII collageen. De p.arg2069cys mutatie werd het vaakst 296

18 Nederlandse samenvatting gevonden en lijkt een specifieke inversa mutatie te zijn. We vonden geen duidelijke verschillen tussen deze set van RDEB-I mutaties en recessieve arginine en glycine substituties die bij andere RDEB fenotypen beschreven zijn voor wat betreft locatie in het triple-helix domein of aard van het aminozuur dat het arginine of glycine residu verving. Waardoor deze specifieke arginine en glycine substituties een inversa distributie veroorzaken is nog niet opgehelderd. Opvallend is echter dat de blaarvorming bij RDEB-I beperkt is tot die lichaamsgebieden waar de huidtemperatuur hoger is dan elders op het lichaam. We denken daarom dat die hogere huidtemperatuur in de aangedane huidgebieden een belangrijke rol speelt in het ontstaan van RDEB-I. Het zou interessant zijn om te testen of permanente koeling van de aangedane huidgebieden patiënten met RDEB-I helpt. Dominante DEB wordt gewoonlijk veroorzaakt door mutaties van één van de essentiële glycine aminozuren in het type VII collageen triple-helix domein, die een dominant negatief effect uitoefenen. Hoofdstuk 6 bespreekt de genotype-fenotype correlatie studie voor DDEB. Voor dit onderzoek waren de klinische en moleculaire gegevens van 72 patiënten met DDEB, afkomstig uit 35 families, beschikbaar uit de Nederlandse EB database. We vonden 19 verschillende dominante COL7A1 mutaties, waaronder vijf niet eerder beschreven mutaties en twee Nederlandse founder mutaties, te weten p.gly2076val en p.gly2713asp. De twee mutaties die het vaakst bij DDEB beschreven zijn, de p.gly2034arg en p.gly2043arg mutaties, werden in de Nederlandse populatie bij ongeveer 25% van de families gevonden. Achttien van de 19 mutaties waren typische dominante glycine substituties in het type VII collageen triple-helix domein. 63% van deze mutaties liggen in de exon hotspot regio. We konden echter geen duidelijke, meer specifieke genotype-fenotype verbanden afleiden, behalve enkele speculatieve. Uitgesproken variatie in fenotype tussen families en binnen families was de regel voor de meeste mutaties. Dit impliceert dat er buiten de mutaties andere factoren zijn die het fenotype sterk beïnvloeden. De enige niet-glycine substitutie was de c t>g transversie in intron 73. Uit mrna analyses bleek dat deze mutatie leidt to in-frame skipping van exon 74. Een recente beschrijving van in-frame skipping van exon 74 als gevolg van een deletie van de op één na laatste nucleotide van exon 74 in een Japanse familie met DDEB ondersteunt onze conclusie dat de in-frame skipping van exon 74 een dominant negatief effect heeft en dus DDEB veroorzaakt. In hoofdstuk 7 wordt de International DEB Patient Registry gepresenteerd. Er is wereldwijd inmiddels een groot aantal unieke COL7A1 mutaties geïdentificeerd en er is een grote hoeveelheid genotype-fenotype correlatie informatie verzameld in vele onderzoeken in vele populaties, waaronder de onderzoeken beschreven in dit proefschrift (hoofdstukken 4-6). Alle informatie uit deze onderzoeken zou vrij beschikbaar moeten zijn vanaf een centrale locatie voor elke medische professional en onderzoeker die met DEB in aanraking komt. Daarnaast is de genotype-fenotype correlatie voor sommige, met name de meer zeldzame, subtypen van DEB nog niet volledig opgehelderd. Om deze correlatie verder te kunnen ontrafelen is het 297

19 cruciaal dat er een centrale database bestaat die alle beschikbare informatie bevat over het genotype en fenotype van DEB patiënten. Daarom hebben wij de International DEB Patient Registry gebouwd ( met als doel om de genotype en fenotype informatie van alle DEB patiënten wereldwijd te verzamelen en te delen. In mei 2011, de officiële release datum van de database, bevatte deze MOLGENIS database de gedetailleerde informatie van 508 patiënten met DEB die in de literatuur beschreven zijn en 71 niet-gepubliceerde patiënten, en hun 388 unieke COL7A1 mutaties. De database beschikt over wizards waarmee gebruikers gemakkelijk en snel informatie van nieuwe patiënten kunnen delen. Deze database zal een belangrijk hulpmiddel zijn bij het stellen van de juiste diagnose en bij genetische counseling en zal leiden tot nieuwe inzichten, met name voor de zeldzame fenotypes waar. Daardoor zal deze database zeer belangrijk zijn voor patiënten met DEB. Op het moment van verschijnen van dit proefschrift bevat de registry de informatie van 669 patiënten met DEB en 425 COL7A1 mutaties. Deze getallen geven aan dat dit een doorlopend project is. In de afgelopen jaren is ook een andere database, de COL7A1 Variant Database ( verschenen van de hand van een Poolse groep. Deze database heeft grotendeels dezelfde doelen als de onze en we hebben daarom afgesproken om onze krachten te bundelen om gezamenlijk het beste te halen uit deze belangrijke instrumenten in het belang van de patiënten met DEB. Deel Twee: somatisch mozaïcisme bij DEB Deel Twee van dit proefschrift gaat over de modificerende rol van zowel forward als revertant somatisch mozaïcisme bij DEB en omvat hoofdstukken 8, 9 en 10. In hoofdstuk 8 beschrijven wij de eerste DEB familie met bewezen forward somatisch mozaïcisme. Behalve één beschrijving van kiemcelmozaïcisme, een vorm van forward mozaïcisme waarbij de mutatie alleen in de geslachtscellen aanwezig is, in een familie met DDEB, is forward mozaïcisme voor DEB nog niet beschreven. We vonden de dominante glycine substitutie p.gly2034arg bij een patiënte met het pruriginosa subtype van DDEB. Bij de ouders vonden we bij uitgebreid lichamelijk onderzoek geen enkel verschijnsel van DDEB. Tot onze verbazing vonden we de p.gly2034arg mutatie echter wel in een deel van de witte bloedcellen van de moeder. Bij aanvullend onderzoek met pyrosequencing bleek de mutatie ook in 20-50% van haar huidcellen aanwezig te zijn. Dit betekent dat 10-25% van haar pro-α1(vii) procollageen moleculen de mutatie bevat. Ter vergelijk: bij niet-mozaïek patiënten bij wie een mutatie in 100% van de huidcellen aanwezig is, bevat 50% van de pro-α1(vii) procollageen moleculen de mutatie. De moeder was dus somatisch mozaïek voor de mutatie van haar dochter. Aangezien de moeder geen enkel verschijnsel van DDEB had, kan geconcludeerd worden dat de hoeveelheid pro-α1(vii) procollageen moleculen met mutatie groter dan 10-25% moet zijn om DDEB te kunnen krijgen, hoewel deze hoeveelheid waarschijnlijk per mutatie verschillend is. 298

