1 De bloedstolling 1.1 Verschillende factoren zijn nodig bij bloedstolling. bloedstolling of coagulatie fibrineklonter stollingsfactoren

Transcriptie

1 1 De bloedstolling 1.1 Verschillende factoren zijn nodig bij bloedstolling. Na beschadiging van een bloedvat treedt een complexe reeks van reacties op die erop gericht is de oorspronkelijke toestand te herstellen en bescherming te bieden tegen eventuele infecties. Hierbij is bloedstolling of coagulatie een van de snelste antwoorden. Bloedstolling gebeurt enerzijds door vasthechting van thrombocyten ter hoogte van de beschadiging en het vormen van een fibrineklonter. Dit laatste is het gevolg van recrutering en activering van stollingsfactoren (tabel 4.1). Een aantal van deze zijn eiwitten die in het bloed circuleren (ze behoren tot de eiwitten uit het bloedplasma of bevinden zich op de bloedplaatjes). Deze zullen een rol spelen in de intrinsieke stollingsweg. Andere stollingsfactoren zijn eiwitten die niet circuleren en, in lage hoeveelheden, ergens lokaal op cellen in de bloedvatwand aanwezig zijn. Deze behoren tot het extrinsieke systeem. Ook Ca 2+ -ionen en fosfolipiden spelen een rol in de bloedstolling. De twee systemen convergeren tot een gemeenschappelijke stollingsweg. Factoren II, VII, IX, X, XI en XII zijn inactieve pro-proteasen die tijdens de stolling zullen omgezet worden tot actieve proteasen in een soort waterval van opeenvolgende activaties. Factoren III, V, VI, VIII, Ca 2+ en fosfolipiden helpen mee, of versnellen, verschillende stappen van deze cascade. Het extrinsieke systeem start eerst maar wordt dan overgenomen en geamplificeerd door het intrinsieke systeem. Het doel van deze stolling is het vormen van een fibrineklonter die het bloeden stelpt. Het stollingsproces moet nadien beëindigd worden en de gevormde fibrineklonter verwijderd. Uiteraard mag het stollingsproces niet spontaan gebeuren, mag het enkel lokaal gebeuren en moet het efficiënt zijn. Table 4.1: de stollingsfactoren Factor naam stollingsfactor Functie I Fibrinogeen gemeenschappelijk vormt bloedklonter II Prothrombine gemeenschappelijk zet factor I om tot fibrine III Weefselthromboplastine extrinsiek activeert VII IV Ca 2+ V Proaccelerin gemeenschappelijk stimuleert omzetting factor II VI Acceleratorglobulin stimuleert omzetting factor II VII Proconvertin extrinsiek activeert factor X 1

2 VIII Antihemofilie factor A entrinsiek activeert X IX Christmas factor 52 entrinsiek activeert X X Stuart factor gemeenschappelijk activeert II XI Plasma thromboplastin antecedant 53 intrinsiek activeert IX XII Hageman intrinsiek activeert XI XIII Transglutaminase gemeenschappelijk verbindt fibrine moleculen Prekallikreïne intrinsiek activeert XII Kininogeen intrinsiek activeert XII Veel van deze stollingsfactoren zijn dus proteasen met zeer hoge specificiteit. Ze hydrolyseren dus enkel zeer specifieke peptidebindingen in een heel beperkte keuze aan substraten. Door deze hydrolyse wordt het substraat geactiveerd. Indien het substraat een inactief proprotease is ontstaat hieruit een nieuw actief protease (analoog als activatie van trypsine). De concentraties van deze factoren in het bloed (tabel 4.2) is zo gereguleerd dat er een versterkende kettingreactie ontstaat. Immers, de initiële enzymatische factoren zijn in geringe hoeveelheid aanwezig zijn, maar eenzelfde enzymmolecule kan meerdere katalyserondes uitvoeren op zijn substraten, indien die in hogere concentraties aanwezig zijn. Dus per molecule initiële factor worden meerdere proprotease-moleculen naar de actieve vorm geconverteerd. Deze gaan op hun beurt, via meerdere katalyserondes, hun substraten activeren (die in nog hogere concentratie aanwezig zijn). Table 4.2: de concentratie van enkele bloedstollingsfactoren. Protease of substraat concentratie in bloed Factor VIII 0.05 µg/ml Factor VII 0,47 µg/ml Factor IX 4 µg/ml Factor X 6,4 µg/ml Prothhrombine µg/ml Fibrinogeen 3 mg/ml 52 Ook Plasma-Thromboplastin-Component, of antihemofilie factor B. 53 Ook antihemofilie factor C. 2