20 Nederlandse samenvatting Deze casus laat zien dat het belangrijk is om altijd mutatie analyse bij de ouders van een sporadische patiënt met DEB te doen om (1) de manier van overerven te bepalen en (2) te kijken of de mutatie bij een patiënt met dominante DEB nieuw is ontstaan. Dit zal ons uiteindelijk leren hoe vaak dominante mutaties nieuw ontstaan en hoe vaak somatisch mozaïcisme bij een ouder voorkomt. Dit heeft belangrijke consequenties voor genetische counseling, omdat dit het verschil maakt tussen een herhalingskans van kleiner dan 1% en mogelijk wel 50%. Wij adviseren verder om mutatie analyse te doen in wangslijmvliescellen als de mutatie bij ouders niet in bloed wordt aangetoond, omdat de mutatie soms wel aanwezig is in andere weefsels dan bloed. Als de mutatie ook niet in wangslijmvliescellen van beide ouders wordt gevonden, dan is de kans dat een ouder alsnog somatisch mozaïek is en daarmee de herhalingskans voor een volgend kind beduidend kleiner dan 1%. Een geringe kans op kiemcelmozaïcisme kan echter nooit volledig uitgesloten worden en daarom moet de mogelijkheid van prenatale diagnostiek in een volgende zwangerschap altijd besproken worden. In hoofdstuk 9 wordt een 21-jarige man met RDEB beschreven met de homozygote kiembaan nonsense mutatie c.6508c>t (p.gln2170x). Hij vertelde dat hij een gezonde huidplek had in zijn nek waar hij, zover hij zich kon herinneren, nog nooit blaren had gekregen, zelfs niet na krabben. Immunofluorescentie analyse op huidbiopten liet zien dat type VII collageen vrijwel afwezig was in zijn aangedane huid, maar dat het normaal aanwezig was in circa 80% van de coupes van zijn gezonde huidplek. DNA en mrna analyses maakten vervolgens duidelijk dat in de cellen van zijn gezonde huidplek een extra, somatische mutatie was opgetreden die de kiembaan nonsense mutatie veranderde in de missense mutatie p.gln2170tyr. Hierdoor kon er in de gezonde huidplek weer type VII collageen gemaakt worden, dat weliswaar een missense mutatie bevatte maar blijkbaar toch functioneel genoeg was om te zorgen dat hij op de plek geen blaren kreeg. Deze patiënt is de derde patiënt met RDEB bij wie het fenomeen van revertant mozaïcisme in korte tijd beschreven is, wat erop duidt dat het vaker voorkomt bij RDEB dan eerder gedacht. Door patiënten met RDEB systematisch op revertante plekken te onderzoeken zullen daarom waarschijnlijk meer patiënten gevonden gaan worden. Dit is belangrijk, omdat deze natuurlijke gentherapie mogelijkheden voor revertante cel therapie biedt. Autologe revertante cellen hebben geen last van afstoting. Als revertante cellen geherprogrammeerd worden tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (ipscs) dan vormen ze een oneindige bron van gecorrigeerde, patiënt-eigen stamcellen. Als die ipscs vervolgens weer gedifferentieerd kunnen worden tot haematopoïetische of mesenchymale stamcellen, biedt dat een patiënt-eigen alternatief voor de allogene beenmergtransplantaties die bij enkele patiënten zijn uitgevoerd. Samengevat kan het identificeren van revertante plekken dus aan de basis staan van toekomstige behandelmogelijkheden. 299

21 Vanwege dit interessante therapeutische potentiaal is het belangrijk revertante plekken bij patiënten met EB op te sporen. In de afgelopen jaren is revertant mozaïcisme beschreven bij alle hoofdvormen van EB. Onze groep was in staat om het bij 60% van de patiënten met het gegeneraliseerde subtype van non-herlitz junctionele EB te bewijzen. Bij lichamelijk onderzoek lijkt het er zelfs op dat alle patiënten met dit EB subtype revertante plekken hebben. Wij stelden daarom de hypothese op dat revertant mozaïcisme bij alle patiënten met een recessief overervende vorm van EB verwacht moet worden, wat belangrijke consequenties zou hebben met het oog op de mogelijke toekomstige toepassing van revertante cel therapie. In hoofdstuk 10 hebben we deze hypothese getoetst in een mathematisch ontwikkelingsmodel. We hebben berekend hoe groot de kans is dat een patiënt met een recessieve vorm van EB een revertante plek ontwikkelt als gevolg van een correctie van één enkele nucleotide. Ons model laat zien dat de kans dat dit soort correcties van één nucleotide optreden in de huid van deze patiënten asymptotisch nadert aan 1. De verwachting is dat dergelijke correctiemutaties (reverse mutaties) zelfs vele malen optreden (geschat op 216 ). Het model laat echter ook zien dat deze correctiemutaties vroeg in de embryonale ontwikkeling moeten ontstaan om uit te kunnen groeien tot zichtbare plekken. De kans dat de correctiemutaties zo vroeg ontstaan is zo klein dat slechts bij circa 1 op de patiënten een zichtbare revertante plek voorspeld wordt. Dit is een enorme onderschatting ten opzichte van onze klinische waarnemingen, wat slechts voor een klein deel verklaard kan worden door beperkingen van het gebruikte model, zoals het buiten beschouwing laten van verlies van cellen en de hiërarchische ontwikkeling van basale keratinocyten. Om deze onderschatting te verklaren, hebben we de zogenaamde latebut-fitter revertant cell hypothese gepostuleerd: hiermee wordt bedoeld dat correctiemutaties pas in latere stadia van de ontwikkeling optreden, zodra de kans dat ze optreden richting 1 gaat; ze verschaffen de revertante cellen echter een enorm selectief groeivoordeel ten opzichte van hun mutante buren, waardoor ze toch kunnen uitgroeien tot zichtbare revertante plekken. Deze hypothese wordt onder andere ondersteund door de bijzondere groeipatronen van revertante plekken in naastgelegen Blaschkolijnen, wat aangeeft dat de revertante cellen pas ontstaan als de vroege embryonale organisatie van de huid al voltooid is. Het ontwikkelingsmodel geeft aan dat revertante cellen in theorie ook aanwezig zijn bij andere erfelijke aandoeningen. Als deze cellen geïdentificeerd en geïsoleerd kunnen worden, zou dat in de toekomst ook voor behandeling van andere erfelijke aandoeningen nieuwe mogelijkheden kunnen bieden. Discussie en conclusies In hoofdstuk 11 de algemene discussie worden de resultaten van de studies die in dit proefschrift beschreven worden in een breder perspectief geplaatst. Ook worden aanbevelingen en suggesties voor verder onderzoek gepresenteerd, waarmee de verschillende hypothesen die van deze resultaten afgeleid zijn getoetst kunnen worden om zo ons inzicht nog verder te 300

22 Nederlandse samenvatting vergroten in de pathogenese van DEB, de rol van genetische en niet-genetische modificerende factoren, de rol van somatisch mozaïcisme en de ontwikkeling van therapeutische strategieën. Daarnaast gaat dit hoofdstuk ook in op de praktische betekenis van de resultaten uit dit proefschrift voor het voorspellen van het fenotype, de genetische counseling en de ontwikkeling van behandelingen. U wordt beleefd verwezen naar dit hoofdstuk en gevraagd om over de gepresenteerde ideeën en hypothesen mee te denken. Ik hoop dat dit proefschrift mag bijdragen aan het ontspringen van nieuwe ideeën met het uiteindelijke doel dat patiënten met DEB hiervan mogen profiteren. 301

23

24 Dankwoord Acknowledgements

25 Dit proefschrift is het resultaat van enkele jaren hard en gedreven werk. Niet alleen van mijzelf, juist ook van vele andere mensen die direct dan wel indirect hebben bijgedragen aan de totstandkoming ervan: het (gedeeltelijk) doen van de beschreven experimenten of het mij leren hoe die te doen, het interpreteren en bediscussiëren van de resultaten, het meeschrijven en becommentariëren van de artikelen, het zorgen voor de noodzakelijke ontspanning en gezelligheid, het tonen van interesse, het mij rondleiden in buitenlandse laboratoria, afdelingen en horecagelegenheden, en het faciliteren van een onderzoekstraject binnen een klinische opleiding zijn zo een paar van die bijdragen. Zonder jullie was dit proefschrift altijd denkbeeldig gebleven. Tegen een ieder die op wat voor manier heeft bijgedragen wil ik daarom zeggen: enorm bedankt! 304

26 Dankwoord/Acknowledgements Op deze plaats wil ik graag enkele mensen even in het bijzonder bedanken. Allereerst mijn promotoren, beste Marcel en Robert. Hoewel jullie verschillende personen zijn en heel verschillende eigenschappen hebben, delen jullie één eigenschap die essentieel is voor het slagen van een promotietraject: jullie kunnen een promovendus als geen ander enthousiasmeren en motiveren. Ik kan me geen enkel overleg met jullie herinneren waaruit ik niet enthousiast en vol nieuwe ideeën vandaan kwam. Beste Marcel, vanaf het allereerste moment dat ik als jonge ANIOS klinische genetica met Ton meekwam naar de polikliniek Genodermatosen, was mijn interesse in erfelijke huidziekten gewekt. Dat kwam niet in de laatste plaats door jouw enthousiasme voor het mooiste onderdeel van onze beider vakgebieden. Toen ik niet veel later van jou de kans kreeg me op DEB te werpen, heb ik geen seconde geaarzeld. De vraag was om de Nederlandse patiënten met DEB op een rij te zetten en te speuren naar bijzondere genotype-fenotype correlatiepatronen, die jij steevast met zebra s aanduidde. Vanaf het eerste begin heb je me vertrouwen en verantwoordelijkheid en vooral veel vrijheid gegeven, en heb je niet geschroomd me binnen je netwerk naar voren te schuiven; zeer sterke eigenschappen van jou die ik enorm waardeer. Jouw enthousiaste reacties op mijn resultaten en ideeën, en je vermogen om die resultaten direct naar een mogelijk belangrijke klinische toepassing te vertalen, gaven me altijd het idee dat het onderzoek dat ik deed ongelofelijk baanbrekend moest zijn. Een van de meest waardevolle dingen die ik van je heb geleerd, is om niet te schuwen om interessante en controversiële hypothesen gewoon te onderzoeken, ook al is de kans op succes misschien gering. Beste Marcel, dank voor de kans om mijn eerste schreden op onderzoekspad bij jou te kunnen doen, dank voor de begeleiding en de goede discussies, dank voor alle mogelijkheden die je me geboden hebt. En ik ben ervan overtuigd dat onze samenwerking ook in de toekomst tot vele mooie resultaten zal leiden! Beste Robert, het interesseert me geen reet is voor mij jouw meest befaamde uitspraak. Dit was jouw eerste reactie toen ik met Ton kwam vragen of jij mijn Genetica-begeleider bij mijn onderzoek wilde zijn. Jij had niks met huid, jij kijkt liever naar darmen overigens ook epitheliaal weefsel maar dat terzijde en we deden op de afdeling helemaal geen onderzoek naar de huid. Na deze weinig hoopgevende introductie voegde je er gelukkig aan toe dat je best bereid was mee te denken, maar dan moest ik je wel laten zien waarom het onderwerp zo interessant was. Dit motiveerde mij om alleen maar met meer vastberadenheid aan het project te beginnen. Of het nou komt doordat je later doorkreeg dat type VII collageen ook in een deel van het darmstelsel tot expressie komt of dat ik je toch anderszins heb weten te interesseren laat ik in het midden, maar het feit dat je mijn tweede promotor bent geworden laat denk ik zien dat ik geslaagd ben. Het is nu zelfs zo dat je vanuit congressen s stuurt als er een interessante poster over DEB hangt! Jouw kritisch-realisme, en je gevoel voor het vinden van een niche/kansen en hoe dat te verwoorden, onder andere rondom het indienen van mijn AGIKO stipendium aanvraag, hebben me veel geleerd en het niveau van dit proefschrift duidelijk verhoogd. Je gevoel voor humor en toegankelijkheid maken dat onderzoek doen met jou heel ontspannen is. Het mooiste moment uit mijn samenwerking met jou had echter weinig 305