3 1.2 De extrensieke stollingsweg en vorming van een bloedklonter. Na verwonding wordt ter hoogte van de beschadigde bloedvatwand (het endotheel) collageen van de subendothele matrix beschikbaar. Hierop gaan zich bloedplaatjes vasthechten en deze zorgen voor initiële stelping van het bloed. Daarnaast wordt, als onderdeel van het extrinsiek systeem, weefselthromboplastin vrijgesteld (factor III). Dit activeert samen met Caionen de inactieve vorm van Factor VII tot zijn proteolytisch actieve vorm (VIIa, met a wordt hier, en in hetgeen volgt, de geactiveerde vorm bedoeld) (Figuur 4.1). Dit zet op zijn beurt, samen met de factor III, Ca 2+ en fosfolipiden, de inactieve vorm van factor X om tot zijn actieve vorm (Xa). Dit is de start van de gemeenschappelijke stollingsweg. Factor Xa converteert, met Ca 2+ en fosfolipiden, prothrombine (II) tot thrombine en dit zet op zijn beurt fibrinogeen (I) om tot fibrine, maar ook factor XIII tot XIIIa. Daarnaast activeert thrombine ook de helperfactoren VIII en V Factor VIIIa bevindt zich in complex met factor IXa, Ca 2+ en fosfolipiden en factor Va met XA, Ca 2+ en fosfolipiden. Ze versnellen respectievelijk de omzetting van X naar Xa en van prothrombine naar thrombine 54. Vermits thrombine en factor Xa ook factor VII omzetten tot een actieve vorm krijgt men een zelfversterkend systeem. Fibrinogeen is een heterohexameer plasmaglycoproreïne opgebouwd uit twee trimeren met elk een,, polypeptideketen, waarbij de eerste twee als inactieve precursoren: A en B, gevormd worden en waarbij thrombine het A en B peptide afsplitst en een configuratie vormt. Door het verwijderen van de A en B-peptiden kunnen dergelijk individuele fibrinemoleculen 55 zich naast elkaar schikken (zie legende Figuur 4.2). Dit polymeer wordt sterker gemaakt via enzymatische reacties, waarbij naburige fibrinemoleculen covalent aan elkaar gekoppeld worden door de geactiveerde factor XIIIa (Fig 4.2). Namelijk een lysinezijketen van een keten zal gekoppeld worden op een glutaminezijketen van een polypeptideketen in een naburig hexameer (en vice versa). Dit geeft aanleiding tot een aaneenschakeling tot grote fibrine-ketens die covalent met elkaar verbonden zijn en dit vormt uiteindelijk de fibrineklonter De intrinsieke stollingsweg versterkt bloedklontervorming In het bloed circuleert een complex van kininogeen, factor XI en prekallikreïne. Door contact met een abnormaal oppervlak (met name dit gevormd bij verwonding) activeert dit 54 De activering van Xa wordt maal versneld, deze van thrombine maal. 55 In de literatuur wordt dit als het fibrinemonomeer beschouwd alhoewel het uit zes individuele polypeptideketens bestaat. Net zoals bij hemoglobine is hier de multimere vorm permanent (zie en ) en enkel deze is functioneel. 3

4 complex factor XII en vervolgens factor XI. Factor XIa activeert op een Ca 2+ afhankelijke manier factor IX tot IXa dat op zijn beurt factor X activeert dat deel is van de gemeenschappelijke bloedstollingsweg (zie hoger). Op verschillende niveau s is er communicatie tussen de extrinsieke en intrinsieke bloedstollingsweg. Zo activeert factor XIIA ook factor VII en factor VIIa katalyseert de omzetting van IX tot IXa. 4

5 XII Verwonding HMW-kininogeen Prekallikrein XI Thrombin Factor Xa Factor XIIa XIIa XI Ca 2+ XIa Ca 2+ VIIa PL + weefselfactor VII Ca 2+ IX IXa X Ca 2+ VIIIa PL Ca 2+ Xa Va PL X Prothrombin Thrombin Fibrinogen Fibrin XIII XIIIa Fibrin XL Figuur 4.1: protease activering tijdens de bloedstolling. Linksboven is de intrinsieke bloedstollingsweg weergegeven, rechtsboven de extrinsieke, en onderaan de gemeenschappelijke. De meeste eiwitten in dit systeem zijn proteasen. In normale situaties bestaan ze als inactieve precursoren. Bij verwonding komt er een waterval van reacties op gang waarbij een eerste protease een tweede als substraat heeft. Na proteolytische splitsing wordt dit tweede protease actief dat een volgende substraat, opnieuw een inactief protease, activeert, enz. De verschillende factoren worden met Romeinse cijfers aangeduid, a duidt op 5