27 met wetenschap van doen, noch met de academische jaarprijs, maar met de akkoorden die ik onder jouw onovertroffen Sex Bomb mocht leggen, iets wat ik nog steeds mis. Beste Robert, dank dat je mijn begeleider en promotor hebt willen zijn! Het was leuk. Beste Ton, zonder jou was er van dit proefschrift waarschijnlijk geen letter op papier verschenen. Jij werkte al jaren samen met Marcel in het kader van de Genodermatosenpoli en je vroeg je af of die samenwerking niet verder versterkt kon worden met een gezamenlijk onderzoeksproject. Doordat jij een balletje bij Marcel en Robert hebt opgegooid, heb ik deze mooie kans gekregen en daarvoor ben ik je oprecht enorm dankbaar. Dank voor je bijdrage in de gesprekken die we hadden en ik hoop dat we in de toekomst nog mooie dingen kunnen doen op het gebied van erfelijke huidziekten. Beste Roel. Hoe paradoxaal kan het leven soms zijn: jij bent geen echte wetenschapper, je hebt zelfs wel eens gezegd dat je dat echt geen wetenschapper bent, maar toch ben jij het die me het plezier in het doen van genetisch onderzoek heeft bijgebracht. Van jou heb ik tijdens mijn wetenschappelijke stage geleerd over genotype-fenotype correlaties na te denken. Jij hebt me daarin zo weten te raken dat ik graag daarin verder wilde. Jij staat dus in feite aan de basis van dit proefschrift, al zul je dat zelf ongetwijfeld lachend bagatelliseren. Roel, dank voor je begeleiding op welk vlak dan ook gedurende ongeveer 10 jaar. Dank voor je vertrouwen, je luisterend oor, je belangstelling, je adviezen, je kritische noten en je gezelligheid, ook samen met Janet. Ik hoop nog lang gezellig niet-sociaal met jullie te kunnen doen! Mijn paranimfen, lieve Marieke en Marjon. Jullie zijn niet alleen goede collega s, maar ook gewoon hele goede vrienden geworden. De reisjes, etentjes, borrels en andere overlegmomenten met jullie zijn altijd erg gezellig en motiverend om vooral lang met onderzoek door te gaan. De koffiebreaks aan het einde van een dag mis ik best wel eens, Marieke. Misschien moeten we dat in een soort kinderopvang-setting toch wat vaker proberen. En ik hoop dat we nog heel veel projecten samen mogen doen, Marjon, dat bevalt me goed. Dank dat jullie mijn paranimfen willen zijn. Met jullie naast mij kan er niets mis gaan en kan het alleen maar een geweldige dag worden! I would also like to thank the members of the assessment committee of my thesis manuscript, prof. John McGrath, prof. dr. Maurice van Steensel, and prof. dr. Rolf Sijmons. Thank you very much for your time and energy to read and judge the manuscript. Moreover, I am deeply honored and very delighted that you, John and Maurice, have found the time to travel all the way to Groningen to take place in the corona and to give a lecture at the mini-symposium dedicated to DEB and dermatogenetics preceding the defense ceremony. 306

28 Dankwoord/Acknowledgements Graag wil ik alle patiënten, hun ouders en familieleden bedanken die op enigerlei wijze betrokken zijn (geweest) bij de verschillende onderzoeken. Ik heb dit project alleen gedaan in de hoop dat jullie er baat bij mogen hebben. Mijn doel is om daar ook vol mee door te gaan! I would like to thank all the people of the McLean-lab in Dundee for giving me an unforgettable time in your lab. A special thank-you is to Aileen Sandilands, Toshi Nomura, Frances Smith, and Irwin McLean. Aileen, thanks for your patience with me while teaching me all these to you extremely basic lab techniques. I learned so much from you and you are a great teacher! Toshi, I will never forget the football match we watched in The Trades House while trying each others country s best beers. I hope to have you as a friend for a very long time. Frances and Irwin, the welcome you gave me, the working environment and the atmosphere that you created in the lab were absolutely wonderful. The site-seeing, whisky, beer, and Fisherman s Tavern trips were without exception tasty. Thanks for giving me the opportunity to stay in your lab. I hope to be able to come back one day. Slàinte! Jemma Mellerio, Anna Martinez, and John McGrath, thanks for having me over to Great Ormond Street Children s Hospital and St. John s Institute of Dermatology at King s College, London for the study on RDEB, inversa and for the nice couple of days you gave me. Trish Dopping-Hepenstal and Lu Liu, thanks for providing the British data and showing me around in the lab! De collega s van de sectie DNA diagnostiek van de afdeling Humane Genetica in Nijmegen wil ik bedanken voor de hartelijke ontvangst en gezellige omgeving waarin ik mijn stage moleculaire genetica mocht doen. In het bijzonder Hans Scheffer, omdat ik mijn eerste labervaring op jouw afdeling mocht komen opdoen. Dank ook voor de discussies over de resultaten en je hulp bij mijn andere projecten. Rowdy Meijer, dank dat je mij op sleeptouw nam en de eerste succesvolle PCRs hebt weten te laten doen. Het is geweldig dat je altijd klaar staat om me snel te helpen als ik weer eens met vragen over mutaties zit. Erik-Jan Kamsteeg, dank voor je hulp en overleg bij de interpretatie van uitslagen die in mijn onderzoek zijn verwerkt. Morris, Robert, and Joeri. Thanks to you for all the work you did and all the hours you spent on building a genotype-phenotype database for a disease you had never heard of before and after the ideas of a non-it trained medical doctor. I think we (you) did a great job. It has much more spin-off than we had ever expected before and I am sure it will bring us more exciting opportunities in the future. I am also very grateful to all other colleagues around Europe who collaborated in this important project: Johann Bauer, Alfred Klausegger, Gianna Zambruno, Daniele Castiglia, Leena Bruckner-Tuderman, Cristina Has, Jemma Mellerio, and John McGrath. Thanks for your ideas, input, and trust. Kasia Wertheim, Kasia Wozniak, Christoph 307