6 de geactiveerde vorm. Soms zijn bijkomende factoren nodig zoals Ca 2+ -ionen en fosfolipiden (PL), factoren VIIIa en Va. Factor XIII is een transglutaminase dat in zijn geactiveerde vorm, lysine met glutamine residuen in verschillende fibrine moleculen verbindt (zie figuur 4.2). Hierdoor onstaat een netwerk van covalent verbonden fibrine moleculen (XL). Thrombine, Factor Xa en XIIa doen secundaire activatie (grijze gestippelde pijl) van de weefselfactor (= factor III) K406 Q398 A B Q398 K406 B A A B thrombine K406 Q398 Q398 K406 XIIIa Figuur 4.2: opbouw van fibrine en vorming van de fibrineklonter. De fibrinemolecule bestaat uit drie paren van drie verschillende polypeptiden. De -ketens van naburige fibrinemoleculen worden covalent aan elkaar gebonden via een transaminatie door de geactiveerde factor XIII (XIIIa) reactie tusssen Lys 406 en Gln 398, hierdoor ontstaat een lineaire keten. Door electrostatische complementariteit gaan de fibrinemoleculen zich ook naast elkaar schikken. Deze electrostatische complementariteit komt er pas na het verwijderen van de A en B peptiden door thrombine. 6

7 1.4 Bloedstolling blijft lokaal door de domeinorganisatie van de factoren De meeste eiwitfactoren in de bloedstolling hebben een modulaire opbouw. Naast een katalytische eenheid bevatten ze regulatorische modules (bvb. Kringle domeinen, of groeifactorverwante domeinen) en een lokalisatiedomein of Gla-domein. Dit is het N-terminale gedeelte van sommige bloedstollingsfactoren (Figuur 4.3) en bevat 9 tot 12 glutaminezuurresidues die bijkomend post-translationeel (zie ) gemodificeerd zijn. Ze dragen op het -koolstofatoom een extra carboxylaatgroep. Hierdoor worden de Gla-domeinen Ca 2+ -chelatoren. De bloedplaatjes die zich vasthechten op de subendotheliale componenten veranderen van vorm en recruteren dan via de fosfolipiden in hun membraan (en in aanwezigheid van Ca 2+ ) de Gladomeinen van de factoren. Dit heeft als voordeel dat de activeringsreactie gelokaliseerd wordt op de membraan van de geactiveerde bloedplaatjes (dus enkel waar bloedstolling nodig is) en dat het substraat (bvb. proprotease Factor X) in de nabijheid van het activerend protease (bvb. Factor IXa) wordt gebracht (verhoging van lokale concentratie). Een peptidesequentie voorafgaand aan het katalytisch domein is het eigenlijke substraat voor het activerend protease. Vermits, met uitzondering van thrombine, de Gla-domeinen van de factoren via een zwavelbrug verbonden zijn met het katalytisch domein diffundeert dit laatste niet weg (m.a.w. de activatie blijft lokaal). Thrombine heeft geen zwavelbrug tussen het Gla- en het katalytisch domein. Het geactiveerde thrombine kan dus in de onmiddellijke omgeving wegdiffunderen en fibrine vormen. O O O O N H HN O -carboxylglutaminezuur 7

8 Factor XII II I Factor XI R 1 R 2 R 3 R 4 Prekallikreine R 1 R 2 R 3 R 4 S S Factor VII AP S S Factor IX AP S S Factor X AP S S Thrombine AP katalytisch domein II type II lusstructuur groeifactor domein kringle domein Gla-domein I R AP type I lusstructuur repeterende structuur activeringspeptide Figuur 4.3: domein structuur van sommige bloedstollingsfactoren. Het katalytisch domein heeft hier telkens protease-activiteit, de overige domeinen zijn regulatorische domeinen of localisatie gebieden (bvb. Gla). In sommige gevallen is het Gla-domein verbonden met het katalytisch domein via een disulfidebrug. Het activeringspeptide (AP) bevindt zich N-terminaal van het katalytisch domein en wordt telkens specifiek herkend door een welbepaalde stollingsfactor. Door de hydrolyse van de peptidebinding tussen AP en het katalytisch domein wordt dit laatste omgezet tot zijn actieve vorm. 8