29 Zapasnik, Martin Makosa, and Cezary Kowalewski, thank you for the discussions and collaborations on the database project. Alle analisten en medewerkers op het Dermatologie lab wil ik bedanken voor de betrokkenheid en hulp bij mijn experimenten en het helpen van de student-stagiaires. Miranda, jou wil ik even extra bedanken. Na mijn ervaringen in Nijmegen en Dundee dacht ik dat ik toch wel iets moest kunnen op een DNA-lab. Jij dacht daar anders over en hebt ervoor gezorgd dat ik een gedegen vervolgopleiding heb gekregen. Dank voor al je uitleg en hulp en niet in de laatste plaats de gezellige en leerzame cursus whisky voor beginners! Hendri, dank voor de buitengewoon leuke en goede discussies die ik met je mocht hebben over de resultaten van mijn eerste onderzoeksproject. Je hebt me heel veel geleerd en ik hoop nog vaak met je te mogen praten, of het nou over onderzoek is of over Grieks eten. Iedereen tevens bedankt voor de gezellige lab-borrels. Alle medewerkers van het Genetica lab, zowel research als team 3 van de diagnostiek, ook bedankt! Jan, Mathieu, Ludolf, Helga, Birgit en Lennart: bedankt voor jullie hulp bij de experimenten die ik zelf heb gedaan en bij het begeleiden van enkele studenten. Janna, Tirza, Marloes en Jeroen, jullie hebben in jullie afstudeerprojecten aanzienlijk bijgedragen aan de resultaten van dit proefschrift. Nogmaals dank voor jullie enthousiaste inzet. Ik hoop dat jullie een mooie carrière, misschien wel in de wetenschap, mogen hebben. Jeroen, we gaan van jouw promotieproject ook iets heel moois maken! Geweldig om één van jouw begeleiders te mogen zijn. Prof. dr. Hans Joenje wil ik bedanken voor de zeer leerzame discussies die we hadden over de biologie achter het optreden van revertant mozaïcisme. Gerard te Meerman, jij enorm bedankt voor je hulp bij de wiskundige uitvoering van dat onderzoek. Zonder jou was dat een beduidend moeilijker puzzel geweest. Een speciale plaats wil ik ook inruimen voor Jackie Senior. Dank voor het Righting van mijn English That s af en to Gone Dutch. Zonder jouw correcties en editing had dit proefschrift er lang niet zo goed uitgezien. Het was soms veel, maar toch kreeg ik altijd alles op tijd en nauwkeurig bekeken weer terug. Enorm bedankt! Cisca Wijmenga, jou wil ik bedanken voor je steun voor mijn onderzoek en het scheppen van de goede omstandigheden en sfeer op de afdeling waarbinnen dit onderzoek mogelijk was. Ook dank aan alle medewerkers van het secretariaat en de sectie beheer van de afdeling Genetica voor jullie hulp bij allerhande logistiek rondom dit onderzoek en proefschrift. Marina, jij bent het welkome lichtje in de duisternis van het oerwoud van de declaratieformulieren en kostenplaatsnummers. Dank voor het bijlichten. Nelly Hazen, bedankt voor je hulp om mij te leren het werk overzichtelijk te houden. 308

30 Dankwoord/Acknowledgements José, jouw tomeloze inzet voor het blaarcentrum is van onschatbare waarde. Je bent echt onmisbaar. Dank voor je grote belangstelling en onvoorwaardelijke hulp. Piet, dank voor je prachtige kwaliteit foto s! Dank dat je altijd klaar stond om vrolijk mijn extra verzoekjes in te willigen. Ik hoop je nog vaak om een foto te mogen vragen. Alle stafleden, AIOS, assistentes, secretaresses en andere medewerkers van de afdeling dermatologie ook bedankt voor jullie belangstelling en welke hulp dan ook. Stichting Vlinderkind wil ik bedanken voor de financiële support aan het EB onderzoek in Groningen en (deels) aan de studies beschreven in dit proefschrift. Jullie doen geweldig werk! Mijn oude kamergenoten bij de research wil ik bedanken voor de gezellige tijd. Helga, Gerben, Annemieke, Karin, Justyna, Anna, Anna en Jihane: thanks! Dat sarcasme en cynisme mooie kanten hebben dat wist ik wel, maar met jullie kon daar dagelijks in extremis van genoten worden. Ik wens jullie het allerbeste in jullie (wetenschappelijke) carrières! De collega promovendi bij de afdelingen Dermatologie en Klinische Genetica: bedankt voor de gezellige tijd en veel succes met jullie promoties/carrières. Mijn (ex-)kamergenoten bij de klinische genetica, Grétel, Jorieke, Barbara, Rein, Jenneke en Paul, bedankt dat jullie af en toe, misschien zelfs wel regelmatig, luisterend oor wilden spelen zodat ik mijn enthousiasme en soms frustratie kwijt kon. Paul, een bijzonder bedankje voor jou. Het was een eer vorig jaar jouw paranimf te zijn en, hoewel je niet mijn officiële paranimf bent, heb je haast wel als zodanig gefungeerd: bedankt voor alle tips, voorbeelden en adviezen die je me gegeven hebt, het heeft me enorm geholpen. Ik hoop dat we nog lang kunnen samenwerken op wat voor manier dan ook. Alle AIOS en ANIOS die ik gedurende de jaren als collega mocht hebben. Dank voor jullie interesse en mentale steun. Daarnaast voor de flexibiliteit en collegialiteit als mijn schema weer eens aangepast moest worden of ik andere dingen moest doen en jullie moesten inspringen. Ik hoop het met een feestje wat goed te maken. De (plaatsvervangend) opleiders die ik tijdens mijn opleiding tot klinische geneticus heb mogen meemaken. Jan, Irene, Ton, Conny en Maran, bedankt voor jullie bereidheid om elke keer weer mee te werken zodat ik mijn onderzoek en opleiding optimaal kon combineren. Jan, dank voor de leuke (mentor)gesprekken en je wijze raad. De papadag is pas echt Geniaal! Mijn collega klinisch genetici wil ik bedanken voor jullie interesse in de voortgang van mijn onderzoek en voor het mij enigszins ontzien dit laatste jaar. In jullie rol als mijn supervisor de afgelopen jaren bedankt voor jullie begrip als er af en toen een andere prioriteit door de patiëntenzorg heen sijpelde. Irene van Langen, jou wil ik vooral ook bedanken voor de ruimte die ik kreeg om dit proefschrift af te ronden en voor je steun voor mijn verdieping in de dermatogenetica. Peter van Tintelen, dank dat je af en toe klankbord wilt zijn. 309