9 4.1.5 Negatieve feedback 56 regulatie van het stollingsproces. Het spreekt vanzelf dat het losgelaten actieve trombine niet overal mag actief zijn en wanneer voldoende stolling heeft plaatsgegrepen dat het ook uitgeschakeld moet worden. Ter hoogte van de niet beschadigde endotheelwand vormt thrombine een complex met thrombomoduline een transmembraan eiwit (zie 2.6.2) van endotheelcellen. Hierdoor wordt thrombine geinactiveerd, m.a.w. fibrinogeen wordt dan niet meer omgezet tot fibrine. Het thrombomoduline-thrombine complex is een activator van een ander proprotease, het C-eiwit. De geactiveerde vorm breekt de versterkingsfactoren Va en VIIIa af. De bloedstollingsremmende werking van het C-eiwit wordt geholpen door het S-eiwit. Daarnaast zal in het bloed antithrombine, een specifieke inhibitor, thrombine binden. De binding wordt versterkt door heparine, een lineir polysaccharide van N-acetylglucosamine en glucuronzuur. Intermezzo: ziekten geassocieerd met bloedstolling De posttranslationele modificatie tot -carboxylglutaminezuur gebeurt via een complex van eiwitten in het membraan met als substraten: een glutaminezuurzijketen (in het eiwit), koolstofdioxide en zuurstofgas, coenzymen zijn NADH en vitamine K. Bij vitamine-k tekort (wat zelden voorkomt) kunnen er zich storingen in de bloedstolling voordoen en patiënten vertonen lichte inwendige bloedingen. Er bestaan ook overerfbare stollingsziektes (ongeveer 1/ personen). Een mutatie in de genen die coderen voor factor VIII (ongeveer 85%) of IX leiden tot minder of niet actieve varianten van deze factoren, waardoor bloedingen langer aanhouden. De ersnt van de ziekte hangt af van de graad van functionaliteit van het geproduceerde eiwit. Beide genen bevinden zich op het X-chromosoom en de ziektes, respectievelijk hemofilie A en B, zijn geslachtsgebonden. Heterozygote vrouwen hebben minimaal 50% functioneel eiwit en vertonen meestal geen symptomen. Indien bij mannen het mutant gen volledig defectief is of ontbreekt is hun capaciteit tot bloedstolling sterk verminderd. Muaties in factor C (of S) die leiden tot inactiviteit of die leiden tot een verstoorde intearctie met factor Va leiden tot overstolbaarheid Afbraak van de bloedklonter, fibrinolyse Fibrineklonters moeten na bloedvatheling terug verwijderd worden. Dit gebeurt door plasmine. Opnieuw wordt dit aangemaakt als een inactieve precursorvorm: plasminogeen. De 56 Voor definitie van negatieve feedback zie

10 activatie gebeurt door de tissue plasminogen activator (TPA) 57. Een eiwit dat enkel op fibrine bindt (en niet op fibrinogeen) en daardoor actief wordt. Dus hier gelden dezelfde principes, versterking van signalen en enkel lokale activiteit. Plasmine degradeert fibrine tot fibrine degradatieproducten. Plasmine zelf wordt negatief beïnvloed door inhibitoren, of vernietigd door afbraak. Met dank aan Prof. Dr. C. Ampe, vakgroep Biochemie 57 Ook een ander protease: urokinase upa activeert plasminogeen. 10

11 ADHESION to endothelium vwf GP Ib/IX collagen GP IV GP Ia PKC P47 epinephrine R DAG ADP R thrombin R PIP 2 PLC PAF R thromboxane R IP 3 P47-PO 4 AGGREGATION Thromboxane A 2 TS PGG 2, PGH 2 CO Arachidonate PLA2 Phospholipid platelet fibrinogen GP IIb/IIIa SECRETION vwf Ca ++ VIIIa IXa MLCK MLC MLC-PO 4 Va Ca ++ Xa Ca ++ X IIa II COAGULATION

12 Stolling: 2 e kan geneeskunde: Figuren Extrinsieke stollingsroute: rood Intrinsieke stollingsroute: blauw Gemeenschappelijk route: zwart

13 Vorming van de fibrineklonter

14 Cross-linking tussen fibrine monomeren

15 Inhibitie extrinsieke route door TF pathway inhibitor (TFPI) = anticonvertine

16 Fibrinolyse Structuur Gla proteinen

17 Gla peptiden worden verwijderd via de lever. Deze peptiden stimuleren de novo synthese van eiwitten die gla-gemodificeerd moeten worden.