31 Beste dames en heren van de orkestbak, beste Genehoppers! Met jullie musiceren is echt een hobby geworden. Of we nou spelen in een roezelblouse of rode spijkerbroek, in een klein bruin cafeetje of in Carré-achtige zalen met resonantiefrequenties rond de 392Hz, I wish spelen of The DNA song, compleet zijn of een kater hebben, het is altijd feest. Door jullie heb ik een heerlijk muzikaal promotietraject achter de rug. Echt top dat jullie op mijn feest willen spelen, dat kan alvast niet meer stuk! Lieve (schoon)familie en vrienden. Dank voor jullie continue belangstelling in wat ik doe, en dat al vele jaren lang. Mirjam, ik ben zo blij dat je erbij bent vandaag! Ruud, dank voor je kritische vragen over de dingen die ik doe, dat houdt me scherp. Lieve broers en zussen en nichtjes. Ondanks dat jullie stuk voor stuk ver weg wonen en we elkaar veel te weinig zien, zijn jullie altijd geïnteresseerd in wat ik doe. Dat doet me erg goed. En Nien, ik zou geen dermatologie gaan doen. Lieve mama en papa, de reden dat ik dit proefschrift heb kunnen schrijven is alleen dankzij de mogelijkheden die ik altijd van jullie heb gekregen om me te ontwikkelen op de manier die ik voor ogen had. Dank daarvoor! Pap, ik heb ooit uit de grond van mijn hart gezegd dat ik niets maar dan ook niets met dermatologie te maken wilde hebben. Wat een saai vak was dat! Dat had overigens niks met jou te maken. Dat ik via een omweg toch in de dermatologie ben beland, mag dan ook oprecht een wonder genoemd worden. Ook dit heeft overigens niets met jou te maken. Ondanks je voorkeur voor niet-erfelijke dermatosen ben ik toch erg dankbaar dat je altijd zo geïnteresseerd bent in wat ik doe op onderzoeksgebied. Ik hoop dat we dat artikel nog een keer samen kunnen schrijven. Mam, werkelijk enorm bedankt voor het schilderij dat de cover van dit proefschrift siert. Ik ben er zo blij mee, je had me geen groter cadeau kunnen geven. Lieve, lieve Willemijn, jij zorgt altijd voor de welkome afleiding, of die nou broodnodig is of eigenlijk juist even niet. Als jij me achter de computer vandaan komt plukken of op mijn schoot op de computer een liedje singe wilt, is dat alleen maar heerlijk. Jij maakt me blij. Met jou leuke dingen doen en de wereld ontdekken is pas echt genieten. Ik heb zin in alle ontdekkingen die we samen nog gaan doen! Lieve Inge. Jouw rol in dit proefschrift is niet in een paar woorden of zinnen weer te geven. Nee, als ik dat ga beschrijven wordt dit proefschrift tweemaal zo dik. Al vele jaren ben je er elke dag voor mij en tijdens het schrijven van dit proefschrift was dat niet anders. Weer een project dat we samen hebben afgerond! Met je relativeringsvermogen ( het is maar een proefschrift ) had ik wel eens moeite, maar ik weet dat je volkomen gelijk hebt. Het leven is veel te kort en te onvoorspelbaar en genieten van jou en ons gezinnetje is verreweg het belangrijkste. Als ik zeg 310

32 Dankwoord/Acknowledgements dank dat je er elke dag bent en me overal bij helpt, weet ik dat dat jouw bijdrage bij lange na niet weergeeft. Ik weet echter geen betere manier om het te zeggen. Ik hou van je! 311

33

34 List of authors and affiliations List of publications Curriculum vitae

35 List of authors and affiliations Peter C. van den Akker University of Groningen, University Medical Center Groningen, Departments of Genetics and Dermatology, Groningen, the Netherlands Johann W. Bauer EB-Haus Austria, Department of Dermatology, Paracelsus Private Medical University Salzburg, Salzburg, Austria Leena Bruckner-Tuderman Department of Dermatology, University Medical Centre Freiburg, Freiburg, Germany Daniele Castiglia Istituto Dermopatico dell Immacolata, Rome, Italy Patricia J.C. Dopping-Hepenstal The Robin Eady National Diagnostic Epidermolysis Bullosa Laboratory, GSTS Pathology, St John s Institute of Dermatology, St Thomas Hospital, London, UK Anthonie J. van Essen University of Groningen, University Medical Center Groningen, Department of Genetics, Groningen, the Netherlands Cristina Has Department of Dermatology, University Medical Centre Freiburg, Freiburg, Germany Wendy Hettema Department of Human Genetics, Radboud University Nijmegen Medical Centre, Nijmegen, the Netherlands Robert M.W. Hofstra University of Groningen, University Medical Center Groningen, Department of Genetics, Groningen, the Netherlands, and Department of Clinical Genetics, Erasmus Medical Center, Rotterdam, the Netherlands Marcel F. Jonkman University of Groningen, University Medical Center Groningen, Department of Dermatology, Groningen, the Netherlands 314

36 List of authors and affiliations Alfred Klausegger EB-Haus Austria, Department of Dermatology, Paracelsus Private Medical University Salzburg, Salzburg, Austria Marian M.J. Kraak University of Groningen, University Medical Center Groningen, Department of Genetics, Groningen, the Netherlands Lu Liu The Robin Eady National Diagnostic Epidermolysis Bullosa Laboratory, GSTS Pathology, St John s Institute of Dermatology, St Thomas Hospital, London, UK Anna E. Martinez Department of Dermatology, Great Ormond Street Hospital NHS Trust, London, UK John A. McGrath St John s Institute of Dermatology, King s College London (Guy s Campus) and Guy s and St Thomas NHS Foundation Trust, London, UK Gonnie Meijer University of Groningen, University Medical Center Groningen, Department of Dermatology, Groningen, the Netherlands Rowdy Meijer Department of Human Genetics, Radboud University Nijmegen Medical Centre, Nijmegen, the Netherlands Jemima E. Mellerio St John s Institute of Dermatology, Guy s and St Thomas NHS Foundation Trust, London, UK, and Department of Dermatology, Great Ormond Street Hospital NHS Trust, London, UK Miranda Nijenhuis University of Groningen, University Medical Center Groningen, Department of Dermatology, Groningen, the Netherlands 315

37 Hendri H. Pas University of Groningen, University Medical Center Groningen, Department of Dermatology, Groningen, the Netherlands Anna M. G. Pasmooij University of Groningen, University Medical Center Groningen, Department of Dermatology, Groningen, the Netherlands Hans Scheffer Department of Human Genetics, Radboud University Nijmegen Medical Centre, Nijmegen, the Netherlands Morris A. Swertz University of Groningen, University Medical Center Groningen, Department of Genetics, Groningen, the Netherlands, and University of Groningen, University Medical Center Groningen, Genomics Coordination Center, Groningen, the Netherlands, and Netherlands Bioinformatics Centre, Nijmegen, the Netherlands Robert Wagner (Trebor Rengaw) University of Groningen, University Medical Center Groningen, Department of Genetics, Groningen, the Netherlands, and University of Groningen, University Medical Center Groningen, Genomics Coordination Center, Groningen, the Netherlands, and Netherlands Bioinformatics Centre, Nijmegen, the Netherlands Giovanna Zambruno Istituto Dermopatico dell Immacolata, Rome, Italy 316

38 List of publications List of publications Van der Velde KJ, Dhekne HS, Swertz MA, Sirigu S, Ropars V, Vinke P, Wagner R, Van den Akker PC, Rings EHHM, Houdusse A, Van IJzendoorn SCD. An overview and online registry of microvillus inclusion disease patients and their MYO5B mutations. Human Mutation E-pub ahead of print. doi /humu Van den Akker PC, Nijenhuis M, Meijer G, Hofstra RMW, Jonkman MF, Pasmooij AMG. Natural gene therapy in dystrophic epidermolysis bullosa. Archives of Dermatology 2012;148(2): Howard H, Macrae F, Beaudet A, Gil-da-Silva-Lopes V, Van den Akker PC, Wertheim-Tysarowska K, Willems P, Lyne M, Suthers G. Meeting report - Disease Specific Databases: why do we need them? A Satellite of the ESHG 28th May American Journal of Medical Genetics Part A 2012;158A(11): Van den Akker PC, Jonkman MF, Rengaw T, Bruckner-Tuderman L, Has C, Bauer JW, Klausegger A, Zambruno G, Castiglia D, Mellerio JE, McGrath JA, Van Essen AJ, Hofstra RMW, Swertz MA. The International Dystrophic Epidermolysis Bullosa Patient Registry: an online database of dystrophic epidermolysis bullosa patients and their COL7A1 mutations. Human Mutation 2011;32(10): URL: Van den Akker PC, Mellerio JE, Martinez AE, Liu L, Meijer R, Dopping-Hepenstal PJC, Van Essen AJ, Scheffer H, Hofstra RMW, McGrath JA, Jonkman MF. The inversa type of recessive dystrophic epidermolysis bullosa is caused by specific arginine and glycine substitutions in type VII collagen. Journal of Medical Genetics 2011;48(3): Kerstjens-Frederikse WS, Du Marchie Sarvaas GJ, Ruiter JS, Van den Akker PC, Temmerman AM, Van Melle JP, Hofstra RMW, Berger RMF. Left Ventricular Outflow Tract Obstructions: Should cardiac screening be offered to first degree relatives? Heart 2011;97(15): Brown SJ, Asai Y, Cordell HJ, Campbell LE, Zhao Y, Liao H, Northstone K, Henderson J, Alizadehfar R, Ben-Shoshan M, Morgan K, Roberts G, Masthoff LJ, Pasmans SG, Van den Akker PC, Wijmenga C, Hourihane JO, Palmer CN, Lack G, Clarke A, Hull PR, Irvine AD, McLean WH. Loss-of-function variants in the filaggrin gene are a significant risk factor for peanut allergy. J Allergy Clin Immunol 2011;127(3): Friedrich K, Lee L, Leistritz DF, Nürnberg G, Saha B, Hisama FM, Eyman DK, Lessel D, Nürnberg P, Li C, Garcia-F-Villalta MJ, Kets CM, Schmidtke J, Cruz VT, Van den Akker PC, Boak J, Peter D, Compoginis G, Cefle K, Ozturk S, López N, Wessel T, Poot M, Ippel PF, Groff-Kellermann B, 317

39 Hoehn H, Martin GM, Kubisch C, Oshima J. WRN mutations in Werner syndrome patients: genomic rearrangements, unusual intronic mutations and ethnic-specific alterations. Human Genetics 2010;128(1): Tanaka A, Lai-Cheong JE, Van den Akker PC, Nagy N, Millington G, Diercks GFH, Van Voorst Vader PC, Clements SE, Almaani N, Techanukul T, Hide M, South AP, McGrath JA. The molecular skin pathology of familial primary localised cutaneous amyloidosis. Experimental Dermatology 2010;19(5): Van den Akker PC, Van Essen AJ, Kraak MMJ, Meijer R, Nijenhuis M, Meijer G, Hofstra RMW, Pas HH, Scheffer H, Jonkman MF. Long-term follow-up of patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa in the Netherlands: expansion of the mutation database and unusual phenotypegenotype correlations. Journal of Dermatological Science 2009;56(1):9-18. Van den Akker PC, Meijer R, Hettema W, Jonkman MF, Hofstra RMW, Scheffer H. Design and validation of a Conformation-Sensitive Capillary Electrophoresis system for mutation identification of the COL7A1 gene with automated peak comparison. Genetic Testing and Molecular Biomarkers 2009;13(5): Van Silfhout AT, Van den Akker PC, Dijkhuizen T, Verheij JBGM, Olderode M, Sikkema-Raddatz B, Van Ravenswaaij-Arts CMA. Split hand/foot malformation due to chromosome 7q aberrations (SHFM1): additional support for functional haploinsufficiency as the causative mechanism. European Journal of Human Genetics 2009;17(11): Van den Akker PC, Van de Graaf R, Dooijes D, Van Essen AJ. Somatic Mosaicism for the SALL1 Mutation p.ser371x in full-blown Townes-Brocks Syndrome with Duane Anomaly. American Journal of Medical Genetics Part A 2009;149A: Stoutenbeek BM, Van den Akker PC, Jonkman MF. Pretibial dystrophic epidermolysis bullosa akin to bullous lichen planus. Nederlands Tijdschrift voor Dermatologie en Venereologie 2008;18(9): Van den Akker PC. Inherited Epidermolysis Bullosa. In: Sijmons RH ed. Familial Cancer Database - online: Groningen, Navarro CL, Esteves-Vieira V, Courrier S, Boyer A, Nguyen TD, Huong LTT, Meinke P, Schröder W, Cormier-Daire V, Sznajer Y, Amor D, Lagerstedt K, Biervliet M, Van den Akker PC, Cau P, Roll 318

40 Curriculum Vitae P, Lévy N, Badens C, Wehnert M, De Sandre-Giovannoli A. Novel ZMPSTE24 (FACE1) mutations in patients affected with Restrictive Dermopathy or related progeroid syndromes and mutation update. European Journal of Human Genetics. Accepted. White SJ, Bolling MC, Spijker GT, Van den Berg MP, Van den Akker PC, Hislop RG, McLean WHI, Jonkman MF. Chromosomal microdeletion explains extracutaneous features observed in a patient with the monogenic genodermatosis Kindler syndrome. Journal of Investigative Dermatology. Accepted. Van den Akker PC, Scheffer H, Meijer R, Pasmooij AMG, Jonkman MF. Somatic mosaicism for the COL7A1 mutation p.gly2034arg in the unaffected mother of a patient with dystrophic epidermolysis bullosa pruriginosa. Submitted. Van den Akker PC, Pasmooij AMG, Joenje H, Hofstra RMW, te Meerman GJ, Jonkman MF. A late-but-fitter revertant cell explains the high frequency of revertant mosaicism in epidermolysis bullosa. Submitted. Van den Akker PC, Meijer R, Nijenhuis AM, Meijer G, Scheffer H, Jonkman MF. The genotypephenotype correlation in dominant dystrophic epidermolysis bullosa. Submitted. Kiritsi D, Garcia M, Brander R, Has C, Meijer R, Escámez MJ, Kohlhase J, Van den Akker PC, Scheffer H, Jonkman MF, Del Rio M, Bruckner-Tuderman L, Pasmooij AMG. Mechanisms of natural gene therapy in dystrophic epidermolysis bullosa. Submitted. 319

41

42 Curriculum Vitae Curriculum Vitae Peter Christiaan van den Akker werd geboren op 6 juli 1979 in Rotterdam. De eerste twee jaar van de middelbare school volgde hij aan de scholengemeenschap Johannes Calvijn in Rotterdam, waarna hij in 1997 zijn diploma behaalde aan het Willem Lodewijk Gymnasium te Groningen. Hij behaalde in 1998 zijn propaedeuse (Technische) Natuurkunde aan de Rijksuniversiteit Groningen, alvorens hij met zijn studie Geneeskunde aan dezelfde universiteit begon. Zijn wetenschappelijke stage liep hij bij de afdeling Genetica van het Universitair Medisch Centrum Groningen onder begeleiding van drs. Roel Hordijk en dr. Yvonne Vos naar de genotypefenotype correlatie bij Rett syndroom. Vervolgens deed hij zijn coschappen in het Scheper Ziekenhuis in Emmen. Voor zijn keuze-coschap ging hij terug naar de afdeling Genetica van het Universitair Medisch Centrum Groningen en hij behaalde in 2004 zijn artsenbul. Hierna begon hij als arts-assistent niet in opleiding (toen nog AGNIO) bij dezelfde afdeling om per oktober 2006 met zijn opleiding tot klinisch geneticus te beginnen (toenmalig opleider dr. Jan Oosterwijk). Tijdens de multidisciplinaire spreekuren van de afdelingen Klinische Genetica (dr. Ton van Essen) en Dermatologie (prof. dr. Marcel Jonkman) werd zijn interesse in erfelijke huidziekten al snel gewekt en het duurde niet lang voor hij met zijn eerste onderzoeksproject naar dystrofische epidermolysis bullosa begon. Nadat hij vervolgens een AGIKO stipendium van ZonMW had ontvangen, kon het promotietraject in 2009 echt ingezet worden onder begeleiding van prof. dr. Marcel Jonkman en prof. dr. Robert Hofstra. Dit proefschrift is het resultaat van dit promotieonderzoek waarin nauw werd samengewerkt tussen de afdelingen Genetica en Dermatologie van het Universitair Medisch Centrum Groningen. In 2012 rondde hij zijn klinische opleiding af (opleider prof. dr. Irene van Langen) en sindsdien is hij werkzaam als klinisch geneticus aan de afdeling Genetica van het Universitair Medisch Centrum Groningen. Peter is getrouwd met Inge van den Akker-Scheek. Samen hebben zij een prachtige dochter Willemijn en hun tweede kindje is op komst. 321

43 Dystrophic epidermolysis bullosa (DEB) is a heritable skin disorder in which blisters of the skin and mucosae occur after minor trauma. DEB is caused by mutations in the COL7A1 gene. The general aim of this thesis was to expand the understanding of the pathogenesis of DEB. Part one of this thesis describes our genotype-phenotype correlation studies. One of our findings is that specific arginine and glycine substitutions underlie the rare inversa type of recessive DEB. The best phenotypepredictor is the amount of type VII collagen in the skin. This can often be predicted accurately by the genotype, but not always. We have therefore created the International DEB Patient Registry ( in which all genotype-phenotype correlation data are collected. Part two of this thesis studies the role of somatic mosaicism in DEB. We report the first person with forward mosaicism for a COL7A1 mutation and a patient with a healthy skin patch due to revertant mosaicism. Using a mathematical model, we subsequently demonstrate that this natural gene therapy phenomenon should be expected in all patients with recessive DEB. Our findings expand our insights into the pathogenesis of DEB, consequently improve phenotype-prediction and genetic counseling, and indicate that revertant mosaicism may be present in all DEB patients, which is important in the light of future revertant cell-therapy. Download this thesis at password: pvda username: p.vandenakker